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¿Por qué se agrega la ADN polimerasa al final de la reacción de PCR?

¿Por qué se agrega la ADN polimerasa al final de la reacción de PCR?


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La reacción de PCR se utiliza para amplificar el fragmento de ADN. Cada reacción requiere una plantilla de ADN, tampón, mezcla de dNTP y un par único de cebadores, un cebador "directo" y un cebador "inverso". La ADN polimerasa debe agregarse en último lugar a la reacción, justo antes de comenzar el programa de PCR.

Mi pregunta es, ¿por qué se agrega la ADN polimerasa justo antes de que comience la PCR? ¿Es porque puede comenzar a amplificar el ADN antes de agregar la reacción al termociclador? ¿Cómo podría amplificar el ADN cuando el ADN no se desnaturaliza hasta que se agrega al termociclador?


Es cierto que la plantilla es de doble hebra, pero los cebadores podrían comenzar a amplificarse a sí mismos y a cualquier otro ADN perdido. No desea ninguna amplificación inespecífica en las primeras etapas que pueda competir con el fragmento objetivo. Además, aunque Taq La polimerasa es una enzima muy resistente, es una práctica estándar tratar las enzimas con especial cuidado, en hielo para que no se degraden (aunque las he olvidado en el banco durante la noche y sobrevivieron a eso).


¿Por qué se agregan nucleótidos al extremo 3 & # 39?

El ADN solo se copia en la dirección 5 'a 3' porque los cromosomas eucariotas tienen muchos orígenes para cada cromosoma de acuerdo con su tamaño mucho mayor. Si algunos se copiaron en la otra dirección, se producirán errores. Mantiene cada división celular en la misma página, por así decirlo.

Debido a que la síntesis de ADN solo puede ocurrir en la dirección 5 'a 3', se usa una segunda molécula de ADN polimerasa para unirse a la otra hebra molde cuando se abre la doble hélice. Esta molécula sintetiza segmentos discontinuos de polinucleótidos, llamados fragmentos de Okazaki. Otra enzima, llamada ADN ligasa, es responsable de unir estos fragmentos en lo que se llama hebra rezagada.

El mecanismo de la ADN ligasa es formar dos enlaces fosfodiéster covalentes entre los extremos hidroxilo 3 'de un nucleótido ("aceptor") con el extremo fosfato 5' de otro ("donante"). Los dos "extremos pegajosos" tienen que estar en direcciones opuestas para que se complete la replicación de toda la molécula de ADN.

El cromosoma humano promedio contiene una enorme cantidad de pares de nucleótidos que se copian a aproximadamente 50 pares de bases por segundo. Sin embargo, todo el proceso de replicación toma solo alrededor de una hora. Esto se debe a que hay muchos sitios de origen de replicación en un cromosoma eucariota. Por lo tanto, la replicación puede comenzar en algunos orígenes antes que en otros. A medida que la replicación se acerca a su finalización, las "burbujas" de ADN recién replicado se encuentran y se fusionan, formando dos nuevas moléculas.


¿Por qué la PCR no solo usa helicasa y ADN polimerasa en lugar de usar calor y TAQ polimerasa para clonar cadenas de ADN?

La tecnología no es lo suficientemente madura como para ser una alternativa viable a la PCR para uso general en el laboratorio, pero tiene sus ventajas, una de las cuales es que no necesita un termociclador, pero existen termocicladores pequeños y portátiles para trabajos a pequeña escala.

¿Cuál es el beneficio de HDA? Nunca he investigado el costo de un termociclador, pero me imagino que resultaría más barato que tener que agregar una helicasa a cada corrida si está haciendo más de unas pocas.

Nunca he oído hablar de esto. ¿Se incuba a 55 ° C o algo así?

Puede hacer PCR de esta manera, pero no tengo idea de por qué lo haría. La PCR es fácil y tiene una tasa de éxito muy alta, a diferencia de casi todas las demás reacciones enzimáticas del kit de herramientas de biología molecular. Los reactivos para este tipo de PCR también son MUCHO más costosos que los reactivos para una PCR tradicional, asumiendo que su laboratorio ya tiene un termociclador (lo que la mayoría lo hace por razones más allá de la simple ejecución de PCR).

Las enzimas pueden ser muy delicadas. Como regla general, cuantas más enzimas tenga que usar en una reacción, es más probable que la reacción falle solo porque hay pasos más delicados y más oportunidades para que algo salga mal.

Las diferentes enzimas también tienden a tener su máximo rendimiento en diferentes condiciones (diferentes temperaturas, salinidades, pH, etc.). Por lo general, las reacciones que requieren múltiples pasos enzimáticos separarán las reacciones en diferentes tubos (primera reacción en un tubo, luego transfiera parte del producto a un tubo diferente con un tampón diferente para la siguiente reacción, y así sucesivamente). En una PCR, la helicasa y la polimerasa deberían funcionar simultáneamente, por lo que esto no se puede hacer. Cuando ejecutamos una reacción con dos enzimas en el mismo tubo, tenemos que optimizar las condiciones para que ambas enzimas tengan el mejor rendimiento posible. Sin embargo, normalmente ambos se desempeñarán por debajo del 100% de eficacia, lo que reduce el rendimiento de la reacción en general. Incluso si la helicasa y la polimerasa provienen originalmente de la misma especie y, teóricamente, deberían funcionar en las mismas condiciones, el proceso de hacer que las enzimas sean comercialmente útiles puede terminar cambiando sus propiedades.


Procedimiento de PCR

Inicialización

Este paso es necesario solo para las ADN polimerasas que requieren PCR de inicio en caliente. La reacción se calienta entre 94 y 96 ° C y se mantiene durante 1-9 minutos.

Desnaturalización

Si el procedimiento no requiere inicialización, la desnaturalización es el primer paso. La reacción se calienta a 94-98 ° C durante 20-30 segundos. Los enlaces de hidrógeno de la plantilla de ADN se rompen y se crean moléculas de ADN monocatenarias.

Recocido

La temperatura de reacción es más baja entre 50 y 65 ° C y se mantiene durante 20-40 segundos. Los cebadores se hibridan con la plantilla de ADN monocatenario. La temperatura es extremadamente importante durante este paso. Si hace demasiado calor, es posible que la imprimación no se pegue. Si hace demasiado frío, es posible que la imprimación se adhiera de manera imperfecta. Se forma un buen enlace cuando la secuencia del cebador coincide estrechamente con la secuencia de la plantilla.

Extensión / alargamiento

La temperatura durante este paso varía según el tipo de polimerasa. La ADN polimerasa sintetiza una cadena de ADN completamente nueva.

Alargamiento final

Este paso se realiza a 70-74 ° C durante 5-15 minutos después del ciclo de PCR final.

Retención final

Este paso es opcional. La temperatura se mantiene a 4-15 ° C y detiene la reacción.


Tanto el ADN como el ARN constan de nucleótidos que contienen un azúcar, una base y un grupo fosfato. Sin embargo, hay algunas diferencias. En primer lugar, el ADN está compuesto por una doble hebra que forma una hélice, mientras que el ARN solo está compuesto por una hebra. Además, el azúcar en el ADN es desoxirribosa, mientras que en el ARN es ribosa. Finalmente, tanto el ADN como el ARN tienen las bases adenina, guanina y citosina. Sin embargo, el ADN también contiene timina que es reemplazada por uracilo en el ARN.

La transcripción de ADN es la formación de una cadena de ARN que es complementaria a la cadena de ADN. La primera etapa de la transcripción es el desenrollamiento de la doble hélice del ADN. Luego, los nucleótidos de ARN libres comienzan a formar una cadena de ARN utilizando una de las cadenas de ADN como plantilla. Esto se hace mediante el apareamiento de bases complementarias, sin embargo, en la cadena de ARN, la base timina es reemplazada por uracilo. La ARN polimerasa es la enzima involucrada en la formación de la hebra de ARN y el desenrollamiento de la doble hélice. Luego, la cadena de ARN se alarga y luego se separa de la plantilla de ADN. Las hebras de ADN luego reforman una doble hélice. La hebra de ARN formada se llama ARN mensajero.


Explicación de la biología molecular


Un organismo vivo debe mantenerse continuamente produciendo las sustancias que necesita para funcionar. Las proteínas son una de estas sustancias clave y vienen en una variedad aparentemente infinita de formas y estructuras. Son responsables de prácticamente todo lo que sucede en su cuerpo y células, y se producen cada segundo de la vida de un organismo. Son necesarios para diversas funciones como el crecimiento celular, reparación de tejidos, señalización entre células, respuestas inmunes, movimiento muscular, enzimas para ayudar a llevar a cabo reacciones químicas, hormonas, y también actúan como bloques de construcción para estructuras como cabello, plumas, cáscaras de insectos y colágeno.

La plantilla para hacer proteínas.

A pesar de esta gran variedad, las proteínas se definen principalmente por su secuencia de aminoácidos unidos entre sí en & # 8216 cadenas polipeptídicas & # 8217.

La plantilla que codifica estas proteínas es una molécula llamada ADN - ácido desoxirribonucleico. El dogma central - o más precisamente hipótesis - de la biología molecular establece que la información genética se traduce de ácido nucleico a proteína, y no al revés. Esto significa que el ADN produce ARN y el ARN produce proteínas. Hay excepciones a este proceso, como cuando ciertos virus pueden hacer copias de ADN de su propio genoma de ARN. Pero en la mayoría de los organismos, el ADN se copia en ARN. El proceso por el cual el ADN se copia en ARN se llama transcripción, y el proceso por el cual el ARN se usa para producir proteínas se llama traducción. Esta es la razón por la que el ADN es una parte clave de los procesos vitales de todo organismo.

Ácido desoxirribonucleico (ADN)

En los seres humanos, el núcleo de cada célula contiene 3 mil millones de pares de bases de ADN distribuidos en 23 pares de cromosomas, y cada célula tiene dos copias del material genético. Esto se conoce colectivamente como el genoma humano. El genoma humano contiene alrededor de 30 000 genes, cada uno de los cuales codifica una proteína.

La molécula de ácido nucleico de desoxirribosa consiste en una molécula de azúcar conectada a una de cuatro bases: guanina, citosina, adenina y timina. Una base unida a un azúcar se llama nucleótido. Las moléculas de fosfato unen los azúcares ribosa para formar una cadena, un lado de la doble hélice del ADN.


Las cuatro bases tienen diferentes formas únicas, lo que significa que solo encajarán de maneras específicas, como las piezas de un rompecabezas. Adenine solo se emparejará con Thymine, y Cytosine solo se emparejará con Guanine. Esto significa que las dos cadenas de ADN son complementarias y, efectivamente, son plantillas entre sí.

Transcripción

Para ver cómo se usa el ADN para producir proteínas, debemos introducir su compuesto hermano, el ácido ribonucleico (ARN). El ARN se diferencia del ADN de varias formas. La más importante de estas diferencias es, en primer lugar, que se trata de una sola hebra, en lugar de una doble hebra. Y en segundo lugar, en lugar de Thymine, tiene Uracil como base.

La transcripción es el proceso mediante el cual el ADN se copia (transcribe) en ARN mensajero (ARNm), que transporta la información necesaria para la síntesis de proteínas.

Entonces, cuando se necesita fabricar una determinada proteína, la parte de la doble hélice de ADN que contiene el gen relevante para esa proteína se abre, exponiendo la secuencia de bases de A, C, G o Ts.

Luego, con la ayuda de enzimas, los nucleótidos de ARNm que flotan libremente se unen con sus correspondientes nucleótidos de ADN y se unen en una sola hebra de nucleótidos de ARNm.

Una vez que todo el gen se ha transcrito en una hebra de ARNm, el ARNm se mueve y el ADN se vuelve a cerrar.

Traducción

Ahora que el código genético se ha copiado en ARNm, el código debe traducirse para convertirse en una proteína y, como se mencionó anteriormente, lo único que realmente es una proteína es una secuencia de aminoácidos.

Para hacer esto, el ARNm se introduce en una pequeña "máquina" molecular, llamada Ribosoma, que ayuda a encontrar el aminoácido correcto para cada parte del código del ARNm. Esto se hace por cada tres bases en la secuencia de ARN, llamado codón. Esta secuencia de tres bases da una variedad de combinaciones de códigos diferentes, cada una de las cuales corresponde a un aminoácido en particular. Entonces, a medida que el ribosoma corre a lo largo de la secuencia de ARNm, los aminoácidos correctos se juntan en la secuencia correcta y se unen para convertirse en una proteína específica.

Nuestros experimentos de laboratorio

Muchos de los experimentos que llevamos a cabo en el London BioHackspace son experimentos de tipificación de genes, que esencialmente buscan en nuestro ADN y prueban la presencia de ciertos genes.

Por ejemplo, uno de nuestros proyectos es una prueba para ciertos tipos de sangre. Podemos hacer esto porque su grupo sanguíneo está determinado por una cierta combinación de antígenos en sus glóbulos rojos. Debido a que los antígenos son proteínas, codificadas en su ADN, deberíamos poder saber qué antígenos y qué tipo de sangre es usted, con solo mirar su ADN.

Extracción de ADN

Pero primero tenemos que sacar el ADN. El ADN no solo está encerrado en nuestras células, sino que en el interior de su núcleo, el ADN también está fuertemente envuelto con proteínas. Entonces, primero debemos tomar una colección de nuestras propias células, normalmente frotando ligeramente el interior de nuestras mejillas, y luego abrimos las células recolectadas y extraemos el ADN mediante una serie de procesos químicos, que se describen en la tabla a continuación. :

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Después de descomponer las células y extraer el ADN, ahora necesitamos identificar el gen que estamos buscando. Pero hay un par de problemas. En primer lugar, ahora hemos recopilado todo nuestro genoma de ADN, y no solo el gen que estamos buscando. Y en segundo lugar, es una muestra tan pequeña de ADN que es poco probable que podamos ver nada. Así que necesitamos hacer muchas copias de la sección específica de ADN que estamos buscando, y lo hacemos usando un método llamado Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).

Este es exactamente el mismo proceso que se usa con los forenses, y es la forma en que pueden hacer coincidir el ADN de un sospechoso, a partir de una pequeña muestra de cabello.

Para hacer la PCR, debemos agregar algunos ingredientes al tubo y luego repetir un ciclo específico de calentamiento y enfriamiento para que el ADN se replique. Esto se hace en una máquina llamada termociclador.


El termociclador pasará por muchos ciclos de calentamiento de la solución a diferentes temperaturas. La primera etapa implica calentar a la temperatura más alta, 96 ° C, lo que hará que las hebras dobles de ADN se separen. Luego se enfriará para permitir que comience el proceso de copia del ADN.

Para elegir el gen que queremos copiar, usamos cebadores. Los cebadores son fragmentos cortos de ADN que se fabrican en un laboratorio. Dado que están diseñados a medida, los cebadores pueden tener cualquier secuencia de nucleótidos que desee.

En un experimento de PCR, utilizamos dos cebadores que están diseñados para coincidir con el principio y el final del segmento de ADN que queremos copiar. Y en el caso de nuestro experimento de tipificación sanguínea, usamos cebadores que coinciden con el comienzo del gen que codifica los antígenos sanguíneos.

En la etapa de recocido, a través del emparejamiento de bases complementarias, una imprimación se adhiere a la hebra superior en un extremo de su segmento de interés y la otra imprimación se adhiere a la hebra inferior en el otro extremo.

Luego calentamos la solución para permitir que comience la extensión. Para copiar la secuencia restante de ADN, usamos una enzima llamada ADN polimerasa. La ADN polimerasa es una enzima natural cuya función es copiar el ADN de una célula antes de que se divida en dos. Cuando una molécula de ADN polimerasa choca con un cebador que está emparejado con una base más larga de ADN, se adhiere cerca del final del cebador y comienza a agregar nucleótidos.

La ADN polimerasa humana se descompondría a las temperaturas que utilizamos en nuestro experimento de PCR. Entonces, la ADN polimerasa que se usa con más frecuencia en la PCR proviene de una cepa de bacterias llamada Thermus aquaticus que vive en las aguas termales del Parque Nacional Yellowstone. Puede sobrevivir cerca de las temperaturas de ebullición y funciona bastante bien a 72 ° C.

En nuestro tubo de PCR ya hemos agregado una mezcla de cuatro tipos de nucleótidos que se encuentran en el ADN & # 8211 A & # 8217s, C & # 8217s, G & # 8217s y T & # 8217s. Entonces, en el proceso de extensión, la ADN polimerasa agarra los nucleótidos que flotan en el líquido a su alrededor y los une al final de un cebador, hasta que se ha copiado todo el gen y se llega al final de un ciclo.

Luego, el proceso se repite de nuevo, y las dos hebras dobles de ADN recién formadas se dividen y se replican. Y así sucesivamente & # 8230 Hasta que tengamos una solución altamente concentrada de ADN para nuestro gen de tipo sanguíneo.

Electroforesis en gel

En el tubo, aunque hemos copiado con éxito muchos fragmentos de ADN que son del gen del tipo sanguíneo, quedan muchos otros fragmentos de la reacción de PCR. Así que ahora queremos poder separar todos los diversos fragmentos de ADN en el tubo, de modo que podamos identificar el fragmento del gen de tipificación sanguínea, y lo hacemos por tamaño.

Para hacer esto usamos un proceso llamado Electroforesis en Gel. Hacemos un gel con una sustancia química llamada agarosa, a través del cual las soluciones de ADN pueden moverse, y colocamos nuestras soluciones de ADN del proceso de PCR en algunos pocillos que están sangrados en el gel. El gel también contiene una sustancia química llamada bromuro de etidio, que se une al ADN y actúa como una etiqueta fluorescente, lo que nos permitirá ver el ADN en la siguiente etapa.


El gel se coloca en una solución y se pasa una corriente eléctrica. Debido a que el ADN es una molécula cargada negativamente, a medida que se aplica esta corriente, las hebras de ADN se moverán lentamente hacia el electrodo positivo. Sin embargo, las hebras de ADN se moverán a diferentes velocidades. Las hebras de ADN más cortas (por ejemplo, trozos cortos sobrantes de la reacción de PCR) encuentran más fácil moverse a través del gel y, por lo tanto, se moverán mucho más rápido. Mientras que las hebras más largas de ADN (por ejemplo, secuencias de genes) se moverán más lentamente a través del gel. Entonces, después de ejecutar el gel durante un cierto período de tiempo, las hebras de ADN de diferentes tamaños se separarán y aparecerán en diferentes puntos a lo largo del gel.

/> Pero para que sepamos exactamente la longitud de estas hebras de ADN, necesitamos marcadores de referencia, a los que llamamos escalera. Esta es una solución que contiene una mezcla de fragmentos de ADN de ciertos tamaños (por ejemplo, 300 nucleótidos de longitud, 500, 700, 1000, etc.). Cuando la solución de escalera se coloca en un pozo al lado de uno que contiene nuestra muestra de ADN de PCR, correrá por el gel de la misma manera, con los diferentes trozos de ADN de diferentes tamaños que aparecen en diferentes posiciones del gel. Entonces, si nuestra muestra de ADN de PCR aparece junto a la banda de escalera que representa 500 pb, sabemos que nuestra muestra contiene ADN de un gen de aproximadamente 500 nucleótidos de longitud. O si aparece a medio camino entre las bandas de 1.500 y 2.000, podemos hacer una estimación de aproximadamente 1.750 nucleótidos de longitud.

Visualización de gel
Una vez que el gel ha funcionado el tiempo suficiente, apagamos la corriente y luego colocamos el gel bajo luz ultravioleta. El marcador fluorescente proporcionado por el bromuro de etidio que colocamos al principio, significa que el ADN brillará con bastante claridad bajo los rayos UV.


Como puede ver, algunas bandas claras de ADN aparecen aproximadamente alrededor de la marca de 347 pares de bases, que es la longitud de la secuencia de ADN que estamos buscando involucrada en la determinación del grupo sanguíneo. Una vez que tenemos esta sección, agregamos la enzima de restricción Alu1, que corta la secuencia si es un alelo del grupo sanguíneo B, pero no si es & # 8217s A u O.


Los organismos tienen secuencias cortas de bases que se repiten muchas veces. Estos se denominan ADN satélite. Estas secuencias repetidas varían en longitud de persona a persona. El ADN se copia mediante PCR y luego se corta en pequeños fragmentos utilizando enzimas de restricción. La electroforesis en gel separa las piezas fragmentadas de ADN según su tamaño y carga. Esto da un patrón de bandas en un gel que es poco probable que sea el mismo para dos personas. Esto se llama perfil de ADN. El perfil de ADN se puede utilizar para determinar la paternidad y también en investigaciones forenses para obtener pruebas que se utilizarán en un caso judicial, por ejemplo.

Para un sospechoso, busque similitudes entre el ADN encontrado en la escena del crimen y el sospechoso. Para una prueba de paternidad, busque similitudes entre el niño y el posible padre.


Preguntas frecuentes

¿Qué tan precisos son los resultados de la prueba de PCR?

Las tasas varían según la enfermedad y el método de recolección, pero los resultados de la prueba de PCR son muy precisos, según estudios médicos. Les va bien en ambas medidas de precisión:

  • Sensibilidad (la capacidad de identificar incluso pequeñas cantidades de un patógeno)
  • Especificidad (poder distinguir un patógeno de otro)

¿Qué es la prueba de PCR multiplex?

La prueba de PCR múltiple es cuando una prueba busca múltiples agentes infecciosos simultáneamente. Algunos ejemplos son las pruebas de PCR de ETS que buscan hasta nueve patógenos.

¿Qué información se incluye en un panel de PCR STD?

Los resultados que obtenga después de un panel de PCR STD, ya sea de un médico o de un kit de autoevaluación, deben incluir información sobre:

  • Para qué virus, bacterias o parásitos se analizaron
  • Si sus resultados son positivos (tiene una infección) o negativos (no tiene una infección) para cada patógeno

También pueden tener números que representan la gravedad de una infección. Los resultados del kit de prueba en el hogar pueden ofrecer más información sobre qué hacer si dio positivo en alguna prueba.


Métodos y tecnología para el análisis genético

La reacción en cadena de la polimerasa, o PCR, es un método básico utilizado en biología molecular para producir copias de una pequeña región diana de ADN en una muestra. Los conceptos básicos de la PCR se discutieron anteriormente aquí. Las copias de ADN producidas por PCR proporcionan a los investigadores copias suficientes para otras aplicaciones en la investigación, incluida la secuenciación automática de Sanger. Aunque existe una metodología básica para la mayoría de los métodos de PCR, cada reacción es diferente y requiere optimización, un proceso para ajustar las variables y producir un único producto deseado. Hay varios factores a considerar al optimizar la PCR, como las copias totales del ADN diana, la concentración de cebadores, MgCl2 y desoxinucleótidos, o dNTP. Algunas de estas variables dependen del volumen total de la reacción de PCR porque la concentración final de los componentes en la PCR debe ser constante dependiendo de si la reacción es de 25 ul, 50 ul o 100 ul. En este artículo nos centraremos en dos variables, el número de copias del ADN diana y la concentración del cebador.

La plantilla: ADN objetivo

La generación de copias de una región de ADN objetivo mediante aplicaciones de PCR no es tan sensible a la calidad del ADN de la plantilla en comparación con la secuenciación de Sanger. Sin embargo, sigue siendo recomendable utilizar una muestra de ADN relativamente pura libre de sales y otros contaminantes. El ADN de plantilla limpio tiene una mayor probabilidad de generar un producto de PCR limpio. La muestra final diluida de ADN diana se diluye mejor en agua que en tampón porque los tampones pueden interferir con amplificaciones de PCR difíciles.

El aspecto más importante del ADN diana a considerar es el número total de copias en la reacción disponibles para amplificación. El ADN diana proporciona la plantilla inicial para la amplificación del primer conjunto de productos amplificados y continúa proporcionando la plantilla para los ciclos restantes. A medida que se generan los productos de PCR, también proporcionan copias del ADN diana que se utiliza como molde para la amplificación. Esto es lo que permite a la PCR generar millones de copias de una región objetivo. Por lo tanto, es importante que en la reacción estén presentes suficientes copias del ADN diana original. Demasiadas copias del objetivo original pueden dar lugar a la generación de productos falsos al principio de la PCR que también actúan como plantilla de ADN. El ADN molde aislado de bacterias puede constar de solo un genoma de 2 millones de bases, mientras que el genoma humano tiene 3 mil millones de bases. Por lo tanto, el ADN genómico bacteriano tendrá muchas más copias del objetivo en una muestra de 50 ng que el ADN humano. Para el ADN bacteriano, las copias de 10E5 requerirán solo 300 picogramos de ADN. Para el ADN humano, 10E5 requerirá más de 300 nanogramos de ADN, una diferencia de un millón de veces.

Las condiciones de PCR generalmente recomiendan 10E4 a 10E5 copias del ADN diana en la reacción independientemente del volumen total. Existe cierta flexibilidad en el número de copias de la secuencia objetivo. Sin embargo, más copias del ADN diana reducirán la especificidad de la reacción de PCR y probablemente producirán una mayor cantidad de productos falsos. El número total de ciclos para PCR debe reducirse cuando hay concentraciones más altas de ADN diana en la reacción.

Concentración de los cebadores

Los cebadores son el factor determinante de qué región del ADN se amplificará mediante PCR. El cebador de avance y retroceso debe tener una coincidencia de base exacta con el principio y el final de la región objetivo. La concentración excesiva de cebadores es quizás un factor importante que a menudo provoca la generación de productos falsos en una PCR. Demasiado cebador reduce la especificidad y esto permitirá que los cebadores aparezcan en regiones de la plantilla que no son la región objetivo. Los resultados de cebadores excesivos a menudo se ven en resultados de secuenciación de Sanger no limpios porque los productos falsos se pueden secuenciar junto con el objetivo deseado. La cantidad de cebador directo e inverso debe limitarse para reducir el posible cebado falso. Las concentraciones excesivas de cebadores directos e inversos también pueden causar la formación de dímeros de cebadores cuando los cebadores se aparean y se amplifican independientemente del ADN diana.

La concentración del cebador es una variable que depende del volumen total de la reacción de PCR para que suficientes copias del cebador encuentren los sitios de hibridación objetivo. Una concentración total de 0.5 micro-molar (uM) a 1 uM es generalmente suficiente para amplificar la mayoría de las regiones objetivo, aunque una concentración más pequeña también puede funcionar en algunas aplicaciones. Normalmente, nuestro laboratorio utiliza una concentración final de 0,8 uM para la mayoría de las reacciones de PCR. El juicio final sobre la concentración de cebador se verá después de que los productos se sometan a electroforesis en un gel de agarosa para mostrar el número de productos amplificados.

Usamos un cálculo relativamente simple para diluir los cebadores a una concentración final de 10 uM, como se muestra, comenzando con la concentración de cebador primario de 1 microgramos (ug) / micro-litro (ul). Requiere que se conozca el peso molecular (PM) del cebador y debe proporcionarse junto con el cebador.

1 ug / ul * 1umol / MW (ug) * 10E6 ul / l = concentración umol / l que equivale a uM

Un cebador con la concentración final de 200 uM se diluirá agregando 1 ul del cebador a 19 ul de agua para una concentración final de 10 uM. Esta es nuestra concentración de trabajo para PCR. Para una concentración final de 0,8 uM, se añaden 2 ul del cebador directo e inverso a una reacción de 25 ul, mientras que se añadirían 8 ul de cada uno a una reacción de PCR de 100 ul.

La concentración de cebador es una de las variables más importantes a considerar al optimizar una reacción de PCR. Las concentraciones superiores a 1 uM a menudo podrían conducir a que los cebadores se hibridaran a lo largo de regiones no objetivo y a la generación de productos falsos. Las concentraciones insuficientes de cualquiera de los cebadores podrían resultar en poca o ninguna amplificación.


Afiliaciones

Microbiología y fermentación de alimentos, Departamento de Ciencias de los Alimentos, Universidad de Copenhague, 1958, Frederiksberg C, Dinamarca

Łukasz Krych, Josué L. Castro-Mejía, Daniel N. Moesby, Morten B. Mikkelsen y Dennis S. Nielsen

GenXone S.A., 60-476, Poznań, Polonia

Łukasz Krych y el amplificador Maciej Sykulski

Biología Computacional y Ecología Microbiana, Departamento de Ciencias Biológicas, Universidad de los Andes, Bogotá, Colombia

Quimiometría y tecnología analítica, Departamento de Ciencias de los Alimentos, Universidad de Copenhague, 1958, Frederiksberg C, Dinamarca

COPSAC, Estudios prospectivos de Copenhague sobre asma en la infancia, Hospital Herlev y Gentofte, Universidad de Copenhague, Copenhague, Dinamarca


Ver el vídeo: PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa divulgación científica IQOG-CSIC (Julio 2022).


Comentarios:

  1. Al'alim

    Qué palabras ... genial, la hermosa oración

  2. Gugami

    La respuesta segura ;)

  3. Tygolar

    De acuerdo, tu pensamiento es brillante

  4. Duff

    Claramente, la excelente respuesta

  5. Flannagan

    Hmm, puedes crear una pequeña colección

  6. Zolozuru

    De nada.



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