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¿Cuántas generaciones podemos ejecutar un micelio de Pleurotus ostreatus / Pearl Oyster?

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Puedo cultivar micelio con éxito en los posos del café gastado. Y el micelio fructifica con éxito una o dos veces en el mismo sustrato. Estoy clonando tomando micelio del existente (que está fructificando en la actualidad) y lo transfiero al nuevo frasco y lo ejecuto durante 8-10 días y lo uso en una nueva caja para la próxima generación de frutos.

Lo que estoy cultivando es la 4ª generación (me refiero al ciclo de transferencia).

Como soy novato, hice algún tipo de investigación y comencé con un spawns maestro (lo obtuve de los laboratorios de hongos del gobierno). Pero no puedo entender una cosa es. ¿Está bien clonar usando micelio o necesito hacer una clonación de esporas o necesito buscar engendros maestros de vez en cuando o está bien continuar con la enésima generación y seguir comiendo las frutas?

¿Hay algún problema grave con mi clonación?


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Si está buscando semillas de hongos para la venta, ¡ha venido al lugar correcto! Tenemos engendro de ostras, engendro de shiitake, engendro de melena de león y mucho más. Aquí, en Fungi Ally, hacemos nuestro propio engendro de hongos y lo vendemos a la comunidad global. A continuación, tenemos una variedad de información para aquellos que buscan comprar hongos engendrados ahora.

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Tenga en cuenta que toda nuestra semilla se cultiva en un laboratorio estéril y se produce de manera constante durante todo el año, por lo que se le garantiza la semilla más fresca y limpia disponible. Si desea disminuir la posibilidad de contaminación mientras crece en troncos, tótems o astillas de madera, entonces el engendro de aserrín es para usted. Actualmente tenemos semillas de aserrín a la venta, en bolsas de 5 1/2 libras, para todo lo siguiente:

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Si es nuevo en el uso de semilla de grano, intente comenzar con la shiitake LE 46 o la ostra azul 3015. La semilla de hongo ostra azul es una gran opción para los principiantes porque es bastante fácil de cultivar y puede ser abundante. También son hermosos hongos a la vista. La shiitake LE 46 es conocida por la rápida colonización del micelio sobre el sustrato y esta cepa es reconocida por producir rendimientos impresionantes. Shiitake LE 46 es el caballo de batalla para muchos cultivadores comerciales de hongos, así que definitivamente inténtelo, incluso si está cultivando hongos como pasatiempo.

Engendro de hongos en venta - Enchufe engendro

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Introducción

La mayoría de las especies cultivadas de hongos pertenecen al filo Basidiomycota, a pesar de que algunos Ascomycota como miembros de los géneros Morchella o Tubérculo también se han cultivado y explotado comercialmente con éxito (Rubini et al.2014 Liu et al.2017). A diferencia de las plantas, los hongos son organismos heterótrofos que requieren nutrientes externos para crecer, el micelio vegetativo (red de hifas) suministra nutrientes para el crecimiento de basidiomas (etapa reproductiva) (Taylor y Ellison 2010). Los hongos producen una serie de enzimas que incluyen enzimas que degradan la lignina (lacasas, peroxidasas de lignina, peroxidasas de manganeso, arilalcohol oxidasa, aril alcohol deshidrogenasas o quinona reductasas) y hemicelulosa y enzimas que degradan la celulosa (xilanasa, celulasas o celobiosa deshidrogenasa), la degradación de sustratos lignocelulósicos (Sánchez 2009 Kabel et al.2017 Vos et al.2017). Además, los hongos requieren oxígeno y un pH específico para desarrollar un metabolismo normal y crecer adecuadamente. El C y el N son los dos macronutrientes principales requeridos por los hongos para los requisitos estructurales y energéticos P, K y Mg también se consideran macronutrientes para los hongos, además, los oligoelementos como Fe, Se, Zn, Mn, Cu y Mo parecen ser necesarios para diversas funciones (Chang y Miles 2004).

La fase inicial de producción de hongos consiste en un proceso de fermentación sólida. Desde el desove, el micelio vegetativo crece en ambiente controlado y condiciones asépticas para colonizar la masa de sustrato antes de fructificar (Zervakis y Koutrotsios 2017). Existen dos fórmulas principales para la producción de los sustratos empleados en el cultivo de hongos que se han optimizado en función de la especie. Ambos se derivan de subproductos agrícolas como paja de cereales, fibra / cáscara vegetal, estiércol o aserrín:

Materiales compostados obtenidos mediante fermentación y pasteurización (Pardo et al.2017 Kabel et al.2017 Vos et al.2017), diseñados para el cultivo de Agaricus bisporus (Lange) Imbach (AB) o A. subrufescens Peck (Pardo-Giménez et al.2014 Pardo et al.2017), Pleurotus ostreatus (Jacq: patatas fritas) (PO), P. sajor-caju (Fr.) Cantante o P. cistidiosus OK. Molino. (Chang y Miles 2004 Sánchez 2010).

Materiales no compostados que consisten en una mezcla de diferentes subproductos agrícolas como ingredientes principales, seguido de la esterilización con vapor del sustrato antes de la inoculación del micelio. Ciertas especies comerciales se producen empleando este tipo de sustrato, incluyendo Lentinula edodes (Berk.) Pegler (LE), Auricularia sp., Velutipes de flammulina (Curtis) Cantante, Pleurotus eryngii (DC .: P.) Quel., Agrocybe aegerita (V. Brig.) Cantante, Volvariella volvacea (Bull. Ex Fr.) o Hypsizygus marmoreus (Peck) Bigel (Chang y Miles 2004 Estrada et al.2009 Liang et al.2016 Xie et al.2017 Kleofas et al.2014 Yamanaka 2017).

Algunas especies cultivadas, como el hongo botón blanco cultivado a nivel mundial (A. bisporus), requieren una cubierta de revestimiento para cubrir el sustrato colonizado con el fin de inducir la fructificación del hongo (Pardo-Giménez et al.2017a).

La suplementación con hongos se entiende como un método de cultivo basado en la adición física de enmiendas nutricionales al compost, durante el proceso de compostaje, la mezcla de materias primas, en el desove o durante la tripa (Estrada et al.2009 Pardo-Giménez et al.2012a, 2016). La práctica de suplementar nutricionalmente el compost para el cultivo de hongos en el momento del desove o la tripa para maximizar el rendimiento del cultivo surgió en la década de 1960 (Schisler y Sinden 1962 Sinden y Schisler 1962 Lemke 1963) y es ampliamente reconocida y aceptada, sin embargo, su uso puede restringirse en algunos sectores debido a factores técnicos y económicos. Aspectos importantes a considerar incluyen, por un lado, los tipos de nutrientes requeridos y el momento más adecuado para su aplicación sin olvidar, por otro lado, los costos económicos y las ganancias (Randle 1985).

Recientemente, se ha descrito que los hongos y bacterias potenciales promotores del crecimiento de hongos (MGP) estimulan el crecimiento del micelio y promueven la fructificación de los hongos, al tiempo que constituyen reservorios de nitrógeno o vitaminas (Zarenejad et al.2012 Kertesz y Thai 2018). Por lo tanto, el MGP representa una forma adicional de suplemento que podría suministrarse por separado o en combinación con suplementos nutricionales para aumentar el rendimiento de los cultivos.

La presente mini revisión recopila los avances recientes en la suplementación de sustratos empleados en el cultivo de hongos y tiene como objetivo arrojar luz sobre algunos aspectos agronómicos relacionados con este cultivo en expansión (Zhang et al. 2014).


Pasteurización de cenizas de madera

Sigo buscando algo definitivo sobre la pasteurización de cenizas de madera y sigo saliendo en blanco. Muchas menciones de él, pero todo lo que puedo encontrar le da una mención pasajera y luego explica la pasteurización de cal hidratada.

Entonces, ¿alguien lo ha hecho con éxito? ¿Cuál fue tu tek si es así? Tengo ceniza y paja, pero realmente no he encontrado nada que realmente diga cómo poner los dos juntos en qué proporciones.

# 2 coorsmikey

Aquí hay una publicación de Aloha Medicinals. Pase a la página 39 y podrá usar las proporciones para hacer cantidades más pequeñas. Muchas otras cosas interesantes para leer también como la fermentación en frío. cultivo de hongos.pdf 3,69 MB 1950 descargas

Métodos de bajo costo / baja tecnología para cultivar hongos

El cultivo de hongos es tanto una ciencia como una forma de arte, y muchas personas han desarrollado sus propios métodos únicos para cultivar hongos. Algunos de estos métodos son buenos, otros requieren mucha mano de obra, otros métodos producen cuerpos frutales de gran volumen o calidad especial. Durante los muchos años que hemos estado trabajando y consultando en este campo, hemos visto muchos métodos, desde el cultivo en tierra en México y África, hasta el método basado en autoclave de más alta tecnología utilizado por los gigantes de la agroindustria multinacionales. La mayoría de los libros publicados hoy comienzan con la suposición de que tiene mucho dinero para comprar las calderas, ensacadoras y autoclaves más caras. En nuestra experiencia, este no suele ser el caso, especialmente cuando recién está comenzando. Por lo tanto, nos gustaría ofrecerle el beneficio de nuestra experiencia aquí y mostrarle algunos métodos de baja tecnología que funcionan bien y se pueden lograr por un bajo costo.

El objetivo de cualquier cultivador de hongos debe ser: La producción de un gran volumen de hongos a bajo costo, en una cantidad de tiempo razonable sin demasiado desperdicio, contaminación o gasto en equipo nuevo. Otros objetivos deben ser tener un sistema lo suficientemente simple como para capacitar fácilmente a los trabajadores agrícolas comunes para que realicen cada paso del proceso. Dado que la mayoría de los trabajadores agrícolas no son microbiólogos con educación universitaria, es más práctico simplificar el sistema tanto como sea posible para que cualquiera pueda capacitarse para hacer el trabajo, en lugar de depender de la disponibilidad de personal capacitado que ya conozca todos los conceptos involucrados.

Definamos los objetivos un poco más.

Alto rendimiento: todas las cepas comunes de hongos se pueden cultivar con una eficiencia biológica del 100% o más, y de hecho debe ser así para que el proyecto tenga éxito. A menudo, en el cultivo de ostras, se puede lograr un 200% de BE. Incluso con Shiitake, Lions Mane o Maitake, 100% BE es bastante posible de lograr con una mínima atención a su proceso. Entonces, ¿qué es este BE y cómo se mide?

La eficiencia biológica, abreviado BE, es la más importante y la más básica de todas las medidas en el cultivo de hongos. BE es la comparación del sustrato de peso seco con los hongos recién cosechados. En otras palabras, todos compramos nuestro sustrato en forma seca, como el aserrín como ejemplo. Si compra 1000 libras de aserrín de peso seco y puede cosechar 1000 libras de hongos frescos, eso es 100% BE. Si comienza con 1000 libras de paja seca y cosecha 1500 libras de hongos ostra frescos, eso es un BE del 150%. Tenga siempre en cuenta que 100% BE es el rendimiento mínimo aceptable de hongos para que su granja tenga éxito comercial. ¿Cómo podemos comenzar con 1000 libras de sustrato y terminar con 1500 libras de hongos? Tenga en cuenta que los hongos son principalmente agua y esto se agrega al sustrato. Entonces, lo que cosechas es entre un 50% y un 90% de agua. Asegúrese de medir el peso de sus bolsas y medir el peso de sus hongos recolectados, porque sin las cifras de BE para su proceso, es imposible optimizar su producción y predecir con precisión el rendimiento con anticipación.

Ejemplos de cambios en BE serían las comparaciones de dos cepas diferentes de hongos ostra: Ambos son Pleurotus ostreatus, pero tal vez uno provenía de una gran altitud y el otro provenía de un bosque tropical. Estos definitivamente van a funcionar de manera diferente en su granja, y absolutamente y sin lugar a dudas tendrán un BE diferente cuando los cultive uno al lado del otro. Entonces, ¿cómo saber cuál es la mejor cepa para su operación? Solo hay una forma de saberlo, y es realizar pruebas y ver cuál funciona mejor. Una cepa que funciona MUY BIEN para otro cultivador puede funcionar muy bien para ti. Tienes diferentes climas, diferentes métodos de esterilización, diferentes sustratos, diferentes desoves y, lo más importante, tienes diferentes organismos competidores en tu granja. Estas cosas no se pueden tener en cuenta de antemano, solo las pruebas en su granja le darán cifras de BE realistas. Sin embargo, TODOS los hongos comúnmente cultivados le darán AL MENOS 100% DE SER, por lo que si no obtiene eso de su operación, entonces algo está mal.

Surge la pregunta "¿Qué hongo debo cultivar?" La mayoría de las personas que se involucran en este comercio quieren comenzar a cultivar Shiitake. Al igual que la mayoría de los niños que están aprendiendo a conducir, quieren un Ferrari nuevo. Tal vez sea más práctico para ellos aprender a conducir en el viejo Ford familiar y pasar al auto de carreras a medida que aumenta su nivel de habilidad (¡e ingresos!). Lo mismo ocurre con el cultivo de hongos. Es mucho más fácil (¡y más barato!) Comenzar a cultivar hongos ostra y luego pasar a otras especies a medida que aumenta su nivel de habilidad y el equipo disponible. Así que el resto de esta discusión se centrará en la mayor parte de los hongos ostra, aunque los conceptos generales también son válidos para otras especies.

Con base en las enseñanzas de algunos de los libros comunes disponibles hoy en día, muchas personas comienzan a cultivar hongos remojando paja en agua caliente para un paso de pasteurización. Este sistema funciona, aunque es el menos favorito de todos los métodos de pasteurización por muchas razones, todas regresando a los objetivos básicos de “La Producción de Gran Volumen de Hongos a Bajo Costo”. El método del agua caliente es difícil, costoso y con demasiada frecuencia no produce 100% + BE. Preferimos los métodos de pasteurización en frío porque somos perezosos, baratos y no nos gusta luchar con grandes manojos de paja húmeda caliente. Y sí, ¿mencioné que siempre produce un BE más alto?

Métodos de pasteurización en frío:

Es necesario pasteurizar o esterilizar su sustrato antes de inocularlo con semilla. La decisión de pasteurizar versus esterilizar depende tanto de su sustrato como de su especie cultivada. En general, si tiene un sustrato de bajo valor nutritivo como papel, cartón o paja, entonces la pasteurización es suficiente y mucho más barata que la verdadera esterilización. El aserrín varía en valor nutritivo y, a veces, puede funcionar bien con un simple paso de pasteurización y, a veces, debe esterilizarse. Para aquellos que dicen que el shiitake no se puede cultivar con paja pasteurizada, les animo a que miren este breve informe de un productor de San Diego que cultiva shiitake con bastante éxito en paja. Dado que la paja funciona mejor con los hongos ostra, describiré el proceso con la paja:

Para realizar un paso de pasteurización en frío, deberá remojar la pajita en una solución que la hidrate y elimine la mayoría de los organismos unicelulares presentes. Hay varias cosas que puede usar para esto, pero la mejor con mucho es la cal hidratada. La concentración exacta no es crítica, solo un puñado doble grande en un bidón de agua de 55 galones. Luego sumerja la pajita, pásela para que no flote y espere de 12 a 24 horas. Ya no, como no quieres desarrollar un montón de organismos resistentes a la cal, entre 16 y 18 horas es perfecto. Después de remojar, drene el exceso de agua, embolse la pajita e inocúlela con su semilla. Funciona muy bien, el BE típico es de 150% a 175% y la calidad de los cuerpos frutales es mejor que con el método de agua caliente.

Estos son los consejos sobre qué lima usar:

Tipos de cal y uso en el cultivo de hongos

El término "Lime" se usa ampliamente en inglés, y el mismo término a menudo se refiere a diferentes materiales. Entonces, una explicación de los diferentes tipos de cal y su uso está en orden:

1) Cal carbonato de calcio: se trata de piedra caliza, mármol, tiza, cáscara de huevo, coral o concha de ostra. Este material se utiliza como tampón de pH en sustratos y medios. Este tipo de cal no causa un cambio importante en el pH, pero actúa como un amortiguador, es decir, mantiene el pH estable a medida que crecen los hongos. Esta es la enmienda preferida para el sustrato para garantizar que el sustrato no se vuelva demasiado ácido durante el ciclo de crecimiento. ¡ESTE TIPO DE CAL NO FUNCIONA PARA PASTURIZAR!

2) Hidróxido de calcio o cal hidratada, también conocida como cal viva. Esto se usa para aumentar el pH y se usa principalmente para pasteurizar o esterilizar sustratos. Muchos hongos no crecen bien si se agrega este tipo de cal al sustrato, y por lo tanto NO se usa para modificar el sustrato, se usa solo para pasteurización, a través del mecanismo de cambio rápido de pH. Agregar aproximadamente 3 libras de cal hidratada (un puñado doble grande) a un barril de agua producirá un pH alto, alrededor de 12-13, que es suficiente para pasteurizar la paja en aproximadamente 4-6 horas.

La cal hidratada se obtiene quemando piedra caliza (carbonato de calcio) que la convierte en hidróxido de calcio. El material de partida puede ser cualquiera de las fuentes de carbonato de calcio, o la fuente de materia prima puede ser Dolomite Lime, que tiene un alto contenido de magnesio. Cuando la cal hidratada está hecha de dolomita, a menudo se la llama "cal de constructores" y se usa en la industria del concreto. La cal con alto contenido de magnesio o la cal de construcción NO FUNCIONARÁN para el cultivo de hongos. Cuando compre cal hidratada para pasteurizar su sustrato, asegúrese de que sea cal con alto contenido de calcio (90% o más de calcio, generalmente alrededor de 95-96% de calcio).Si la bolsa dice alto contenido de magnesio, o indica un porcentaje de magnesio superior al 10%, no la use. El alto contenido de magnesio frenará el crecimiento de los hongos.

Un tipo correcto de cal para pasteurizar paja


Hay otro material a menudo llamado cal agrícola, cal dolomita o simplemente dolomita. Esto tiene un alto contenido de magnesio y NO FUNCIONARÁ para el cultivo de hongos.

El yeso no es cal, es sulfato de calcio y se utiliza para otros fines. No cambia el pH de manera significativa ni actúa como tampón. Se utiliza para modificar las propiedades físicas del sustrato. También agrega algo de azufre metabólico al sustrato.

El jabón también es un buen agente pasteurizante. ¿Qué tipo de jabón? Casi todos funcionarán, nos gusta el detergente para platos más barato que se vende en la tienda, o un detergente en polvo como Tide, o prácticamente cualquier jabón. Preparar una buena solución de jabón fuerte, remojar de 12 a 24 horas, escurrir el exceso de agua e inocular. Los hongos ostra usan la pajita y el jabón como fuente de alimento, y no quedan residuos de jabón en los hongos, todo se bioconvierte en tejido de hongos.

Otro buen agente pasteurizador son las cenizas de madera. Funciona igual que la cal o el jabón, y los BE son un poco más altos que ambos. Para una presentación en PDF sobre el método de pasteurización de cenizas, haga clic aquí [PDF]

Espero que este pequeño artículo te ayude a comprender algunas de tus opciones. Eche un vistazo a estas fotos de una granja de ostras a continuación que consultamos. Esta finca usa solo pasteurización de cal, constantemente tienen un 150% de BE, tienen cero contaminación y tienen una capacidad de producción de 5000 libras al mes. Todo esto sin calor en absoluto, solo un baño de cal. Barato, efectivo y rentable: cumpliendo todos los objetivos establecidos anteriormente.

Para obtener más información sobre este tema, lea el artículo en http: //www.alohaecow. ture-part1.html

Nos complace ofrecer un servicio de consulta para ayudarlo a poner en marcha su granja o volver a encarrilarla, ya sea por teléfono o en el lugar. Si está interesado en este servicio, llámenos al (775) 886-6300 o envíe un correo electrónico a [email & # 160protected]

Granja de paja pasteurizada con cal:

Mire la cepa de ostras en miniatura de Elmalini desarrollada a través de un método único, ¡un hongo muy comercializable! Esta es la cepa Olmo A de Pleurotus ulmarius.

Editado por coorsmikey, 08 de febrero de 2018 - 21:42.

# 3 Ferather

Puede que tenga que cambiar a ceniza sobre cal, gracias por ese enlace coorsmikey.

# 4 scott_1971_h

Gracias de mi parte también mikey, estoy leyendo.

# 5 Misterbill

Aquí hay una publicación de Aloha Medicinals. Pase a la página 39 y podrá usar las proporciones para hacer cantidades más pequeñas. Muchas otras cosas interesantes para leer también como la fermentación en frío. cultivo de hongos.pdf

crecimiento de baja tecnología

He visto este, pero también promociona el uso de cal hidratada además de la ceniza. Me preguntaba si se puede hacer solo con ceniza. Esa página que mencionaste dice 1.25 kg de cal hidratada 4.24 kg de ceniza de madera tamizada, así que aún no estoy seguro de si se puede hacer o si se usa solo ceniza.

# 6 coorsmikey

Editado por coorsmikey, 08 de febrero de 2018 - 21:30 h.

# 7 Misterbill

Aquí hay una publicación de Aloha Medicinals. Pase a la página 39 y podrá usar las proporciones para hacer cantidades más pequeñas. Muchas otras cosas interesantes para leer también como la fermentación en frío. cultivo de hongos.pdf

crecimiento de baja tecnología

Métodos de bajo costo / baja tecnología para cultivar hongos

El cultivo de hongos es tanto una ciencia como una forma de arte, y muchas personas han desarrollado sus propios métodos únicos para cultivar hongos. Algunos de estos métodos son buenos, otros requieren mucha mano de obra, otros métodos producen cuerpos frutales de gran volumen o calidad especial. Durante los muchos años que hemos estado trabajando y consultando en este campo, hemos visto muchos métodos, desde el cultivo en tierra en México y África, hasta el método basado en autoclave de más alta tecnología utilizado por los gigantes de la agroindustria multinacionales. La mayoría de los libros publicados hoy comienzan con la suposición de que tiene mucho dinero para comprar las calderas, ensacadoras y autoclaves más caras. En nuestra experiencia, este no suele ser el caso, especialmente cuando recién está comenzando. Por lo tanto, nos gustaría ofrecerle el beneficio de nuestra experiencia aquí y mostrarle algunos métodos de baja tecnología que funcionan bien y se pueden lograr por un bajo costo.

El objetivo de cualquier cultivador de hongos debe ser: La producción de un gran volumen de hongos a bajo costo, en una cantidad de tiempo razonable sin demasiado desperdicio, contaminación o gasto en equipo nuevo. Otros objetivos deben ser tener un sistema lo suficientemente simple como para capacitar fácilmente a los trabajadores agrícolas comunes para que realicen cada paso del proceso. Dado que la mayoría de los trabajadores agrícolas no son microbiólogos con educación universitaria, es más práctico simplificar el sistema tanto como sea posible para que cualquiera pueda capacitarse para hacer el trabajo, en lugar de depender de la disponibilidad de personal capacitado que ya conozca todos los conceptos involucrados.

Definamos los objetivos un poco más.

Alto rendimiento: todas las cepas comunes de hongos se pueden cultivar con una eficiencia biológica del 100% o más, y de hecho debe ser así para que el proyecto tenga éxito. A menudo, en el cultivo de ostras, se puede lograr un 200% de BE. Incluso con Shiitake, Lions Mane o Maitake, 100% BE es bastante posible de lograr con una mínima atención a su proceso. Entonces, ¿qué es este BE y cómo se mide?

La eficiencia biológica, abreviado BE, es la más importante y la más básica de todas las medidas en el cultivo de hongos. BE es la comparación del sustrato de peso seco con los hongos recién cosechados. En otras palabras, todos compramos nuestro sustrato en forma seca, como el aserrín como ejemplo. Si compra 1000 libras de aserrín de peso seco y puede cosechar 1000 libras de hongos frescos, eso es 100% BE. Si comienza con 1000 libras de paja seca y cosecha 1500 libras de hongos ostra frescos, eso es un BE del 150%. Tenga siempre en cuenta que 100% BE es el rendimiento mínimo aceptable de hongos para que su granja tenga éxito comercial. ¿Cómo podemos comenzar con 1000 libras de sustrato y terminar con 1500 libras de hongos? Tenga en cuenta que los hongos son principalmente agua y esto se agrega al sustrato. Entonces, lo que cosechas es entre un 50% y un 90% de agua. Asegúrese de medir el peso de sus bolsas y medir el peso de sus hongos recolectados, porque sin las cifras de BE para su proceso, es imposible optimizar su producción y predecir con precisión el rendimiento con anticipación.

Ejemplos de cambios en BE serían las comparaciones de dos cepas diferentes de hongos ostra: Ambos son Pleurotus ostreatus, pero tal vez uno provenía de una gran altitud y el otro provenía de un bosque tropical. Estos definitivamente van a funcionar de manera diferente en su granja, y absolutamente y sin lugar a dudas tendrán un BE diferente cuando los cultive uno al lado del otro. Entonces, ¿cómo saber cuál es la mejor cepa para su operación? Solo hay una forma de saberlo, y es realizar pruebas y ver cuál funciona mejor. Una cepa que funciona MUY BIEN para otro cultivador puede funcionar muy bien para ti. Tienes diferentes climas, diferentes métodos de esterilización, diferentes sustratos, diferentes desoves y, lo más importante, tienes diferentes organismos competidores en tu granja. Estas cosas no se pueden tener en cuenta de antemano, solo las pruebas en su granja le darán cifras de BE realistas. Sin embargo, TODOS los hongos comúnmente cultivados le darán AL MENOS 100% DE SER, por lo que si no obtiene eso de su operación, entonces algo está mal.

Surge la pregunta "¿Qué hongo debo cultivar?" La mayoría de las personas que se involucran en este comercio quieren comenzar a cultivar Shiitake. Al igual que la mayoría de los niños que están aprendiendo a conducir, quieren un Ferrari nuevo. Tal vez sea más práctico para ellos aprender a conducir en el viejo Ford familiar y pasar al auto de carreras a medida que aumenta su nivel de habilidad (¡e ingresos!). Lo mismo ocurre con el cultivo de hongos. Es mucho más fácil (¡y más barato!) Comenzar a cultivar hongos ostra y luego pasar a otras especies a medida que aumenta su nivel de habilidad y el equipo disponible. Así que el resto de esta discusión se centrará en la mayor parte de los hongos ostra, aunque los conceptos generales también son válidos para otras especies.

Con base en las enseñanzas de algunos de los libros comunes disponibles hoy en día, muchas personas comienzan a cultivar hongos remojando paja en agua caliente para un paso de pasteurización. Este sistema funciona, aunque es el menos favorito de todos los métodos de pasteurización por muchas razones, todas regresando a los objetivos básicos de “La Producción de Gran Volumen de Hongos a Bajo Costo”. El método del agua caliente es difícil, costoso y con demasiada frecuencia no produce 100% + BE. Preferimos los métodos de pasteurización en frío porque somos perezosos, baratos y no nos gusta luchar con grandes manojos de paja húmeda caliente. Y sí, ¿mencioné que siempre produce un BE más alto?

Métodos de pasteurización en frío:

Es necesario pasteurizar o esterilizar su sustrato antes de inocularlo con semilla. La decisión de pasteurizar versus esterilizar depende tanto de su sustrato como de su especie cultivada. En general, si tiene un sustrato de bajo valor nutritivo como papel, cartón o paja, entonces la pasteurización es suficiente y mucho más barata que la verdadera esterilización. El aserrín varía en valor nutritivo y, a veces, puede funcionar bien con un simple paso de pasteurización y, a veces, debe esterilizarse. Para aquellos que dicen que el shiitake no se puede cultivar con paja pasteurizada, les animo a que miren este breve informe de un productor de San Diego que cultiva shiitake con bastante éxito en paja. Dado que la paja funciona mejor con los hongos ostra, describiré el proceso con la paja:

Para realizar un paso de pasteurización en frío, deberá remojar la pajita en una solución que la hidrate y elimine la mayoría de los organismos unicelulares presentes. Hay varias cosas que puede usar para esto, pero la mejor con mucho es la cal hidratada. La concentración exacta no es crítica, solo un puñado doble grande en un bidón de agua de 55 galones. Luego sumerja la pajita, pásela para que no flote y espere de 12 a 24 horas. Ya no, como no quieres desarrollar un montón de organismos resistentes a la cal, entre 16 y 18 horas es perfecto. Después de remojar, drene el exceso de agua, embolse la pajita e inocúlela con su semilla. Funciona muy bien, el BE típico es de 150% a 175% y la calidad de los cuerpos frutales es mejor que con el método de agua caliente.

Estos son los consejos sobre qué lima usar:

Tipos de cal y uso en el cultivo de hongos

El término "Lime" se usa ampliamente en inglés, y el mismo término a menudo se refiere a diferentes materiales. Entonces, una explicación de los diferentes tipos de cal y su uso está en orden:

1) Cal carbonato de calcio: se trata de piedra caliza, mármol, tiza, cáscara de huevo, coral o concha de ostra. Este material se utiliza como tampón de pH en sustratos y medios. Este tipo de cal no causa un cambio importante en el pH, pero actúa como un amortiguador, es decir, mantiene el pH estable a medida que crecen los hongos. Esta es la enmienda preferida para el sustrato para garantizar que el sustrato no se vuelva demasiado ácido durante el ciclo de crecimiento. ¡ESTE TIPO DE CAL NO FUNCIONA PARA PASTURIZAR!

2) Hidróxido de calcio o cal hidratada, también conocida como cal viva. Esto se usa para aumentar el pH y se usa principalmente para pasteurizar o esterilizar sustratos. Muchos hongos no crecen bien si se agrega este tipo de cal al sustrato, y por lo tanto NO se usa para modificar el sustrato, se usa solo para pasteurización, a través del mecanismo de cambio rápido de pH. Agregar aproximadamente 3 libras de cal hidratada (un puñado doble grande) a un barril de agua producirá un pH alto, alrededor de 12-13, que es suficiente para pasteurizar la paja en aproximadamente 4-6 horas.

La cal hidratada se obtiene quemando piedra caliza (carbonato de calcio) que la convierte en hidróxido de calcio. El material de partida puede ser cualquiera de las fuentes de carbonato de calcio, o la fuente de materia prima puede ser Dolomite Lime, que tiene un alto contenido de magnesio. Cuando la cal hidratada está hecha de dolomita, a menudo se la llama "cal de constructores" y se usa en la industria del concreto. La cal con alto contenido de magnesio o la cal de construcción NO FUNCIONARÁN para el cultivo de hongos. Cuando compre cal hidratada para pasteurizar su sustrato, asegúrese de que sea cal con alto contenido de calcio (90% o más de calcio, generalmente alrededor de 95-96% de calcio). Si la bolsa dice alto contenido de magnesio, o indica un porcentaje de magnesio superior al 10%, no la use. El alto contenido de magnesio frenará el crecimiento de los hongos.

Un tipo correcto de cal para pasteurizar paja


Hay otro material a menudo llamado cal agrícola, cal dolomita o simplemente dolomita. Esto tiene un alto contenido de magnesio y NO FUNCIONARÁ para el cultivo de hongos.

El yeso no es cal, es sulfato de calcio y se utiliza para otros fines. No cambia el pH de manera significativa ni actúa como tampón. Se utiliza para modificar las propiedades físicas del sustrato. También agrega algo de azufre metabólico al sustrato.

El jabón también es un buen agente pasteurizante. ¿Qué tipo de jabón? Casi todos funcionarán, nos gusta el detergente para platos más barato que se vende en la tienda, o un detergente en polvo como Tide, o prácticamente cualquier jabón. Preparar una buena solución de jabón fuerte, remojar de 12 a 24 horas, escurrir el exceso de agua e inocular. Los hongos ostra usan la pajita y el jabón como fuente de alimento, y no quedan residuos de jabón en los hongos, todo se bioconvierte en tejido de hongos.

Otro buen agente pasteurizador son las cenizas de madera. Funciona igual que la cal o el jabón, y los BE son un poco más altos que ambos. Para una presentación en PDF sobre el método de pasteurización de cenizas, haga clic aquí [PDF]

Espero que este pequeño artículo te ayude a comprender algunas de tus opciones. Eche un vistazo a estas fotos de una granja de ostras a continuación que consultamos. Esta finca usa solo pasteurización de cal, constantemente tienen un 150% de BE, tienen cero contaminación y tienen una capacidad de producción de 5000 libras al mes. Todo esto sin calor en absoluto, solo un baño de cal. Barato, efectivo y rentable: cumpliendo todos los objetivos establecidos anteriormente.

Para obtener más información sobre este tema, lea el artículo en http: //www.alohaecow. ture-part1.html

Nos complace ofrecer un servicio de consulta para ayudarlo a poner en marcha su granja o volver a encarrilarla, ya sea por teléfono o en el lugar. Si está interesado en este servicio, llámenos al (775) 886-6300 o envíe un correo electrónico a [email protected] m.

Granja de paja pasteurizada con cal:

Mire la cepa de ostras en miniatura de Elmalini desarrollada a través de un método único, ¡un hongo muy comercializable! Esta es la cepa Olmo A de Pleurotus ulmarius.

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Una vez más, se menciona la ceniza y luego se explica la cal, o se describe la ceniza con cal. Lo que estoy buscando (si existe) es solo ceniza. Quizás nadie lo ha intentado o lo ha intentado y no funciona, pero no he visto pruebas de ninguno de los dos casos.


Cultivo de Pleurotus ostreatus y otros hongos comestibles

Pleurotus ostreatus es el segundo hongo comestible más cultivado en todo el mundo después Agaricus bisporus. Tiene valores económicos y ecológicos y propiedades medicinales. El cultivo de hongos se ha diversificado con la producción de otros hongos. Los hongos comestibles pueden colonizar y degradar una gran variedad de sustratos lignocelulósicos y otros desechos que se producen principalmente a través de las actividades de las industrias agrícola, forestal y de procesamiento de alimentos. Particularmente, P. ostreatus requiere un tiempo de crecimiento más corto en comparación con otros hongos comestibles. El sustrato utilizado para su cultivo no requiere esterilización, solo pasteurización, que es menos costosa. El cultivo de hongos ostra convierte un alto porcentaje del sustrato en cuerpos fructíferos, aumentando la rentabilidad. P. ostreatus exige pocos controles ambientales, y sus cuerpos fructíferos no suelen ser atacados por enfermedades y plagas, y se pueden cultivar de forma sencilla y económica. Todo esto hace P. ostreatus El cultivo es una excelente alternativa para la producción de hongos en comparación con otros hongos.

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Jean-Claude Sigoillot,. Eva Uzan-Boukhris, en Avances en la investigación botánica, 2012

2 Aril-alcohol oxidasa

Una AAO se detectó por primera vez en Polystictus versicolor por Farmer et al. (1960). Se identificaron, purificaron y caracterizaron actividades similares en tres Pleuroto especieP. sajor-caju: Bourbonnais y Paice, 1988 P. eryngii: Guillén et al., 1990 y P. ostreatus: Sannia et al., 1991) y en B. adusta (Muheim et al., 1990). Estas enzimas son bastante diferentes de las AAO que se encuentran en Fusarium solani (Iwahara et al., 1980 ), P. chrysosporium (Asada et al., 1995) y en el hongo no lignolítico Penicillium simplicissimum (de Jong et al., 1992 ).

Las AAO son producidas por un pequeño número de especies de hongos, y su papel fisiológico hasta ahora apenas se ha estudiado en comparación con las otras oxidorreductasas de hongos. La AAO de P. chrysosporium se produce en medios ricos en nitrógeno durante el metabolismo primario. Esta enzima es también la única AAO indicada como inducible por aril-alcoholes como el alcohol vanilílico. La producción máxima de AAO por P. chrysosporium se obtiene al final del crecimiento cuando la glucosa se vuelve limitante (Asada et al., 1995 ). Pleuroto Las AAO son las AAO más estudiadas. La mejor producción de un AAO natural (2500 U / L) se obtuvo durante el cultivo de P. pulmonarius en un medio que contiene glucosa y peptonas (Varela et al., 2000a). Una AAO de P. eryngii fue clonado y expresado en A. nidulans. Esta expresión heteróloga permitió la producción de 400 a 500 U / L, aproximadamente 10 veces más que la producción de AAO por P. eryngii cultivado en óptimas condiciones (Varela et al., 2001 ).

Las AAO son flavoproteínas que contienen un grupo FAD por molécula de enzima.Catalizan la oxidación de aril-γ-alcoholes α- y β-insaturados a sus correspondientes aldehídos, con la reducción concomitante de O2 a H2O2 (Muheim et al., 1990). Son glicoproteínas con masas moleculares que oscilan entre 70 y 80 kDa. Se identificaron dos isoenzimas de AAO en P. sajor-caju sobre la base de una diferencia en pI, que fue confirmada por el análisis N-terminal de estas proteínas. La secuencia N-terminal de P. ostreatus y P. eryngii están muy conservadas y contienen secuencias consenso Gly-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly, características de las proteínas de unión a dinucleótidos (Wierenga et al., 1985 ).

Después de la clonación del gen que codifica la AAO de P. eryngii y la cristalización de la proteína, se determinó la estructura tridimensional de esta enzima. Este AAO aparentemente está organizado en 15 hélices y dos dominios de hoja β. Esta enzima también puede estabilizarse mediante un puente disulfuro entre las cisteínas 248 y 263 (Varela et al., 2000b). La cristalización del P. pulmonarius AAO dio más información. La región N-terminal de esta enzima presenta un motivo β-α-β que contiene tres residuos de glicina implicados en la unión no covalente de FAD (residuos 25-60). La glicina 530 y la prolina 537 pueden estar involucradas en el sitio activo. Sin embargo, la resolución de 2,8 Å no proporcionó información más detallada sobre la estructura (Varela et al., 2000a). FAD actúa como un centro redox en la transferencia de dos átomos de hidrógeno y dos electrones de aril-alcoholes a dioxígeno. Su característica absorbancia a 465 nm es útil para seguir la proteína durante los pasos de purificación (Varela et al., 2000a). Los estudios de las capacidades catalíticas de las AAO mostraron que todas tienen una amplia especificidad por varios fenoles sustituidos con metoxi (Bourbonnais y Paice, 1988 Guillen et al., 1990 Sannia et al., 1991 ).

Las funciones fisiológicas de esta enzima se han asociado con la actividad lignolítica de la pudrición blanca y se han relacionado con su capacidad para generar peróxido de hidrógeno durante su semirreacción reductora. El peróxido de hidrógeno producido por la podredumbre blanca podría participar en la degradación de la lignina, como cosustrato de peroxidasas y / o en reacciones no enzimáticas como las reacciones de Fenton (Ander y Marzullo, 1997). Guillén y Evans (1994) sugirieron que la AAO dependiente de NADPH podría constituir un sistema redox en el que los aril-alcoholes y aril-aldehídos producidos por el hongo aseguraban una concentración estable de H2O2 para la actividad lignolítica.

Marzullo et al. (1995) informaron que la oxidasa de alcohol veratrílico (o AAO) de P. ostreatus fue capaz de reducir el diclorofenol-indofenol e inhibir o regular la polimerización de pag-Acidos cinámicos OH por lacasas. El estudio de la oxidación de lignosulfonatos mediada por lacasa sola o en asociación con AAO reveló que el sistema VA / AAO es capaz de prevenir la polimerización de la lignina. Tanto el VA como los alcoholes bencílicos liberados en los medios de cultivo pueden desempeñar un papel clave como cosustratos o soportes para las reacciones redox.


Potencial de Pleurotus sajor-caju abono para controlar Meloidogyne incognita y mejorar el estado nutricional de las plantas de tomate

1 Departamento de Investigación de Hortalizas, Instituto de Investigación en Horticultura, Centro de Investigación Agrícola, Egipto
2 Departamento de Investigación en Nematología, Instituto de Investigación en Fitopatología, Centro de Investigación Agrícola, Egipto
3 Departamento de Ciencias del Suelo y del Agua, Facultad de Agricultura, Universidad de Alejandría, Alejandría, Egipto

*Dirección para la correspondencia: Sherin FA Awd Allah, Departamento de Investigación en Nematología, Instituto de Investigación en Fitopatología, Centro de Investigación Agrícola, Egipto, Tel: (+20) 11-5823-5078 Correo electrónico: [email protected]

Abstracto

El potencial del compost usado de hongos ostra, Pleurotus sajor-caju cultivado en arroz (MCR) o paja de trigo (MCW) se evaluó contra el nematodo agallador, Meloidogyne incognita en plantas de tomate en condiciones de campo durante dos temporadas sucesivas (2016 y 2017). El ensayo de campo se llevó a cabo en un suelo franco arcilloso infestado naturalmente con M. incognita en una granja privada, gobernación de Kafr El-Sheikh, Egipto. Los resultados revelaron que todos los tratamientos probados suprimieron en gran medida las poblaciones finales (PF), número de agallas y masas de huevos de M. incognita durante ambas temporadas en comparación con el tratamiento no tratado. Los porcentajes más altos de PF Se lograron reducciones (81,1 - 87%) y (80,2 - 86,2%) con el nematicida químico, Vydate ® 10 G y tratamientos de (MCR y MCW) a una tasa de aplicación de 1200 g / m 2 en la 1ª y 2ª temporadas. , respectivamente. Además, el rendimiento de frutos durante ambas temporadas se incrementó significativamente con todos los tratamientos aplicados, especialmente el tratamiento de MCW a una tasa de aplicación de 1200 g / m 2. Además, las propiedades químicas de la fruta mejoraron notablemente con los tratamientos MCR y MCW. Además, los tratamientos de MCR y MCW lograron los porcentajes más altos de contenido de nitrógeno y fósforo. En general, los resultados indicaron que el compost usado obtenido después del cultivo de P. sajor-caju tiene un potencial nematicida contra M. incognita, también mejoró el estado nutricional y aumentó el rendimiento de tomate.

Introducción

Tomate (Solanum lycopersicum Mill.) Es uno de los principales cultivos de hortalizas industriales y exportables del mundo y de Egipto [1]. Los carotenoides, en particular el pigmento de licopeno presente en los frutos del tomate, parece ser un compuesto activo en la prevención del cáncer, el riesgo cardiovascular y la ralentización del envejecimiento celular, debido a su alto poder antioxidante y antirradical [2-4].

A nivel mundial, los nematodos parásitos de las plantas causan pérdidas de rendimiento elevadas de alrededor de 118 000 millones de dólares estadounidenses al año [5]. Los nematodos agalladores (Meloidogyne spp.) son los nematodos más extendidos que causan más del 27% de pérdidas en el rendimiento del tomate [6,7]. En Egipto, el nematodo agallador ataca los cultivos de tomate y causa graves daños a los cultivos, especialmente en el suelo arenoso infestado [8].

Administración de Meloidogyne spp. es extremadamente difícil debido a su amplia variedad de hospedadores, períodos cortos de alta tasa de reproducción y generación [9]. Se han desarrollado varias estrategias, que incluyen cultivares de resistencia, enmiendas orgánicas del suelo y control biológico como alternativas a los productos químicos en el manejo de nematodos parásitos de las plantas [10-12]. El manejo de nematodos en sistemas agrícolas sostenibles ecológicos incluye el uso de residuos orgánicos como materiales de bajo insumo en el sistema agrícola, que se considera una solución económica para el problema ambiental resultante de la eliminación de materiales de desecho orgánicos, así como mejorar la estructura del suelo y aumentar la retención de agua. capacidad [13-16]. Se han realizado numerosos ensayos con éxito para aplicar métodos no químicos para controlar el nematodo agallador, M. incognita infectar plantas de tomate mediante la adición de materiales no compostados o abono de hongos antes de plantar en suelo infestado de nematodos [17-20].

Los hongos ostra (Pleuroto spp.) son descomponedores útiles de diversos desechos agrícolas [21]. El cultivo de hongos ostra es un proceso biotecnológico para el reciclaje de residuos lignocelulósicos. Este proceso tiene dos objetivos: la producción de alimentos ricos en proteínas y la reducción de los contaminantes ambientales. Los residuos agrícolas como las pajitas de arroz y trigo son la principal fuente de materiales lignocelulósicos, que es el mejor sustrato para la fermentación en estado sólido de Pleurotus sajor-caju [22,23]. El compost de hongos gastado (MC) se puede utilizar como una herramienta eficaz para controlar los nematodos agalladores de las raíces en el tomate [24]. Los resultados de experimentos anteriores revelaron la capacidad nematófaga de Pleuroto especie [25, 26].

Las plantas utilizan nutrientes de diferentes fuentes, como el suministro de suelo autóctono, fertilizantes y residuos orgánicos aplicados al suelo [27]. El fertilizante químico es una fuente indispensable de nutrientes, que son esenciales para mejorar el crecimiento, la salud y la calidad de las plantas en general. Sin embargo, el uso intensivo de fertilizantes químicos puede contribuir a la contaminación ambiental a menos que se gestione adecuadamente [28]. Agricultura sostenible basada en el enfoque de sistemas integrados de nutrición vegetal (IPNS). El IPNS tiene como objetivo el uso de fertilizantes químicos y residuos orgánicos de manera integrada [29]. Los nutrientes pueden reducir la gravedad de la enfermedad, afectar el medio ambiente para disuadir a los patógenos y también inducir resistencia o tolerancia en la planta huésped [30]. Los nematodos se encuentran entre los patógenos que pueden verse afectados por la nutrición de las plantas. La aplicación de fertilizantes puede, parcialmente, contrarrestar el daño inducido por nematodos al estimular el desarrollo de las plantas y disminuir la necesidad de control químico [31,32].

Por lo tanto, los objetivos de la investigación actual fueron (1) evaluar el potencial y la viabilidad de usar compost usado de P. sajor-caju que se cultivó en dos tipos de desechos agro-residuales locales (arroz o paja de trigo) como un enfoque orgánico para manejar el nematodo agallador, M. incognita mediante la incorporación directa de compost usado al suelo antes del trasplante de plántulas de tomate (2) para determinar el efecto de P. sajor-caju compost, cuando se aplica en dosis de 2.5 y 5 ton / feddan sobre el enriquecimiento del estado nutricional, el rendimiento y la calidad del fruto de las plantas de tomate durante dos temporadas sucesivas (2016 y 2017).

Materiales y métodos

El experimento de campo se llevó a cabo durante las temporadas de verano de 2016 y 2017 para evaluar el potencial nematicida del compost gastado de hongo ostra, Pleurotus sajor-caju (Fr.) Singer, que se cultiva en arroz (MCR) o paja de trigo (MCW), para el control del nematodo agallador, Meloidogyne incognita en tomateSolanum lycopersicum Mill.) Híbrido “Elisa” y su impacto en el rendimiento y la calidad de la fruta en comparación con el nematicida químico, Vydate® (Oxamil 10% G) en una granja privada, gobernación de Kafr El-Sheikh, Egipto.

Propiedades fisioquímicas de la ubicación del suelo experimental.

Se tomaron muestras compuestas de suelo superficial a una profundidad de 0-30 cm del lugar experimental antes del tiempo de siembra para ambas estaciones, se secaron al aire, se molieron y se pasaron a través de poros de tamices de 2 mm, luego se enviaron muestras para análisis y determinación físico-química. Propiedades en el Departamento de Ciencias del Suelo y del Agua, Facultad de Agricultura, Universidad de Alejandría. Las propiedades físicas y químicas de las muestras de suelo se muestran en la tabla 1.

Tabla 1: Propiedades fisioquímicas de la ubicación del suelo experimental.
Propiedades físicas Propiedades químicas
Distribución de tamaño de partícula (%) * pH ** CE (dSm-1) Concentración de cationes y aniones (meq L-1) Disponible
P (mg kg-1)
OM (%) N total (%)
Arena Limo Arcilla Textura Ca2 + Mg2 + K + Na + HCO3- Cl- SO4- -
1ra temporada
23.4 37.6 39.0 Franco arcilloso 7.81 2.03 4.83 5.67 0.58 8.92 3.89 6.25 9.86 8.94 2.25 0.19
2da temporada
25.1 36.4 38.5 Franco arcilloso 7.83 2.15 5.00 5.94 0.63 9.87 4.30 7.29 9.85 9.78 2.97 0.20
* El pH se determinó en suspensión de agua del suelo (1: 2.5), ** La CE se determinó en extracto saturado de pasta de suelo
Compost de hongos gastado (MC) utilizado en este experimento

El compost de hongos probado se recogió después de completar la cosecha cosechada de hongos ostra (P. sajor-caju), que se cultiva en dos tipos de desechos agrícolas locales, arroz (MCR) o paja de trigo (MCW). El MCR (esterilla de hongos gastados + paja de arroz compostada) y MCW (esterilla de hongos gastados + paja de trigo compostada) evaluados se obtuvieron de la unidad de producción de hongo ostra en el Laboratorio de Protección Integrada, Estación de Investigación de Protección Vegetal, Sabahiya, gobernación de Alejandría, Egipto. Muestras de pajitas de arroz y trigo antes y después P. sajor-caju El crecimiento se envió al Departamento de Ciencias del Suelo y del Agua, Facultad de Agricultura, Universidad de Alejandría para el análisis y determinación del contenido de elementos de macro y micronutrientes. Los análisis químicos de las pajitas de arroz y trigo antes y después P. sajor-caju el crecimiento se muestra en la tabla 2.

Tabla 2: Análisis químico de pajitas de arroz y trigo antes y después del cultivo de hongos ostra.
Muestra Elemento Relación C: N
norte PAG K C California Mg Fe Minnesota Zn Cu
% ppm
Paja de arroz 0.45 0.37 0.48 21.68 0.29 0.10 48.20 29.01 36.16 11.30 48.2:1
MCR 1.01 0.76 0.85 19.87 1.50 0.65 152.10 97.82 56.30 36.73 19.7:1
Paja de trigo 0.40 0.32 0.57 22.10 0.40 0.17 62.12 25.00 30.75 12.42 55.3:1
MCW 0.87 0.70 1.09 17.86 1.65 0.74 161.80 92.54 51.23 39.10 20.5:1
MCR: abono gastado de P. sajor-caju cultivado en sustrato de paja de arroz, MCW: abono gastado de P. sajor-caju cultivado en sustrato de paja de trigo.
Aplicaciones de experimentos de campo

El campo experimental se dividió en parcelas, cada una con hileras de 5 m de largo y 50 cm de separación y la distancia entre las plantas fue de 40 cm. Las parcelas de investigación incluyeron seis tratamientos asignados en un diseño de bloques completos al azar (RCBD). Población inicial (PI) de M. incognita se estimaron el tiempo de trasplante previo mediante métodos de tamizado y decantación [33] utilizando submuestras de 250 g de suelo bien mezclado recogidas de cada hilera.

Los tratamientos aplicados durante las temporadas de verano 2016 y 2017 fueron los siguientes:

1. MCR aplicado a una tasa de 600 g / m 2 (2,5 ton / feddan).

2. MCR aplicado a una tasa de 1200 g / m 2 (5 ton / feddan).

3. MCW aplicado a una tasa de 600 g / m 2 (2,5 ton / feddan).

4. MCW aplicado a una tasa de 1200 g / m 2 (5 ton / feddan).

5. Se aplicó el nematicida Vydate® (Oxamil 10% G) a razón de 5 g / m 2 (20 kg / feddan).

El abono de hongos fresco (MCR o MCW) se incorporó directamente y se mezcló en los 20-25 cm superiores de la superficie del suelo a tasas de aplicación de 600 o 1200 g / m 2 y pronto se regó hasta la capacidad del campo. Dos semanas después de la aplicación de los tratamientos, se trasplantaron plántulas de tomate del híbrido Elisa (40 días de edad). Se agregaron fertilizantes químicos durante las etapas de crecimiento de las plantas de tomate y las demás prácticas agrícolas se realizaron de acuerdo con la recomendación del Ministerio de Agricultura de Egipto.

Cuatro meses después, en el momento de la cosecha, se registraron las plantas de tomate tomadas al azar de cada fila, cuidadosamente desarraigadas y el número de agallas y masas de huevos por sistema de raíces de las plantas de tomate. Números promedio, de cinco conteos, de M. incognita juveniles (J2) se tomaron para determinar las densidades finales de población de nematodos (PF) en el suelo [33]. También se calculó el factor de reproducción (Rf) [34]. % De reducción (R) de M. incognita La población en el suelo se calculó al final del experimento utilizando la fórmula de Mulla, et al. [35], como sigue:

R (% de reducción) = 100 - [(C1 / T1) × (T2 / C2) × 100].

C1 = densidad de población previa al tratamiento en control

C2 = densidad de población postratamiento en control

T1 = densidad de población antes del tratamiento en tratamiento

T2 = densidad de población postratamiento en tratamiento.

Parámetros de crecimiento vegetativo

A los 75 días después del trasplante de ambas estaciones, se tomaron plantas de tomate al azar de cada fila para determinar los siguientes parámetros: peso fresco y seco de la planta (incluyendo brote y raíz), peso fresco de tallo y hojas (g / planta) y área foliar (cm 2 / planta) se midió después de la primera cosecha de frutos según Yousri [36].

Número de frutos y rendimiento

Durante ambas temporadas, los frutos de tomate se recolectaron semanalmente durante el período de cosecha para parámetros de rendimiento, estimación del número de frutos / planta, frutos no comercializables (%) como porcentaje del rendimiento total de frutos, peso promedio de frutos (g) y rendimiento de frutos (g / planta). ).

Parámetros de calidad de la fruta

Se recolectaron muestras aleatorias de 30 frutos de cada tratamiento en la cuarta recolección de ambas temporadas experimentales para determinar el contenido total de sólidos solubles (TSS%), acidez (%), ácido ascórbico (vitamina C mg / g), materia seca (%). y Ca (%). Todos estos parámetros se midieron según los métodos de la AOAC [37].

Composición química de la hoja

Después de 15 días desde la última adición de dosis de fertilizante químico durante ambas temporadas, la clorofila total se extrajo usando N, N-dimetil formaldehído y se expresó como mg / g de peso fresco según Moran, et al. [38]. Las muestras de hojas se secaron en horno a 70 ° C y se estimaron los contenidos de N, P, K y Ca. El contenido de nitrógeno total se determinó de acuerdo con el método descrito por Jones Jr, [39]. Mientras que, el contenido total de fósforo se midió de acuerdo con Page, et al. [40]. Además, el contenido de potasio total se determinó de acuerdo con el método descrito por Chapman y Pratt, [41] y el contenido de calcio se midió de acuerdo con Jackson [42].

Análisis estadístico

Los datos obtenidos se sometieron al análisis de varianza (ANOVA) mediante el programa informático CoStat Versión: 6.303 [43]. Las medias de los tratamientos se compararon con el valor de la prueba de LSD revisada al nivel de probabilidad del 5%.

Resultados y discusión

El presente estudio está explorando diferentes enfoques para usar MC para controlar M. incognita mediante la incorporación directa de MC al suelo antes de la siembra del tomate. Los datos de la tabla 3 demostraron que todos los tratamientos aplicados probados redujeron la población final de nematodos (PF), factor de reproducción (Rf), número de agallas y masas de huevos de M. incognita plantas de tomate infectadas en condiciones de campo durante ambas temporadas (2016 y 2017). En la 1ª temporada, Vydate ® 10 G fue el tratamiento más eficaz para suprimir la PF en el suelo, el número de agallas y masas de huevos en 87, 83,2% y 83%, respectivamente. Junto al tratamiento Vydate ® 10 G, las mayores reducciones de M. incognita PAGF en el suelo (81,1% y 85,5%), (77,7% y 80,4%) agallas de raíces de nematodos y (77,8% y 82,1%) masas de huevos se registraron con una alta tasa (1200 g) de tratamientos MCR y MCW en comparación con el tratamiento no tratado . Mientras que, la baja tasa de aplicación (600 g) de MCR y MCW redujo el nematodo PF en el suelo, el número de agallas y masas de huevos en (74,8% y 76%), (68,7% y 73,4%) y (68,8% y 71,9%), respectivamente.

Tabla 3: Efecto de dos tipos de Pleurotus sajor-caju abono gastado (MCR y MCW) y el nematicida químico Vydate® (Oxamil 10% G) para controlar Meloidogyne incognita infectando plantas de tomate durante dos temporadas sucesivas (2016 y 2017).
Tratamiento Tasa (g / m 2) J2 / kg suelo G / planta R EM / planta R
Pi PAGF R Rf
1ra temporada
MCR 600 4300 2082 b 74.8 0.48 200 b 68.7 180 b 68.8
1200 3878 1412 c 81.1 0.36 142 cd 77.7 128 c 77.8
MCW 600 4250 1968 b 76.0 0.46 170 c 73.4 162 b 71.9
1200 4062 1130 cd 85.5 0.28 125 días 80.4 103 días 82.1
Vydate ® 5 4106 1024 días 87.0 0.25 107 e 83.2 98 d 83.0
Sin tratar - 3980 7590 a - 1.91 638 a - 576 a -
2da temporada
MCR 600 4080 2186 b 70.0 0.54 221 b 71.7 196 b 68.0
1200 3740 1320 días 80.2 0.35 164 c 79.0 149 c 75.7
MCW 600 3962 1796 c 74.6 0.45 197 a. C. 74.7 190 b 69.0
1200 3658 1012 de 84.5 0.27 133 cd 83.0 116 cd 81.1
Vydate ® 5 3680 910 e 86.2 0.24 116 días 85.1 104 días 83.0
Sin tratar - 4056 7150 a - 1.76 780 a - 612 a -
La media en cada columna seguida de la (s) misma (s) letra (s) no es significativamente diferente en pag = 0.05.
Pi = población inicial de nematodos de J2/ kg suelo PF = población final de nematodos de J2/ kg suelo R = el porcentaje de reducción se calculó usando la fórmula de Mulla (R = 100 - [(C1 / T1) × (T2 / C2) × 100]) Rf = factor de reproducción de nematodos = (PF/ Pi) G = número de agallas EM = número de masas de huevos MCR: abono gastado de P. sajor-caju cultivado en sustrato de paja de arroz, MCW: abono gastado de P. sajor-caju cultivado en sustrato de paja de trigo.

Se obtuvieron resultados similares en la 2ª temporada (Cuadro 3). Vydate ® 10 G y los tratamientos de (MCR y MCW) a una tasa de 1200 g / m 2 mostraron reducciones máximas en el P del sueloF con (80,2 - 86,2%), número de agallas (79 - 85,1%) y masas de huevos (75,7 - 83%) en comparación con las plantas sin tratar. Considerando que, 600 g de MCR y MCW suprimieron el nematodo PF por (70% y 74,6%), número de agallas (71,7% y 74,7%) y masas de huevos (68% y 69%).

Los plaguicidas químicos tienen en su mayoría la ventaja de una respuesta rápida y eficaz en el control de los nematodos parásitos de las plantas. Los resultados obtenidos del presente trabajo fueron confirmados por Saad, et al. [44], quien encontró que el oxamil y el fenamifos eran los tratamientos más efectivos para controlar el nematodo agallador, M. incognita en plantas de tomate.

Sin embargo, recientemente se han adoptado muchas estrategias alternativas para reemplazar los plaguicidas químicos debido a sus efectos negativos sobre el medio ambiente, induciendo resistencia a las plagas, peligros tóxicos para la salud humana y animal y altos costos [11,12,45,46]. Los resultados del presente estudio son muy consistentes con los resultados de varios estudios que informaron que los nematodos agalladores no podían reproducirse en los cultivos de Pleuroto spp. y confirmó la capacidad de los hongos ostra para capturar, matar y digerir el nematodo [47-49]. Barron y Thorn, et al. [50] indicó el crecimiento orientado / dirigido de las hifas que luego entraron, con gran precisión, en la cabeza del nematodo como hifas dirigidas. Las hifas orientadas se observaron comúnmente en nematodos muertos atacados por el Pleuroto especies. P. ostreatus se sabe que exuda una toxina de sus hifas, conocida como ácido trans-2-decenodioico [51]. Esta toxina paraliza a los nematodos al contacto, lo que permite que las hifas se muevan a su posición para colonizar y digerir el nematodo. Pleuroto spp. mató al nematodo agallador después de un breve período de exposición a sus hifas. Los nematodos fueron inmovilizados tan pronto como se acercaron a la colonia de hongos [25,50,52,53].

Nuestros resultados fueron consensuados y apoyados por muchos estudios que enfatizaron que los nematodos agalladores se suprimieron en gran medida después de la aplicación de CM [24,54-56]. Descubrieron que el CM era eficaz como enmiendas del suelo en el manejo de Meloidogyne spp. en plantas de tomate.

La incorporación directa de CM al suelo podría asegurar el contacto directo del micelio del hongo con los nematodos. Palizi y col. [57] informó que la incorporación directa de compost de hongos ostra en el suelo al 3% (p / p) suprimió más del 85% de los quistes del nematodo del quiste de la remolacha azucarera (Heterodera schachtii) en condiciones de campo. Por otro lado, Ching y Wang, et al. [58] informó que la enmienda MC directa no suprimió M. incognita en las raíces de albahaca en el suelo arenoso. Es posible que el mal establecimiento del micelio del hongo en el suelo se mezcle con una cantidad limitada de materia orgánica.

Los efectos nematóxicos de la CM pueden atribuirse a los compuestos fenólicos presentes en la CM, que tienen actividad antimicrobiana y podrían ser un control biológico eficaz de los nematodos agalladores en el tomate [24]. Además, Pant y Singh, et al. [59] informó que el compost usado de P. sajor caju era eficaz para el manejo y minimizaba las agallas de las raíces de M. incognita en las plantas de tomate porque su micelio es carnívoro, come nematodos, exuda toxinas extracelulares que aturden a los nematodos, mientras que el micelio invade su cuerpo a través de sus orificios.

La aplicación equilibrada de macro y micronutrientes al suelo es la mejor manera de asegurar que el cultivo sea capaz de resistir el daño causado por los nematodos [31]. El compost de hongos es un subproducto residual producido por la industria de los hongos y una buena fuente de nutrientes (0,7% N, 0,3% P, 0,3% K más una gran cantidad de oligoelementos), así como un útil acondicionador del suelo [60,61]. . Además, un efecto significativo de la CM en nuestro estudio puede deberse también a otros mecanismos indirectos, como la estimulación de las actividades de los microorganismos del suelo que son antagonistas de los nematodos parásitos de las plantas [62,63]. Además, la descomposición de CM resultó en la acumulación de compuestos específicos en el suelo que pueden tener efectos nematicidas contra nematodos. El nitrógeno en forma de amonio, presente en la materia orgánica, es más perjudicial para los nematodos que en forma de nitrato debido a la liberación de amoniaco libre (NH3) en el suelo durante su descomposición [31,64]. Además, la mejora de la nutrición de los cultivos y el crecimiento de las plantas después del uso de enmiendas de CM podría aumentar la tolerancia de las plantas contra los nematodos [65]. El fósforo es esencial para el crecimiento de las plantas y también puede influir en las enfermedades causadas por nematodos. Las plantas se vuelven más resistentes cuando se les suministran cantidades suficientes de fósforo y liberan menos exudados radiculares y, por lo tanto, son menos atractivas para los nematodos que cortan, lo que disminuye la incidencia de las enfermedades. Como otros nutrientes, el calcio debe estar presente en cantidad suficiente en el suelo, ya que las plantas deficientes en calcio son más susceptibles al ataque de nematodos [31].

Además, los resultados del presente estudio coinciden en general con los informados por Abbasi, et al. [26], quien demostró que la aplicación de compost completamente para desove reduce significativamente M. javanica masa de huevos y densidades de población en suelos tratados con compost de hongo ostra usado que no tratado en condiciones de campo y podría ser uno de los mejores agentes potenciales de biocontrol. Además, El-Sherbiny y Awd Allah, et al. [19] mostró que el tratamiento con residuos de desechos de P. ostreatus cultivo ya que los biofumigantes del suelo antes de la siembra redujeron M. incognita agallas, masas de huevos, población final y factor de reproducción en plantas de tomate susceptibles en condiciones de campo y aumento considerable del rendimiento de frutos.

Digno de mención, El-Saedy, et al. [66] evaluar la eficacia del uso de paja de arroz y sustrato gastado de hongo ostra (P. ostreatus) en el nematodo de los cítricos (Tylenchulus semipenetrans) que infecta los naranjos de Valencia y encontró que la enmienda del suelo con sustrato de hongos gastados redujo significativamente el número de J2 de T. semipenetrans en suelo y números de J2 y hembras en raíces de naranja y mayor rendimiento de naranja. Mientras que, los porcentajes de reducción más bajos se registraron con las tasas de aplicación de paja de arroz a lo largo de las dos temporadas de cultivo probadas en condiciones de campo.

Parámetros de crecimiento vegetativo

El efecto de dos tipos de P. sajor-caju compost usado (MCR y MCW) en comparación con el nematicida químico, Vydate® (Oxamil 10% G) sobre los caracteres de crecimiento vegetativo de las plantas de tomate se presentan en la tabla 4. En general, los datos confirmaron que todos los tratamientos durante ambas estaciones aumentaron significativamente el crecimiento estudiado parámetros en comparación con plantas no tratadas. En ambas temporadas, el tratamiento de MCW a una tasa de aplicación de 1200 g / m 2 dio el efecto de aumento significativo más alto sobre los valores de crecimiento vegetativo en comparación con los otros tratamientos. Mientras, los valores más bajos de crecimiento vegetativo registrados con la aplicación de Vydate® 10 G durante las temporadas 2016 y 2017 (Cuadro 4).

Cuadro 4: Efecto de dos tipos de Pleurotus sajor-caju compost usado (MCR y MCW) y el nematicida químico Vydate® (Oxamil 10% G) sobre los parámetros de crecimiento vegetativo de las plantas de tomate durante las temporadas 2016 y 2017.
Tratamiento Índice (g / m 2) Peso fresco (g / planta) Área de la hoja
(cm 2 / planta)
Peso fresco de la planta (g) Peso seco de la planta (g)
Madre Sale de
1ra temporada
MCR 600 230,2 b 742,0 b 1372,0 b 1259,1 b 103,5 b
1200 272.1 a 769,2 b 1457,2 b 1350,5 b 112,1 a
MCW 600 265,0 a 751,4 b 1450,4 b 1302.3 b 106,8 ab
1200 297,4 a 832.0 a 1872.1 a 1520,7 a 121,7 una
Vydate ® 5 208,5 b 613,6 c 1245.0 c 1135,2 c 91,8 a. C.
Sin tratar - 185.0 c 541,8 días 872,7 días 981,5 días 80,6 c
2da temporada
MCR 600 262,3 b 735,3 b 1424.1 b 1325,7 b 107,1 ab
1200 285,0 a 789,7 b 1550,3 b 1402,5 b 116,9 una
MCW 600 295,0 a 784,0 b 1595,0 b 1385,4 b 114,6 una
1200 319,6 a 886,2 a 2510,5 a 1579,3 a 125,9 a
Vydate ® 5 232,2 b 638,3 c 1262.0 c 1186.0 c 94,7 b
Sin tratar - 202,1 c 570,0 d 951,0 días 1003,2 d 90,0 b
La media en cada columna, seguida de la misma letra (s) no son significativamente diferentes en pag = 0.05, MCR: abono gastado de P. sajor-caju cultivado en sustrato de paja de arroz, MCW: abono gastado de P. sajor-caju cultivado en sustrato de paja de trigo.

Los presentes resultados están de acuerdo con algunos estudios previos, que indican la viabilidad de utilizar MC como fertilizante orgánico para el cultivo de plantas de tomate [67-69]. Del mismo modo, Pant y Singh, et al. [59] informó que el compost usado de P. sajor caju fue eficaz para mejorar los parámetros de crecimiento del tomate y la fertilidad del suelo. Además, los parámetros de crecimiento aumentaron debido al rápido metabolismo de CM, la liberación de nutrientes que aceleran el rápido desarrollo de las raíces y el crecimiento de todas las plantas de tomate. Además, mezclar CM en el suelo puede mejorar la materia orgánica, la disponibilidad de nutrientes, la capacidad de retención de agua y la calidad del suelo, lo cual es importante para mejorar el crecimiento, la productividad y la calidad del tomate [27,70-72].

Número de frutos y rendimiento

Todos los tratamientos probados, en ambas temporadas, aumentaron significativamente (pag ≤ 0,05) el número de frutos / planta, el peso medio del fruto y el rendimiento de fruto de las plantas de tomate (Cuadro 5). El tratamiento de MCW a una tasa de aplicación de 1200 g / m 2, dio el rendimiento máximo de frutos por planta, así como el porcentaje más bajo de frutos no comercializables, seguido de 600 g de MCW y el tratamiento de MCR a tasas de aplicación de 600 y 1200 g / m 2 durante las dos temporadas. Considerando que, el valor significativamente más bajo de rendimiento de fruto / planta se registró con la planta sin tratar en ambas temporadas. Muchos autores apoyaron en gran medida nuestros hallazgos [19,26,59,69]. Descubrieron que el CM era efectivo como enmiendas del suelo para mejorar el rendimiento del crecimiento del tomate y el rendimiento de la fruta. Asimismo, El-Hadi y Camelia, et al. [73] informó que la aplicación de enmiendas orgánicas naturales tuvo un efecto positivo en el aumento del rendimiento de tomate y en la disminución del rendimiento de frutos no comercializables.

Cuadro 5: Efecto de dos tipos de Pleurotus sajor-caju abono gastado (MCR y MCW) y el nematicida químico Vydate® (Oxamil 10% G) en el componente de rendimiento de tomate durante las temporadas 2016 y 2017.
Tratamiento Índice (g / m 2) Número de frutos / planta Frutas no comercializables (%) Peso medio de la fruta (g) Rendimiento de frutos g / planta
1ra temporada
MCR 600 13,6 b 7.1 c 46,8 ab 675 b
1200 15,8 ab 6,6 c 51,6 una 722 b
MCW 600 13,9 b 5,8 cd 49,7 ab 687 b
1200 18,4 a 5,1 días 63,3 a 972 a
Vydate ® 5 16,1 a 10,1 b 45,3 b 635 b
Sin tratar - 11,7 c 18,4 a 34,3 b 374 c
2da temporada
MCR 600 17,8 b 4.5 a. C. 40,4 ab 660 a. C.
1200 19,5 a 3,6 c 45,6 a 735 b
MCW 600 19,3 a 2,7 c 40,9 ab 714 b
1200 22,5 a 1,8 días 51,6 una 1007 a
Vydate ® 5 18,3 ab 6,5 b 39,1 b 650 c
Sin tratar - 13,4 c 16,9 a 30,8 c 369 días
La media en cada columna, seguida de la (s) misma (s) letra (s) no son significativamente diferentes. p = 0.05, MCR: abono gastado de P. sajor-caju cultivado en paja de arroz, MCW: abono gastado de P. sajor-caju cultivado en paja de trigo.
Parámetros de calidad de la fruta

La eficacia de los tratamientos aplicados de MCR, MCW y Vydate® 10 G sobre sólidos solubles totales (TSS%), acidez (%), vitamina C (mg / g), materia seca de frutos (%) y Ca (%) se muestran en tabla 6. Los resultados obtenidos indicaron que los valores de vitamina C y Ca (%) en frutos de tomate aumentaron significativamente con los tratamientos de MCR y MCW seguidos de Vydate® 10 G durante las temporadas 2016 y 2017. Sin embargo, no se observaron diferencias significativas en materia seca de frutos (%) y TSS% entre los diferentes tratamientos durante ambas temporadas. Estos hallazgos están de acuerdo con los resultados de estudios previos que informaron que el sustrato de hongos gastado puede usarse como abono en mezclas de tierra para macetas para mejorar la calidad del fruto del tomate [74,75]. Asimismo, ciertos informes mostraron que los fertilizantes orgánicos como el compost pueden contribuir a la mejora del valor nutricional de la producción de hortalizas [76,77].

Cuadro 6: Efecto de dos tipos de Pleurotus sajor-caju abono gastado (MCR y MCW) y el nematicida químico Vydate® (Oxamil 10% G) sobre la calidad química, materia seca (%) y Ca (%) de frutos de tomate durante las temporadas 2016 y 2017.
Tratamiento Índice (g / m 2) TSS (%) Acidez (%) Vitamina C (mg / g) Materia seca (%) Ca (%)
1ra temporada
MCR 600 7.60 a 0,74 una 88,32 a 5.30 a 0,24 una
1200 7.70 una 0,78 una 89,40 a 5. 35 a 0,21 una
MCW 600 7,50 a 0,66 b 87.20 a 5.29 una 0,22 una
1200 8,20 a 0,77 una 88,76 una 5. 40 a 0,29 una
Vydate ® 5 7,50 a 0,77 una 84,11 b 5.40 a 0,15 b
Sin tratar - 8.00 a 0,85 una 84,50 b 5.48 una 0,14 b
2da temporada
MCR 600 7.60 a 0,65 b 86,57 a 5.27 una 0,21 una
1200 7,50 a 0,70 a 88,60 una 5,20 a 0,23 una
MCW 600 7,40 a 0,61 b 87,50 a 5.23 una 0,23 una
1200 7.80 una 0,69 b 89,58 una 5.42 una 0,26 una
Vydate ® 5 7.30 a 0,71 una 83,20 b 5.36 una 0,12 b
Sin tratar - 7,50 a 0,78 una 83,34 b 5.39 una 0,12 b
La media en cada columna, seguida de la (s) misma (s) letra (s) no son significativamente diferentes en pag = 0.05, MCR: abono gastado de P. sajor-caju cultivado en sustrato de paja de arroz, MCW: abono gastado de P. sajor-caju cultivado en sustrato de paja de trigo.
Composición química de la hoja

Los resultados presentados en la tabla 7 mostraron el efecto de MCR, MCW y el nematicida químico Vydate® 10 G sobre la composición química de las hojas de las plantas de tomate durante las dos temporadas sucesivas. Los datos mostraron que los tratamientos de MCR y MCW en ambas temporadas, dieron significativamente los porcentajes más altos en contenido de nitrógeno y fósforo en las hojas en comparación con las plantas no tratadas. En general, los resultados indicaron claramente que los tratamientos evaluados tuvieron un efecto positivo en el contenido foliar de N, P, K y Ca% en plantas de tomate y mejoraron significativamente el estado nutricional a rangos óptimos suficientes con un aumento en el contenido de clorofila de las hojas en comparación con las hojas no tratadas. plantas en ambas estaciones (Cuadro 7).

Tabla 7: Efecto de dos tipos de Pleurotus sajor-caju abono gastado (MCR y MCW) y el nematicida químico Vydate® (Oxamil 10% G) en la composición química de las hojas de las plantas de tomate durante las temporadas 2016 y 2017.
Tratamiento Índice (g / m 2) norte PAG K California Clorofila (mg / g)
%
1ra temporada
MCR 600 4,35 a 0,35 una 3,67 b 1,78 b 47,5 a
1200 4,90 a 0,38 una 3,79 a 1,94 b 47,9 a
MCW 600 4.15 una 0,34 una 3,70 b 1,85 b 48,3 a
1200 4.80 una 0,35 una 3,84 a 2,57 a 49,6 a
Vydate ® 5 3,60 b 0.31 ab 3,60 b 1,63 b 44,6 a
Sin tratar - 3,50 b 0,30 b 3,50 c 1.01 c 40,2 b
2da temporada
MCR 600 4.60 una 0,34 una 3,69 b 1,83 b 46,2 a
1200 5.00 a 0.37 una 3,74 a 1,86 b 48,6 una
MCW 600 4.50 a 0,33 una 3,71 a 1,87 b 47,5 a
1200 4,70 a 0,35 una 3,81 a 2,63 a 48,8 una
Vydate ® 5 3,75 b 0,30 b 3,63 b 1,60 b 45,4 a
Sin tratar - 3,70 b 0,30 b 3,52 c 1.04 c 40,4 b
La media en cada columna, seguida de la misma letra (s) no son significativamente diferentes en pag = 0.05, MCR: abono gastado de P. sajor-caju cultivado en sustrato de paja de arroz, MCW: abono gastado de P. sajor-caju cultivado en sustrato de paja de trigo.

La cantidad y el tipo de nutrientes suministrados al tomate pueden influir no solo en su rendimiento, sino también en su contenido de nutrientes, sabor y calidad de almacenamiento poscosecha. Los elementos nutritivos, como N, P, K, Ca y Mg, son necesarios en grandes cantidades para el crecimiento y la reproducción normales. Mientras que otros elementos, como Fe, Cu, Zn, Mn, B y Mo, son necesarios en pequeñas cantidades para plantas nutricionalmente "sanas" y una nutrición adecuada de los cultivos [78]. La composición de las hojas es el mejor indicador del estado nutricional de las plantas [79]. El uso racional y juicioso de fertilizantes químicos en la producción agrícola es fundamental para mejorar la eficiencia de la producción y un ecosistema sostenible [70]. Las enmiendas orgánicas del suelo pueden aumentar la materia orgánica del suelo y mejorar las propiedades químicas y físicas del suelo mejorando la fertilidad del suelo, lo que a su vez promueve un cultivo mejorado [62,80,81]. El MC puede ser una herramienta útil para mejorar la salud del suelo al proporcionar materia orgánica y una gran cantidad de elementos nutritivos como nitrógeno, fósforo y potasio para el crecimiento saludable de las plantas. También se ha demostrado que tiene una alta capacidad de retención de agua, lo que reduce el uso de agua para riego [26,82]. En general, el MC fue adecuado como fertilizante natural y mejorador del suelo en los campos de hortalizas y puede contribuir a mejorar el valor nutricional de la producción de tomate [61,76].


¿Cuántas generaciones podemos ejecutar un micelio de Pleurotus ostreatus / Pearl Oyster? - biología

Genes de peroxidasa ligninolítica en el genoma del hongo ostra: expresión heteróloga, estructura molecular, propiedades catalíticas y de estabilidad y capacidad de degradación de la lignina

7 1 2 http://www.biotechnologyforbiofuels.com/content/7/1/2

2014 Fern & # 225ndez-Fueyo et al. licenciatario BioMed Central Ltd. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia de atribución Creative Commons (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0), que permite el uso, distribución y reproducción sin restricciones en cualquier medio. siempre que la obra original esté debidamente citada. La exención de Dedicación de dominio público de Creative Commons (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) se aplica a los datos disponibles en este artículo, a menos que se indique lo contrario. Genoma Pleurotus ostreatus Genes de peroxidasa ligninolítica Expresión heteróloga Estructura cristalina Propiedades catalíticas Estabilidad térmica Estabilidad del pH Duplicación de genes Evolución de peroxidasa

El genoma de Pleurotus ostreatus, importante hongo comestible y organismo ligninolítico modelo de interés en las biorrefinerías de lignocelulosa por su capacidad para deslignificar los desechos agrícolas, fue secuenciado con el propósito de identificar y caracterizar las enzimas responsables de la degradación de la lignina.

La expresión heteróloga de los genes de peroxidasa de clase II, seguida de estudios cinéticos, permitió su clasificación funcional. El inventario resultante reveló la ausencia de peroxidasas de lignina (LiPs) y la presencia de tres peroxidasas versátiles (VPs) y seis peroxidasas de manganeso (MnPs), las estructuras cristalinas de dos de ellas (VP1 y MnP4) se resolvieron en 1.0 a 1.1 & # 160 & # 197 que muestran diferencias estructurales significativas. La expansión genética respalda la importancia de ambos tipos de peroxidasa en el estilo de vida de la pudrición blanca de este hongo. Usando un dímero modelo de lignina y lignina sintética, demostramos que VP es capaz de degradar la lignina. Además, la actividad dual mediada por Mn e independiente de Mn de las MnP de P. ostreatus justifica su inclusión en una nueva subfamilia de peroxidasa. La disponibilidad de todo el repertorio de POD permitió investigar, a nivel bioquímico, la existencia de genes duplicados. Las diferencias entre isoenzimas no se limitan a sus constantes cinéticas.Sorprendentes diferencias en su actividad T50 y se observó actividad residual tanto a pH ácido como alcalino. La mutagénesis dirigida y la información espectroscópica / estructural se combinaron para explicar las propiedades catalíticas y de estabilidad de las isoenzimas más interesantes, y su historia evolutiva se analizó en el contexto de más de 200 secuencias de peroxidasa de basidiomicetos.

El análisis del genoma de P. ostreatus muestra un sistema de degradación de la lignina donde VP ha asumido el papel que generalmente desempeña LiP. Además, permitió la primera caracterización del conjunto completo de isoenzimas de peroxidasa en un basidiomiceto, revelando fuertes diferencias en las propiedades de estabilidad y proporcionando enzimas de interés biotecnológico.

La mayoría de los genomas de basidiomicetos actualmente disponibles provienen de hongos de descomposición de la madera (del orden Polyporales), pero los desechos agrícolas y los cultivos son las materias primas preferidas en las biorrefinerías de lignocelulosa para la producción de combustibles y productos químicos. En este contexto, el genoma de P. ostreatus se secuenció en JGI como un hongo de pudrición blanca representativo que puede deslignificar materiales lignocelulósicos no leñosos. Este hecho, junto con la posición taxonómica de Pleurotus como miembro del orden Agaricales, sugirió que la secuenciación del genoma podría revelar una maquinaria enzimática diferente. Nuestro análisis preliminar in silico del genoma de P. ostreatus 17 mostró los genes que codifican las peroxidasas de manganeso (MnP) y las peroxidasas versátiles (VP), pero no las peroxidasas de lignina (LiP), que están involucradas en la degradación de la lignina por el hongo modelo P. chrysosporium y muchos otros. otras especies que pudren la madera 18. Con el fin de ampliar nuestra comprensión del mecanismo enzimático para la degradación de la lignina por las especies de Pleurotus, los genes de peroxidasa anteriores del genoma de P. ostreatus se han expresado heterólogamente, se han caracterizado estructuralmente mediante métodos cristalográficos y de mutagénesis dirigida al sitio, y se ha evaluado su actividad. sobre lignina y sustratos relacionados. Además, se ha analizado la estabilidad y propiedades catalíticas de las distintas isoenzimas detectadas con miras a futuras aplicaciones biotecnológicas.

Genes de peroxidasa en el genoma de P. ostreatus

Comparación de secuencia, composición de aminoácidos, expresión heteróloga, estabilidad de pH (4 & # 176C y 25 & # 176C), estructura molecular (diferencias de VP1 y MnP4 y bolsas de hemo) y cinética sigmoidal de ABTS (VP1) para diferentes POD de la P. ostreatus genoma. Figura S1. Filograma de secuencias de hemo peroxidasa de los genomas de dos monokaryons de P. ostreatus. Figura S2. Composición de aminoácidos de los POD del genoma de P. ostreatus (proteínas maduras predichas). Figura S3. Expresión de E. coli de peroxidasas del genoma de P. ostreatus (SDS-PAGE). Figura S4. pH & # 1602 a 9 estabilidad de los nueve POD del genoma de P. ostreatus en diferentes tiempos de incubación. Figura S5. Influencia de la temperatura en la estabilidad del pH de los POD del genoma de P. ostreatus. Figura S6. Vistas estéreo de algunas de las principales diferencias entre las estructuras cristalinas de VP1 y MnP4. Figura S7. Mapa de densidad de electrones 2Fo-Fc parcial, contorneado en el nivel 1.1 y # 963, del cofactor hemo, residuos vecinos y varias moléculas de agua, y posición de los residuos del bolsillo hemo circundante, en los cristales de VP1 y MnP4. Figura S8. Curva sigmoidea para la oxidación de ABTS por VP (isoenzima VP1) que permite el cálculo de dos conjuntos de constantes cinéticas.

Los POD de P. ostreatus se clasificaron inicialmente como cinco MnP y cuatro VP de acuerdo con la presencia en los modelos de homología de: i) un sitio putativo de oxidación de Mn 2+ y ii) sitios putativos de oxidación de Mn 2+ y lignina, respectivamente (pero uno VP putativo se reclasificó como MnP1 en el curso del presente estudio). El primer sitio comprende tres residuos ácidos que se unen a los cationes Mn 2+, mientras que el segundo contiene un triptófano expuesto involucrado en la transferencia de electrones de sustratos donantes relacionados con la lignina. La posición de los restos anteriores y otros de interés en las secuencias de aminoácidos deducidas de los nueve POD del genoma de P. ostreatus se indica en la Figura & # 160 1. La longitud de la secuencia de las nueve proteínas maduras varía ligeramente (331 a 339 residuos) y existe alguna variación en la composición de aminoácidos (archivo adicional 1: Figura S2). Curiosamente, el número de prolina varía de 25 a 26 (en MnP2 y MnP4) a 30 a 31 (en VP1, VP3 y MnP5) y no se distribuyen uniformemente a lo largo de las secuencias, con la región C-terminal que tiene con mucho el concentración más alta (21 a 38% de residuos después de la última cisteína, posiciones 307/314 a 331/339, son prolina) en comparación con la proteína completa (7 a 9% de residuos de prolina). Sin embargo, la diferencia más importante en la composición de aminoácidos de los diferentes POD se refiere al número de residuos de lisina, que en MnP4 (20 lisinas) es casi el doble de los observados en los otros POD (siete a diez lisinas).

Alineación múltiple de secuencias de aminoácidos de los nueve POD del genoma de P. ostreatus (se incluyen las referencias actuales de JGI, después de la anotación manual)

Múltiple alineación de secuencias de aminoácidos de los nueve POD del P. ostreatus genoma (referencias actuales de JGI, después de la anotación manual, incluidas). Los residuos catalíticos conservados y otros residuos relevantes se indican con diferentes colores que incluyen: ocho cisteínas (cian) que forman cuatro puentes disulfuro nueve ligandos (verde) de dos iones de Ca 2+ estructurales dos histidinas del sitio activo (gris oscuro) tres residuos ácidos (naranja) que forman el Sitio de oxidación de Mn 2+ un triptófano (azul) responsable de la oxidación del sustrato aromático por VP (también presente en MnP1, inicialmente clasificado como VP) varios residuos conservados del sitio activo (gris claro) y varios residuos de lisina (púrpura) y prolina (amarillo) siendo particularmente frecuente en algunas de las secuencias. La alineación se preparó utilizando ClustalW2 (Instituto Europeo de Bioinformática, Hinxton, Reino Unido). La numeración de aminoácidos comienza en el primer residuo de la proteína madura (asterisco rojo en la alineación). Los símbolos siguientes indican la conservación total de los mismos (*) o residuos equivalentes (:) y la conservación parcial de los residuos (.). JGI, Joint Genome Institute MnP, peroxidasa de manganeso POD, peroxidasa de clase II de la superfamilia de peroxidasas no animales (planta-hongos-procariotas) VP, peroxidasa versátil.

Expresión heteróloga y propiedades catalíticas.

Para confirmar la clasificación de POD anterior, caracterizar las dos familias presentes en P. ostreatus e investigar las diferencias entre las isoenzimas VP y MnP, las secuencias de ADN codificantes de las nueve POD (proteínas maduras) de PC15 (excepto 1089895, que incluye una terminación prematura codón y fue sustituido por el alelo PC9 137757) se sobreexpresaron en Escherichia coli (archivo adicional 1: Figura S3A). En tiempos de inducción optimizados, las proteínas de peroxidasa se recuperaron de los cuerpos de inclusión (archivo adicional 1: Figura S3B), se activaron in vitro para la incorporación de hemo y Ca 2+ estructural y la formación de puentes disulfuro, se purificaron y caracterizaron. El rendimiento de purificación fue siempre superior al 95% de la proteína replegada aunque solo representó del 3 al 28% de la proteína total recuperada de los cuerpos de inclusión, con todas las enzimas purificadas mostrando espectros típicos con Reinheitszahl (Rz A 410/ A 280 ratio) valores & # 88053.8 (archivo adicional 2: Tabla S1).

Inventario de genes, propiedades estructurales de isoenzimas, datos cristalográficos, constantes cinéticas (VP1, MnP4 y MnP1 nativas y variantes mutadas) e identidades de secuencia para diferentes POD de la P. ostreatus genoma. Cuadro S1. Inventario de genes de peroxidasa en los genomas de P. ostreatus monokaryons PC9 y PC15 y algunas características de las POD purificadas de la expresión de E. coli. Cuadro S2. Propiedades estructurales potencialmente relacionadas con la estabilidad de temperatura / pH en los nueve POD del genoma de P. ostreatus, junto con la estabilidad térmica determinada experimentalmente (T50 actividades) y rango de estabilidad de pH. Cuadro S3. Recopilación de datos cristalográficos y estadísticas de refinamiento de P. ostreatus VP1 y MnP4. Cuadro S4. Constantes cinéticas de W165, E35A, E39A, D175A y E35A / E39A variantes de P. ostreatus VP1 oxidando VA, RB5 y Mn 2+, en comparación con VP1 nativo. Cuadro S5. Constantes cinéticas de variantes E36A, E40A, D179A y E36A / E40A de P. ostreatus MnP4 oxidando Mn 2+, en comparación con MnP4 nativo. Cuadro S6. Constantes cinéticas de dos variantes en el entorno de Trp165 de P. ostreatus MnP1, en comparación con el MnP1 nativo, y un MnP relacionado de P. pulmonarius oxidante VA, RB5, ABTS, DMP y Mn 2+. Cuadro S7. Identidades de secuencia de aminoácidos entre los nueve POD del genoma de P. ostreatus, P. chrysosporium LiP y MnP, y dos P. eryngii VP.

La comparación de las propiedades catalíticas de los nueve POD de P. ostreatus incluyó la estimación de las constantes cinéticas de estado estacionario para los sustratos reductores alcohol veratrílico (VA), Reactive Black 5 (RB5), 2,2 & # 8242-azino-bis (3- etilbenzotiazolina-6-sulfonato (ABTS), 2,6-dimetoxifenol (DMP) y Mn 2+, y para el sustrato oxidante H2O2 (Tabla & # 160 1). Sorprendentemente, la peroxidasa 1096331, que se había clasificado como VP debido a la presencia del triptófano catalítico putativo, no pudo oxidar los sustratos de alto potencial redox VA y RB5 y, por lo tanto, se renombró como MnP1 (y se volvió a anotar en el portal JGI). .

Constantes cinéticas ( K metro, & # 956M k gato, s -1 y k gato/ K metro, s -1 .mM -1 ) para los nueve POD del P. ostreatus genoma a

Los tres PV funcionales oxidaron todos los sustratos ensayados, aunque con diferentes eficiencias catalíticas (k gato/ K metro). En general, Mn 2+ fue su mejor sustrato (1.900 a 4.510 & # 160s -1 .mM -1) pero VP1 también oxidó ABTS y RB5 de manera eficiente (las otras isoenzimas oxidaron ABTS con eficiencias de cinco a nueve veces menores). DMP, y particularmente VA, son sustratos pobres de VP, aunque las eficiencias catalíticas fueron más altas (de dos a ocho veces) para VP1. Las curvas cinéticas bimodales que producen dos conjuntos de constantes cinéticas para la oxidación de ABTS y DMP en VP indican que estos sustratos se oxidan en un segundo sitio de baja eficiencia catalítica, además del sitio de alta eficiencia que podría ser el mismo involucrado en la oxidación de VA y RB5. Los seis MnP no pudieron oxidar VA y RB5, y sus eficiencias en Mn 2+ estuvieron en el rango de 1200 a 1930 & # 160s -1 .mM -1. Curiosamente, los MnP de P. ostreatus también podrían oxidar ABTS (y algunos de ellos DMP). Sin embargo, su eficiencia baja (ABTS) o muy baja (DMP) en estos sustratos los distingue de los VP. Los nueve POD mostraron altas eficiencias catalíticas en su reacción con H2O2, con todos menos uno de los MnP (la excepción fue el anómalo MnP1) teniendo valores más altos (3.000 a 3.700 & # 160s -1 .mM -1) que los VP (1.700 a 2.500 & # 160s -1 .mM -1).

Estabilidad del pH de las POD de P. ostreatus

Los nueve POD se incubaron en el intervalo de pH & # 1602 a 9 (a 4 & # 176ºC) durante cinco períodos de tiempo y se determinaron las actividades residuales. En la Figura & # 160 2 A se muestra una comparación de las actividades normalizadas después de 4 horas de incubación (a cinco valores de pH) (y el conjunto completo de actividades residuales de los nueve POD después de 1 minuto, 1, 4, 24 y 120 horas a los ocho valores de pH se incluyen como archivo adicional 1: Figura S4). Todas las enzimas estaban casi inactivadas a pH & # 1602 después de los tiempos de incubación más cortos, y solo MnP4 y VP3 retuvieron una actividad significativa a pH & # 1609 cuando se extendió la incubación (archivo adicional 1: Figura S4G y C, respectivamente). Curiosamente, MnP4 aparece como el POD más estable tanto a pH ácido como moderadamente alcalino, y VP2 era estable a pH & # 1603 pero inestable a pH & # 1609 (Archivo adicional 1: Figura S4B). Por otro lado, MnP2 y MnP3 fueron los POD más inestables en condiciones ácidas y alcalinas (archivo adicional 1: Figura S4E y F, respectivamente). Para la comparación con los análisis espectroscópicos, la estabilidad del pH también se evaluó a 25 & # 176C, lo que resulta en actividades residuales más bajas (archivo adicional 1: Figura S5).

Estabilidades de pH de los nueve POD del genoma de P. ostreatus

Estabilidades de pH de los nueve POD del P. ostreatus genoma. (A) Actividades residuales después de 4 horas de incubación a cinco valores de pH seleccionados en el rango de pH & # 1602 a 9. Se determinaron las actividades residuales de las tres isoenzimas VP y seis MnP de E. coli expresadas y activadas in vitro (mediante oxidación ABTS 5 & # 160 mM en tartrato 0,1 & # 160 M, pH & # 1603,5, excepto para MnP1 y MnP6, para los cuales 2 & # Se utilizó ABTS 160 mM) después de la incubación (a 4 & # 176C) en 100 & # 160 mM B & ampR buffer de pH & # 1602 a 9 (Archivo adicional 1: La Figura S4 muestra datos a ocho valores de pH después de 1 minuto, 1, 4, 24 y 120 horas de incubación, y la Figura S5 muestra la comparación de la estabilidad del pH a 4 ° C y 25 ° C). Medias y límites de confianza del 95%. (B) Espectros UV-visibles de isoenzimas MnP3 inestables y MnP4 estables después de 0 (negro), 30 (magenta), 60 (amarillo), 90 (violeta), 120 (azul), 180 (verde) y 240 minutos (rojo) de incubación a pH & # 1603 y 8. Se muestran tres exploraciones adicionales a 30 (rayas grandes), 60 (rayas cortas) y 90 segundos (puntos) de incubación, y amplificada (absorbancia x 5) 450 a 700 & # 160 nm para la región inicial de MnP3 y espectros finales. Se indican los máximos principales. (C) Espectros de CD de UV lejano de isoenzimas MnP3 inestables y MnP4 estables después de 1 minuto (negro) y 1 hora (verde) de incubación a pH & # 1603 y 5. Los resultados se muestran como elipticidades molares (& # 952) y se indican los mínimos principales. Todos los espectros se registraron a 25 ° C y 176 ° C. ABTS, 2,2 y # 8242-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato) B & ampR, Britton-Robinson CD, dicroísmo circular MnP, peroxidasa de manganeso POD, peroxidasa de clase II de la superfamilia de no animales (plantas-hongos- procariotas) peroxidasas VP, peroxidasa versátil.

Los efectos del pH en el entorno hemo y la estructura de las proteínas se investigaron mediante espectroscopía de absorción UV visible y dicroísmo circular (CD) de UV lejano. Se utilizaron MnP3 y MnP4 como modelos de POD inestables y estables, respectivamente, y se siguieron los cambios espectrales durante 4 horas a tres valores de pH. Tanto el espectro UV-visible (con la banda de Soret a 407 & # 160 nm y los máximos pequeños a 502 y 640 & # 160 nm) como el espectro CD (con los mínimos de elipticidad de 208 y 222 & # 160 nm) se mantuvieron básicamente sin cambios durante la incubación a pH & # 1605 ( espectros no mostrados). Sin embargo, las condiciones ácidas / alcalinas provocaron fuertes modificaciones de los espectros de MnP3 y sólo ligeros cambios en los de MnP4. Este último mostró una disminución muy leve de la banda de Soret a pH & # 1603 (Figura & # 160 2 B) pero una modificación apreciable del espectro de CD a pH & # 1608 (Figura & # 160 2 C), de acuerdo con la disminución parcial de actividad. a pH alcalino. Sin embargo, una incubación de pH & # 1603 de MnP3 resultó inmediatamente en la pérdida de la banda de Soret, la aparición de una banda ancha a 373 & # 160 nm (que disminuyó con el tiempo) y el desplazamiento de los máximos visibles a 571 y 674 & # 160 nm ( Figura & # 160 2 B). Sorprendentemente, aunque la inactivación de MnP3 fue más drástica a pH & # 1608, los cambios espectrales UV-visibles fueron menos evidentes, consistiendo en un ligero desplazamiento de la banda de Soret a 413 & # 160nm y la aparición de nuevos máximos a 530 y 571 & # 160nm (Figura & # 160 2 B). Sin embargo, el espectro CD de MnP3 se modificó significativamente durante la incubación a pH & # 1608 con desplazamiento del mínimo principal de 222 a 208 & # 160 nm, mientras que los cambios espectrales fueron menos intensos a pH & # 1603 (Figura & # 160 2 C).

Estabilidad de temperatura de los POD de P. ostreatus

La estabilidad térmica de los nueve POD se investigó midiendo la actividad residual después de 10 minutos (Figura & # 160 3 A) y 4 horas (Figura & # 160 3 B) de incubación en el rango de 25 a 70 & # 176C (a pH & # 1605) . La actividad T50 los valores promediaron 54 & # 176C y 44 & # 176C después de 10 minutos y 4 horas de incubación, respectivamente (los valores individuales se incluyen en el archivo adicional 2: Tabla S2). VP1 es el POD más estable que retiene más del 80% de actividad después de 10 minutos hasta 60 & # 176C, seguido de MnP4, VP3, MnP1 y VP2 (aunque la estabilidad de VP2 disminuyó drásticamente con el tiempo de incubación). En general, los VP fueron más estables que los MnP en ambos 10 minutos (T promedio50 actividades valores de 56 & # 176C y 46 & # 176C, respectivamente) y 4 horas de incubación (T promedio50 actividades valores de 46 & # 176C y 43 & # 176C, respectivamente).

Estabilidades térmicas de los nueve POD del genoma de P. ostreatus

Estabilidades térmicas de los nueve POD del P. ostreatus genoma. (A, B) Actividades residuales después de 10 minutos y 4 horas de incubación, respectivamente, en el rango de 25 a 70 ° C. Las actividades residuales se determinaron como se describe en la Figura & # 160 2 después de 10 minutos y 4 horas de incubación en tartrato 10 & # 160 mM (pH & # 1605) a diez temperaturas (intervalos de 5 & # 176ºC). Medias y límites de confianza del 95%. De las curvas anteriores, el & # 160T de 10 minutos y 4 horas50 actividades Se obtuvieron los valores (Archivo adicional 2: Tabla S2). (CD) Desnaturalización de MnP3 inestable a la temperatura y VP1 estable, respectivamente, como se muestra por espectroscopía UV-visible (azul) y CD (verde), en comparación con la actividad perdida (rojo). El efecto de la temperatura (25 a 70 & # 176C) se muestra por el & # 952 aumento a 222 & # 160nm en los espectros de CD adquiridos cada 0.5 & # 176C, la disminución de absorbancia en el máximo de Soret (a 407 & # 160nm) en el UV- los espectros visibles adquiridos cada 5 ° C y la disminución de la actividad residual de la enzima después de 10 minutos de incubación, estimada como se describe en la Figura ° 160 2. Todas las mediciones se realizaron en tartrato 10 & # 160 mM (pH & # 1605). T50 valores correspondientes a aquellas temperaturas donde 50% de desnaturalización de proteínas (transición de fusión principal) se muestra mediante espectros de CD (Tmetro), La disminución del 50% de la banda de Soret hem se muestra mediante espectros UV-visible (T50-Soret), y se produce una disminución del 50% de la actividad enzimática (T50 actividades medias y límites de confianza del 95%). CD, dicroísmo circular MnP, peroxidasa de manganeso POD, peroxidasa de clase II de la superfamilia de peroxidasas no animales (planta-hongos-procariotas) VP, peroxidasa versátil.

En el VP1 térmicamente estable, el Soret y los máximos visibles y el espectro de CD se modificaron solo ligeramente en el rango de 25 a 60 ° C, pero se produjeron cambios más fuertes en el MnP3 inestable a la temperatura. A temperaturas más altas, MnP3 produjo un espectro UV-visible plano, mientras que todavía se observó un pico amplio alrededor de 400 & # 160nm en VP1 a 70 & # 176C, y el espectro de CD de VP1 perdió el mínimo de 222 & # 160nm (como ya se encontró para MnP3 a temperaturas más bajas ).Los diferentes cursos de temperatura de los cambios anteriores en los espectros de MnP3 y VP1 se ilustran en la Figura & # 160 3 C y D, respectivamente, que presenta la pérdida de estructura secundaria (hélice) (como se muestra por los cambios de elipticidad en el CD de 222 & # 160nm mínimo) y la modificación del entorno hemo (como lo muestra la disminución de la banda de Soret) junto con la pérdida de actividad catalítica. Las diferencias entre MnP3 y VP1 fueron más importantes para la pérdida de estructura proteica (con Tmetro para la transición principal de 47 & # 176C y 59 & # 176C, respectivamente), que es paralelo a los perfiles de inactivación (con T50 actividades de 51 & # 176C y 63 & # 176C, respectivamente), que por la pérdida del cofactor hemo (con más similar T50-Soret valores de 62 & # 176C y 65 & # 176C, respectivamente).

Estructuras moleculares de VP1 y MnP4

P. ostreatus VP y MnP se cristalizaron y sus estructuras completas se describen comparativamente por primera vez (la recopilación de datos y las estadísticas de refinamiento se proporcionan en el archivo adicional 2: Tabla S3). Las dos estructuras resueltas corresponden a las isoenzimas más estables a los extremos de temperatura (VP1) y pH (MnP4), entre las nueve POD de P. ostreatus (Protein Data Bank, PDB, entradas [PDB: 4BLK] y [PDB: 4BM1], respectivamente ).

Principales diferencias en la arquitectura molecular general

La estructura general de VP1 y MnP4 mostró un grupo hemo que divide la proteína en un dominio distal en gran parte helicoidal (formado por cuatro hélices principales y dos a tres pequeñas) con un ión de calcio estructural y un dominio proximal compuesto por otras seis hélices y un región no ordenada estabilizada por un segundo ion calcio. Además de la similitud general entre los dos POD, se pudieron ver varias diferencias, las más significativas se muestran (en colores más oscuros) en la Figura & # 160 4 A.

Estructuras cristalinas de las isoenzimas VP / MnP más interesantes del genoma de P. ostreatus (1.05 a 1.10 & # 160 & # 197)

Estructuras cristalinas de las isoenzimas VP / MnP más interesantes del P. ostreatus genoma (1.05 a 1.10 & # 160 & # 197). (A) Superposición de las estructuras generales de VP1 (azul claro) y MnP4 (marrón claro) desde dos orientaciones diferentes. Las diferencias significativas entre las estructuras se muestran en un color más oscuro con algunas cadenas laterales de estas regiones como palos. (B) Superficie electrostática de VP1 y MnP4 desde dos orientaciones diferentes que muestran el canal de acceso del hemo principal (círculo más grande) y el canal de acceso Mn 2+ más estrecho (círculo más pequeño), así como la superficie de MnP4 más básica con un alto número de residuos de lisina expuestos. (C) Detalle de las regiones hem y vecinas de VP1 y MnP4 que muestran: histidina proximal (H169 y H175, respectivamente) histidina distal (H47) y arginina vecina (R43) dos fenilalaninas conservadas en el lado de histidina proximal (F186 y F182, respectivamente) y el lado distal lado de histidina (F46) del hemo dos asparaginas conservadas (N78 y N84, respectivamente) y residuos de glutamato (E72 y E78, respectivamente) que forman una red de enlaces H de la histidina distal dos iones estructurales de Ca 2+ (esferas marrones) con sus cuatro / cinco ligandos conservados un sitio para la oxidación de Mn 2+ (cuya posición predicha está marcada con un círculo rojo) cerca del propionato interno del hemo, formado por dos glutamatos (E36 y E40) y un aspartato (D175 y D181, respectivamente) un residuo de triptófano (W164) que constituye el sitio (marcado con un anillo bencénico rojo) de VP1 oxidación de sustratos aromáticos por LRET a través de un residuo de leucina contiguo (L165) y varias moléculas de agua (esferas blancas) cerca de la histidina distal y Ca 2+ iones. De las entradas [PDB: 4BLK] (VP1) y [PDB: 4BM1] (MnP4). LRET, transferencia de electrones de largo alcance MnP, peroxidasa de manganeso PDB, VP del banco de datos de proteínas, peroxidasa versátil.

La primera diferencia estaba en el dominio superior, cerca del ion calcio (Figura & # 160 4 A, izquierda). En este sitio, el bucle P56 a G59 de VP1 presenta una inserción de seis residuos en MnP4 que forma una pequeña hélice adicional que sobresale en el disolvente. Además, los residuos A130 y V131 en esta región VP1 adoptaron una conformación diferente con respecto a V135 y T136 en MnP4 (Figura & # 160 5 A y archivo adicional 1: Figura S6A). Estos cambios permiten que la cadena lateral hidrófoba F62 de MnP4 interactúe con K137 y, debido a esta interacción, el grupo hidroxilo de T136 interactúa con una de las aguas que coordina el ion calcio distal. La hélice adicional anterior también se predice en los modelos de homología de VP2, MnP2 y MnP6.

Comparación de tres regiones en las estructuras cristalinas de VP1 (azul) y MnP4 (marrón) y el entorno de triptófano catalítico en VP1 y regiones homólogas en MnP4 y MnP1

Comparación de tres regiones en las estructuras cristalinas de VP1 (azul) y MnP4 (marrón) y el entorno de triptófano catalítico en VP1 y regiones homólogas en MnP4 y MnP1. (A) Bucle cerca del calcio distal y sus ligandos, incluidas dos moléculas de agua (esferas de luz) y las diferencias en la región VP1 / MnP4 D129 a A132 / N134 a K137, incluida la interacción MnP4 K137 con la cadena lateral F62. (B) Dos tramos de secuencia (V248 a P252 y P286 a H293 en VP1, e I254 a S259 y R292 a P298 en MnP4) en la parte posterior de la proteína con indicación de los residuos que difieren en las dos peroxidasas (el cofactor hemo, Ca 2+ proximal , esferas y sus ligandos, y VP1 W164 también son visibles). (C) Residuos seleccionados y superficie de acceso al disolvente en el canal de acceso del hemo VP1 y MnP4 y el área circundante (las diferencias en la electronegatividad de la superficie debajo de la entrada del canal se indican con círculos). (D) Estructura (abajo) y superficie electrostática (arriba) que muestra el triptófano catalítico y los residuos circundantes de VP1 (incluidos G260 y F197, entre otros) en comparación con la misma región en MnP1 (incluidos D261 e I198) y MnP4 (incluidos R266 y F203) ( los círculos verdes representan la posición del triptófano conservado en VP1 y MnP1, o la alanina correspondiente en MnP4). A partir de las entradas [PDB: 4BM1] (MnP4) y [PDB: 4BLK] (VP1), y el modelo de homología de MnP1 basado en [PDB: 4BLK]. MnP, manganeso peroxidasa PDB, Protein Data Bank VP, peroxidasa versátil.

También se encontraron diferencias significativas en el principal canal de acceso hemo. Incluyen cuatro cambios en la boca superior de este canal (P76 a A82, A79 a N85, K176 a T182 y V177 a I183 en VP1 y MnP4, respectivamente) (Figura & # 160 4 C y Archivo adicional 1: Figura S6B). El resultado es que el canal es más ancho y el hemo es más accesible en VP1 que en MnP4 (círculos más grandes en la Figura & # 160 4 B). Otra diferencia se encuentra en el borde inferior del canal (Figura & # 160 5 C). El primer cambio fue N214 (VP1) a H220 (MnP4), ya que la histidina ocupa un volumen mayor que conduce a un cambio de la región D184 a K186. El cambio anterior también afecta a D217, que se desplaza hacia el exterior en MnP4 con respecto a T211 en VP1. Otro cambio afecta a I214 en MnP4 (F208 en VP1), cuya cadena lateral más pequeña permite que L219 se oriente hacia la superficie, mientras que en VP1 la cadena lateral grande de fenilalanina obliga a D213 a exponerse al disolvente. El último cambio en esta región se refiere a S180 en VP1, que está ocupado por K186 en MnP4, lo que afecta tanto a la forma de la superficie como a la carga. El labio inferior en VP1 presenta una carga negativa clara y la forma de un depósito ancho, mientras que en MnP4 muestra una superficie menos cargada con un surco estrecho (círculos en la Figura & # 160 5 C). Las diferencias anteriores podrían afectar la oxidación del sustrato en el canal de acceso del hemo.

Otra diferencia entre VP1 y MnP4 se encuentra en la parte posterior de la proteína (Figura & # 160 4 A, derecha), con respecto al canal de acceso del hemo. Afecta a dos tramos de secuencia (V248 a P252 y P286 a H293 en VP1, e I254 a S259 y R292 a P298 en MnP4) con diferentes disposiciones conformacionales (Figura & # 160 5 B y archivo adicional 1: Figura S6C y D). La primera secuencia está cerca del triptófano catalítico de VP1 (W164) y la segunda cerca del sitio de unión al calcio proximal. La mayor diferencia en el primer tramo es el cambio de Q251 en VP1 a P257 en MnP4, pero los cambios en el segundo tramo son más pronunciados. La mayoría de ellos implican el cambio de pequeñas cadenas laterales hidrófobas en VP1 por grandes cadenas laterales hidrófilas, como la sustitución de G290 en VP1 por K296 en MnP4. Esta lisina tiene interacciones con D198 y D200, que están directamente involucrados en la coordinación del calcio proximal.

Las diferencias en la carga superficial afectan no solo al entorno del canal hemo principal. Cuando se resolvió la estructura cristalina de MnP4, una observación sorprendente fue el alto número de lisinas expuestas al disolvente (un total de 20) y otros residuos básicos (hasta un total de 34) (Figura & # 160 4 B). Por el contrario, VP1 tiene solo nueve lisinas y un total de 21 residuos básicos de superficie. El número de residuos básicos expuestos en los nueve POD de P. ostreatus varía en el rango de 18 a 35, mientras que el de los residuos ácidos expuestos apenas varía (rango de 29 a 37). Las diferencias anteriores se correlacionan con la proteína pI, que es al menos una unidad más alta en MnP4 (archivo adicional 2: Tabla S2). Por otro lado, cuando se analizaron las interacciones entre los residuos que ocupan la superficie molecular, se observó un mayor número de enlaces H y puentes salinos en MnP4 que en VP1, que estabilizan los bucles (enlace H E92 a S75) y conectan hélices y bucles (R245 conectado con T152 y D243, y E238 con R233).

Entorno hemo y sitios de unión de Ca 2+

Un total de 28 residuos componen el bolsillo hem de las dos proteínas cristalizadas (archivo adicional 1: Figura S7), la mayoría de ellos conservados excepto cuatro (I171, A174, K176 y V177 en VP1, siendo V177, Q180, T182, e I183 en MnP4, respectivamente). El primer cambio, I171 a V177, se ubicó lejos de la entrada al canal de acceso al hemo, mientras que los otros tres cambios se ubican cerca o en el canal de acceso al hemo y modifican la accesibilidad al cofactor. Entre los cambios anteriores, V177 en VP1 a I183 en MnP4 elimina uno de los enlaces H hemo-apoenzima. Las diferencias anteriores en los residuos del bolsillo hemo están acompañadas por el cambio de I226 en VP1 a F232 en MnP4, en estrecho contacto con A174 y Q180, respectivamente. El mayor volumen de estos dos residuos en MnP4 empuja hacia afuera el bucle que forma el labio inferior del canal de acceso del hemo (Figura & # 160 5 C).

El entorno hemo en VP1 y MnP4 (Figura & # 160 4 C) incluye una histidina proximal (H169 y H175, respectivamente) que actúa como el quinto ligando del hierro hemo, y una histidina distal (H47 en ambas enzimas) que establece enlaces H con varios residuos de bolsas de hemo y moléculas de agua. El agua ubicada entre el hierro y la histidina distal mostró una densidad alargada en ambas estructuras (archivo adicional 1: Figura S7B y D), lo que podría indicar múltiples conformaciones para esta molécula (que también se une a R43 conservado). Los residuos contiguos a las histidinas proximales y distales en VP1 (S170 y D48, respectivamente) y MnP4 (S176 y D48, respectivamente) participan en la coordinación de los dos iones Ca 2+ presentes en la estructura, junto con otros cuatro residuos en el lado proximal. , y tres residuos más dos moléculas de agua en el lado distal (todos ellos a una distancia de 2.4 a 2.5 & # 160 & # 197) (Figura & # 160 4 C). Los ligandos de calcio se conservan excepto VP1 V192, que en MnP4 es D198. Tanto la histidina proximal de VP1 y MnP4 como la serina de unión a Ca 2+ contigua están en la misma hélice, mientras que otro ligando de Ca 2+ (D194 y D200, respectivamente) es contiguo a la hélice siguiente. Por tanto, este ion Ca 2+ estabiliza la posición de la histidina proximal. De manera similar, el segundo ion Ca 2+ fijaría la hélice donde se ubica la histidina distal. Los residuos de unión de Ca 2+ también se conservan en los otros siete POD de P. ostreatus, excepto sólo los homólogos de VP1 Ser170 y Val192 (pero tenga en cuenta que en estos dos casos los carbonilos de la columna vertebral son los ligandos de Ca 2+) (Figura & # 160 1 y archivo adicional 2: Tabla S2).

Sitios de oxidación del sustrato

Tanto los VP como los MnP pueden oxidar Mn 2+ (Tabla & # 160 1). El sitio donde esto ocurre se conserva y comprende tres residuos ácidos (E36 / E40 / D175 en VP1 y E36 / E40 / D181 en MnP4) ubicados cerca del propionato de hemo ocupando la posición más interna con respecto al canal de acceso principal (Figura & # 160 4 C). Este propionato es accesible al disolvente por un segundo canal de acceso estrecho (círculos más pequeños en la Figura & # 160 4 B) que se abre en una región cargada negativamente, aproximadamente a 15 & # 160 & # 197 del canal de acceso principal. El sitio de oxidación Mn 2+ se conserva en todos los P. ostreatus MnP y VP, como se muestra en los modelos de homología (archivo adicional 1: Figura S2).

Además del sitio de oxidación de Mn 2+, las VP también presentan un sitio de oxidación de lignina, cuya presencia se detectó usando VA y RB5 como sustratos (Tabla & # 160 1). Este sitio en VP1 consistiría en W164, conectado al grupo hemo a través de una transferencia de electrones de largo alcance (LRET) (Figura & # 160 4 C). La cadena lateral indólica de W164 en VP1 está ampliamente expuesta (Figura & # 160 5 D, centro), lo que permite la colección de electrones de la voluminosa molécula de lignina. La oxidación de sustratos relacionados con la lignina no se detectó en MnP4, donde el triptófano activo es sustituido por una alanina (Figura & # 160 5 D, izquierda). La misma sustitución ocurre en MnP3 y MnP5, mientras que un ácido aspártico ocupa esta posición en MnP2 y MnP6 (archivo adicional 1: Figura S2). Sin embargo, el VP1 W164 se conserva en los otros dos VP (como VP2 W170 y VP3 W164). Además, existe un supuesto sitio de oxidación de lignina (en W165) en MnP1, pero la enzima no pudo oxidar VA y RB5.

Mutagénesis dirigida de P. ostreatus POD

Los sitios putativos de oxidación de Mn 2+ y lignina identificados en las estructuras cristalinas fueron confirmados por mutagénesis dirigida al sitio de los tres residuos ácidos cerca del propionato de hemo interno y del triptófano expuesto (Archivo adicional 2: Tablas S4 y S5). La capacidad de oxidar Mn 2+ desapareció por completo después de las mutaciones simples E36A, E40A o D179A en MnP4, y también después de la mutación doble E35A / E39A en VP1 (las variantes simples E35A, E39A y D175A VP1 perdieron más del 99,8% de sus eficiencia catalítica pero retuvo actividad detectable sobre Mn 2+). De manera similar, la mutación W164S en VP1 resultó en una pérdida completa de actividad en VA y RB5 (usados ​​como dos compuestos modelo de lignina simples). Por el contrario, las variantes VP1 E35A, E39A y E175A (así como las variantes dobles E35A / E39A) mantuvieron constantes cinéticas sin cambios para la oxidación de VA y RB5, y las de W164A en Mn 2+ solo se modificaron ligeramente.

Un caso especial fue la isoenzima MnP1. Esta proteína presenta la característica de triptófano expuesto de las VP (MnP1 W165) pero no tiene actividad sobre VA o RB5. Un modelo molecular de MnP1 mostró que la mayoría de los residuos expuestos que rodean al triptófano conservado (W164 en VP1 y W165 en MnP1) se conservaron, pero el pequeño G260 en VP1 fue sustituido por un aspartato (D261) en MnP1 (Figura & # 160 5 D, Derecha). Esto influyó en la forma de la superficie y la carga del entorno de triptófano y, por lo tanto, podría influir en la unión del sustrato (Figura & # 160 5 D, arriba). Otras diferencias afectan a los residuos ubicados entre W165 y el cofactor hemo (Figura & # 160 5 D, parte inferior). Entre ellos, la sustitución de F197 en VP1 por I198 en MnP1 parece especialmente relevante ya que este residuo se conserva en todos los demás POD de P. ostreatus (Figura & # 160 1). Por lo tanto, se incorporaron las mutaciones simples y dobles de MnP1 D261G e I198F, y las constantes cinéticas se compararon con las de MnP1 y VP1 nativas (Archivo adicional 2: Tabla S6). También se incluyó en la comparación un Pleurotus pulmonarius POD, que se había clasificado como VP pero que tiene un ambiente de triptófano conservado similar al de P. ostreatus MnP1. Como se sospechaba, la enzima de P. pulmonarius no pudo oxidar VA y RB5 y, por lo tanto, debe reclasificarse como MnP. Con respecto a MnP1, la mutación D261G no modificó las propiedades catalíticas, lo que indica que la unión deficiente al sustrato no es la razón de la falta de actividad. Sin embargo, la mutación I198F, aunque no fue suficiente para conferir la capacidad de oxidar VA, proporcionó a MnP1 la capacidad de oxidar el segundo sustrato de VP de alto potencial redox, RB5 (con K metro 2.3 & # 8201 & # 177 & # 82010.4 & # 160 & # 956M, k gato 10.0 & # 8201 & # 177 & # 82010.8 & # 160s -1, yk gato/ K metro 4270 & # 8201 & # 177 & # 8201410 & # 160s -1 .mM -1) y se obtuvo el mismo resultado con la mutación doble (I198F / D261G).

Degradación del modelo de lignina por P. ostreatus VP

El repertorio de POD en P. ostreatus incluye VP y MnP funcionales, pero carece de LiP degradantes de lignina a pesar de que el hongo es ligninolítico. Para buscar una explicación de esta discrepancia, tratamos un dímero modelo de lignina no fenólico & # 946-O-4 & # 8217 (marcado con 14 C para facilitar la detección del producto) con P. ostreatus VP1 en presencia de H limitante2O2 para prevenir la inactivación de enzimas. Los resultados mostraron que se produjo la degradación oxidativa del compuesto modelo (Figura & # 160 6 A). Ambos Cα-Cβ escisión del enlace que libera 4-etoxi-3-metoxibenzaldehído (pico 2) y Cα se obtuvo la oxidación resultante en la correspondiente cetona dimérica (pico 3). Cantidades menores del producto fenilglicerol de Cβ-JEFE4& # 8217 escisión del enlace éter (pico 5) y la correspondiente Cα-Cetona (pico 4) también se obtuvieron. El experimento se realizó en los dos estereoisómeros del dímero modelo, y la oxidación de VP1 dio como resultado una C relativamente más altaα-Cβ escisión del enlace de la forma eritro (línea de puntos) y C superiorα oxidación de la forma treo (línea discontinua).

Demostración de la capacidad de degradación de la lignina de P. ostreatus VP

Demostración de la capacidad de degradación de la lignina de P. ostreatus VP. (A) Degradación oxidativa de un dímero modelo de lignina no fenólico por VP1. Los isómeros eritro (línea de puntos) y treo (línea de trazos) de 4-etoxi-3-metoxifenilglicerol - y # 946-guaiacil éter (pico 1) marcado con 14C se trataron con VP1, y las reacciones completadas se analizaron por HPLC. Los productos principales fueron 4-etoxi-3-metoxibenzaldehído (pico 2) y 1- (4-etoxi-3-metoxifenil) -3-hidroxi-2- (2-metoxifenoxi) -propan-1-ona (pico 3). Los picos menores 4 y 5 corresponden a 1- (4-etoxi-3-metoxifenil) -2,3-dihidroxipropan-1-ona y 1- (4-etoxi-3-metoxifenil) glicerol, respectivamente. (ANTES DE CRISTO) Despolimerización de lignina por VP1. Se trató lignina sintética (DHP) marcada con 14 C con VP1 del genoma de P. ostreatus en presencia (B) y ausencia (C) de VA. Los símbolos negros indican reacciones con enzima y los símbolos abiertos indican controles sin enzima.Las recuperaciones totales de 14 C inicialmente añadido de reacciones completas antes del análisis de GPC fueron del 62% para la reacción B y del 92% para la reacción C. Las recuperaciones de las reacciones de control fueron algo más altas como se informó anteriormente 22. Las flechas indican los volúmenes de elución de dos patrones de masa molecular de poliestireno (1.800 y 500 & # 160Da) y VA (168 & # 160Da). DHP, polímero de deshidrogenación GPC, cromatografía de permeación en gel HPLC, cromatografía líquida de alta resolución VA, alcohol veratrílico VP, peroxidasa versátil.

Más importante aún, cuando una lignina sintética marcada con & # 946-14 C (polímero de deshidrogenación, DHP) se trató con VP1 en presencia de VA y luego se analizó mediante cromatografía de permeación en gel (GPC) (Figura & # 160 6 B), despolimerización significativa de la lignina (símbolos negros), como se muestra por la producción de productos de baja masa molecular (cerca de la posición del marcador 168 & # 160Da). La despolimerización no ocurrió en el experimento de control sin enzima (símbolos blancos). En contraste con los resultados obtenidos con el dímero modelo (Figura & # 160 6 A), la despolimerización de la lignina por VP1 requirió la presencia de VA, ya que no se observaron cambios significativos cuando se trató la DHP en ausencia de este compuesto mediador (Figura & # 160 6 C).

Caracterización de VP y MnP del genoma de P. ostreatus

VP y estructuras cristalinas cortas de MnP

Las estructuras cristalinas de VP1 y MnP4 se resolvieron como representativas de las dos familias de POD presentes en el genoma de P. ostreatus. Varios aspectos de la estructura cristalina de P. eryngii VP se discutieron al estudiar los sitios catalíticos de esta enzima [29, 32, 35], aunque no se informó una descripción comparativa de toda la estructura de VP. Por otro lado, la estructura molecular de MnP largo de P. chrysosporium se ha informado a diferentes resoluciones 36, 37, 38, pero no se disponía de estructura cristalina para un MnP corto antes del presente estudio.

En cuanto al MnP corto, cuya estructura cristalina ahora se resuelve por primera vez (de P. ostreatus MnP4), su principal diferencia estructural con el MnP largo de P. chrysosporium se refiere a la existencia de un sitio de oxidación del Mn más expuesto, debido a la ausencia del C -extensión terminal que en P. chrysosporium MnP (con un total de 357 residuos) está parcialmente fijada por un quinto puente disulfuro. Queda por confirmar si esta diferencia, que se utiliza para definir la nueva subfamilia de MnP cortos de los genomas 16, subyace a la baja pero significativa actividad independiente de Mn (en ABTS) exhibida por estos y otros MnP cortos. Otras características de la estructura de MnP4, como el alto número de residuos básicos expuestos y enlaces H / puentes salinos, y las diferencias en el entorno de los dos iones estructurales de Ca 2+, se analizan a continuación en relación con los POD & # 8217 estabilidad del pH.

Propiedades catalíticas de las isoenzimas POD

Diferentes estabilidades de las isoenzimas POD

Relaciones evolutivas de los POD de basidiomicetos

Filograma de 237 secuencias de POD de basidiomicetos, incluidas las nueve secuencias del genoma de P. ostreatus (subrayado)

Filograma de 237 secuencias de POD de basidiomicetos, incluidas las nueve secuencias de P. ostreatus genoma (subrayado). Se analizaron las secuencias de POD de 21 genomas (y GenBank). Se identificaron cuatro grupos principales correspondientes a LiP (A), Clústeres 1 y 2 de MnP-short / VP (B, C)y MnP-long (D), junto con el grupo de médicos de cabecera más ancestral y secuencias no agrupadas. Se colapsaron aquellos conglomerados / subgrupos en los que no se incluyeron secuencias de Pleurotus (PLEOS, P. ostreatus PLEER, P. eryngii PLEPU, P. pulmonarius y PLESA, P. sapidus), con indicación del número y tipo de secuencias incluidas. Se indican dos enzimas de tipo LiP de G. subvermispora que representan las etapas de transición 47 de LiP / VP, así como una MnP de Cerrena unicolor (AFK91532) relacionada con las MnP cortas de P. ostreatus y la única LiP de Trametes cervina (BAD52441). MnP-atípico corresponde a un tipo de MnP con sólo dos residuos ácidos en el sitio de oxidación 16. Se proporcionan números de modelo de proteína para las nueve secuencias del genoma de P. ostreatus y referencias de GenBank para otras seis secuencias de POD. Consulte Ruiz-Due & # 241as y Mart & # 237nez 19 para obtener referencias de otros POD de basidiomicetos. GP, peroxidasa genérica LiP, lignina peroxidasa MnP, peroxidasa de manganeso POD, peroxidasa de clase II de la superfamilia de peroxidasas no animales (plantas-hongos-procariotas) VP, peroxidasa versátil.

Los POD de P. ostreatus se encuentran en los otros dos grupos, ambos con secuencias cortas de MnP y VP, de acuerdo con una mayor identidad de secuencia de MnP cortas con VP que con MnP largas de P. chrysosporium y otros hongos (consulte el archivo adicional 2: Tabla S7 ). El grupo C incluye P. ostreatus MnP2, MnP4 y MnP6, junto con otras MnP cortas y un grupo de VP. El grupo B está constituido por: i) un grupo Pleurotus formado por los otros seis genomas POD y cinco secuencias más de GenBank ii) un segundo grupo de MnP / VP cortos y iii) MnP cortos no agrupados y dos intermedios LiP / VP 47. Dentro del grupo Pleurotus, P. ostreatus VP1 está estrechamente relacionado con P. eryngii VPL, el VP 29 35 mejor caracterizado (97% de identidad), y con los únicos VP de Pleurotus sapidus y P. pulmonarius, lo que sugiere que las cuatro secuencias corresponden a la misma isoenzima en cuatro especies relacionadas. Además, P. ostreatus VP2 se agrupa con P. eryngii VPS1, el segundo VP 28 clonado (98% de identidad), lo que revela que ambos son también la misma isoenzima, y ​​lo mismo ocurre con P. ostreatus MnP1 y P. pulmonarius MnP ( 96% de identidad de secuencia). Como se discutió, las características estructurales de los dos últimos MnP sugieren un origen secundario de una enzima de tipo VP ancestral que, según el filograma, podría estar relacionada con P. ostreatus VP3.

POD de P. ostreatus: demostración de ligninolisis

El presente estudio genómico establece la ausencia de LiP en un hongo ligninolítico de pudrición blanca, P. ostreatus, de acuerdo con el análisis in silico de su genoma, que indicó la presencia de solo genes VP y MnP. Además, demostramos por primera vez las capacidades ligninolíticas de uno de estos VP, demostrando que es capaz de: i) escindir los enlaces interunitarios más frecuentes en la lignina (& # 946-O-4 & # 8217 estructuras de éter) y ii) despolimerizar la lignina. Estas capacidades son similares a las reportadas para P. chrysosporium LiP en términos de reacciones y productos obtenidos 22. En cuanto a las MnP, también proporcionamos evidencia sobre la actividad dual mediada por Mn e independiente de Mn de las llamadas MnP cortas encontradas en P. ostreatus, cuya presencia había sido reportada en varios genomas de hongos 16 sin los correspondientes estudios catalíticos.

Mostramos la existencia, en P. ostreatus, de un repertorio de POD constituido por VPs y MnPs, asumiendo las primeras peroxidasas el papel de las LiPs en P. chrysosporium (y la mayoría de los otros hongos de pudrición blanca). Esta diferente maquinaria enzimática está muy probablemente relacionada con la diferente posición filogenética de los dos hongos, que se encuentran en los órdenes Agaricales y Polyporales, respectivamente. Parece que la historia evolutiva de POD en los Agaricales no incluyó la transición final de las enzimas VP a LiP a través de la pérdida del sitio de oxidación Mn 2+, como ocurrió en el Polyporales 46.

Como resultado del cribado genómico actual, pudimos: i) mostrar la presencia en el modelo agárico de P. ostreatus de un repertorio de peroxidasa en el que los VP desempeñan el papel que desempeñan los LiP en los polímeros de podredumbre blanca ii) describir las propiedades catalíticas de P. ostreatus MnPs, como representantes de una nueva subfamilia de peroxidasa iii) establecen las relaciones evolutivas de las enzimas anteriores con las otras POD de basidiomicetos iv) describen la primera estructura cristalina de un MnP corto, que se comparó con la estructura VP resuelta yv) demuestran la existencia de estabilidades térmicas y de pH fuertemente divergentes entre una amplia gama de isoenzimas POD codificadas por genes duplicados.

Cepas de hongos y secuenciación del genoma

Se aislaron monokaryons PC9 (CECT20311) y PC15 (CECT20312) de P. ostreatus N001 (CECT20600), y sus secuencias de ADN genómico obtenidas en JGI en un proyecto coordinado por AG Pisabarro (Universidad Pública de Navarra, Pamplona, ​​España). Se prevé que los conjuntos de 35,6 Mbp (PC9 v1.0) y 34,3 Mbp (PC15 v2.0) incluyan 12,206 y 12,330 modelos de genes, respectivamente (los resultados están disponibles para su búsqueda en http://genome.jgi.doe.gov/ PleosPC15_2 / PleosPC15_2.home.html y http://genome.jgi.doe.gov/PleosPC9_1/PleosPC9_1.home.html).

Detección y análisis del genoma de modelos de peroxidasa

El inventario final de genes de hemo peroxidasa en el genoma de P. ostreatus se obtuvo mediante: i) cribado de los genomas anotados automáticamente ii) revisando y curando manualmente las posiciones de los intrones y los extremos N y C, utilizando SignalP 3.0 (Center for Biological Sequence Análisis, Kongens Lyngby, Dinamarca) para predecir péptidos señal iii) comparar las secuencias de aminoácidos predichas con peroxidasas relacionadas, después de una alineación múltiple con MEGA5 (Centro de Medicina e Informática Evolutiva, Tempe, AZ, EE. UU.) Y iv) confirmar la presencia de la característica residuos en el bolsillo del hemo y los sitios de oxidación del sustrato, después del modelado de homología en el servidor Swiss-Model (Protein Structure Bioinformatics Group, Swiss Institute of Bioinformatics y Biozentrum de la Universidad de Basilea, Basilea, Suiza) utilizando las estructuras cristalinas de P. eryngii VPL ([PDB: 3FJW]) y P. ostreatus MnP4 (este estudio) como plantillas. Finalmente, las secuencias POD revisadas del genoma secuenciado se compararon con todas las secuencias POD de basidiomicetos disponibles (hasta un total de 237 secuencias de 21 genomas y GenBank) y se construyeron filogramas con MEGA5, utilizando distancias corregidas de Poisson y un grupo de pares no ponderados. método con agrupación de media aritmética (UPGMA) (los árboles de consenso de arranque se infirieron a partir de 1.000 réplicas).

Las secuencias codificantes de proteínas maduras revisadas de los nueve genes POD (modelos 156336, 199510, 199511, 1041740, 1089546, 1096331, 1099081 y 1113241 de PC15, y modelo 137757 de PC9) fueron sintetizadas por ATG: biosynthetics (Merzhausen, Alemania) tras comprobar que todos los codones se habían utilizado previamente para expresar otros genes en las mismas cepas de E. coli (y sustituirlos cuando fuera necesario). También se sintetizó un gen que codifica MnP de P. pulmonarius ([GenBank: AAX40734]) para comparación.

Las mutaciones I198F y D261G se introdujeron en el gen de P. ostreatus MnP1 (109633) mediante PCR utilizando el plásmido de expresión pFLAG1-109633 (véase más adelante) como plantilla, y el kit QuikChange de Stratagene (La Jolla, CA, EE. UU.). El 5 & # 8242- CG CCA AAC CTT TTC GAT TCA CAA TTC TTC ATC GAG ACG C & # 87223 & # 8242 (I198F) y 5 & # 8242- C CGC TTC TCC GGA ACG CTG TTC AAG ATG TCG & # 87223 & # 8242 (D261G ) cebadores directos (codones mutados en cursiva), y se sintetizaron los cebadores inversos que llevan las secuencias complementarias. La reacción de PCR (volumen 50 & # 160 & # 956l) se llevó a cabo en un termociclador Eppendorf (Hamburgo, Alemania) Mastercycler pro S usando 20 & # 160 ng de ADN molde, 500 & # 160 & # 956M cada uno de dNTP, 125 & # 160 ng con cebadores directos e inversos , 2,5 unidades de polimerasa Pfu Turbo (Stratagene) y el tampón & # 8217s del fabricante. Las condiciones de reacción incluyeron: i) un ciclo de inicio de 1 minuto a 95 & # 176C ii) 18 ciclos de 50 segundos a 95 & # 176C, 50 segundos a 55 & # 176C y 10 minutos a 68 & # 176C y iii) un ciclo final de 10 minutos a 68 & # 176C. El gen mutado se expresó en E. coli y se purificó al igual que los genes de tipo salvaje.

Las nueve secuencias codificantes del genoma de P. ostreatus y las únicas secuencias codificantes de POD maduras de P. pulmonarius, junto con las dos secuencias mutadas de P. ostreatus MnP1 (10963331), se clonaron en los vectores de expresión pFLAG1 (International Biotechnologies Inc, Kodak, CT, EE. UU. ) o pET23a (+) (Novagen, Darmstadt, Alemania) y los plásmidos resultantes (pET23a-156336, pET23a-1099081, pET23a-1041740, pFLAG1-137757, pFLAG1-199511, pFLAG1-199510, pFLAG1-1089546, pFLAG1-1113241, pFLAG1-1096331 y pFLAG1-AAX40734) se utilizaron para la expresión.

Las peroxidasas se produjeron en E. coli W3110 (plásmidos pFLAG1) y BL21 (DE3) pLysS (plásmidos pET23a). Las células se cultivaron durante 3 horas en Caldo Terrific, se indujeron con isopropil - & # 946-D-tiogalactopiranósido (IPTG) 1 & # 160 mM, y se cultivaron adicionalmente durante 4 horas. La apoenzima se acumuló en los cuerpos de inclusión, como se observó por SDS-PAGE, y se solubilizó con urea 8 & # 160M. El replegamiento in vitro se realizó utilizando urea 0,16 & # 160 M, Ca 2+ 5 & # 160 mM, hemina 20 & # 160 & # 956M, glutatión oxidado 0,5 & # 160 mM, ditiotreitol 0,1 & # 160 mM y 0,1 & # 160 mg / ml de proteína, a pH & # 1609.5 62. Para P. ostreatus MnP6 (1041740) se obtuvo el replegamiento usando urea 0,1 & # 160 M, Ca 2+ 5 & # 160 mM, hemina 20 & # 160 & # 956 M, glutatión oxidado 1,5 & # 160 mM, ditiotreitol 0,1 & # 160 mM y 0,1 & # 160 mg / ml de proteína, a pH & # 1608. Las enzimas se purificaron mediante cromatografía Resource Q usando un gradiente de NaCl de 0 a 300 & # 160 mM (2 & # 160 ml.min -1, 20 minutos) en tartrato de sodio 10 & # 160 mM (pH & # 1605,5) que contenía CaCl 1 & # 160 mM2 (excepto para MnP4-1099081, para el que se usó pH & # 1606).

Cristalización, recopilación de datos y refinamiento

Los ensayos de cristalización se llevaron a cabo mediante el método de difusión de vapor de gota sentada, en placas de 96 pocillos utilizando las pantallas Wizard I a III (Emerald Bio, Bainbridge Island, WA, EE. UU.) Y JBScreen Kits 1-10 (Jena Biosciences, Jena, Alemania) en 22 y # 176C. Las gotas consistieron en 0,2 & # 160 & # 956 l de solución de proteína (10 & # 160 mg / ml en tartrato de sodio 10 & # 160 mM, pH & # 1605,0) y 0,2 & # 160 & # 956 l de solución de depósito. Los cristales de VP1 pertenecían a tres formas cristalinas en dos grupos espaciales. Form I pertenecía al P43 y se obtuvo en las cinco condiciones siguientes: i) acetato de sodio 0,1 & # 160 M (pH & # 1604,6) que contiene 8% de PEG 4000 ii) 20% de PEG 3350 y 0,2 & # 160 M de cloruro de amonio iii) 20% de PEG 3350 y 0,2 & # 160M formiato de amonio iv) Tampón HEPES de sodio 0,1 & # 160 M (pH & # 1607,5) que contiene sulfato de amonio 1,6 & # 160 M y PEG 1000 al 2% yv) Tampón HEPES de sodio 0,1 & # 160 M (pH & # 1607,5) que contiene 0,2 & # 160M acetato de sodio y 20% de PEG 3000. La forma II también pertenecía al P43 y se obtuvo en imidazol 0,1 & # 160 M (pH & # 1608,0) que contenía tartrato 1,0 & # 160 M & # 160K / Na y NaCl 0,2 & # 160M. La forma III pertenecía a la P21 y se obtuvo en acetato de sodio 0,1 & # 160 M (pH & # 1604,5) que contenía PEG 1000 al 20% y acetato de zinc 0,2 & # 160 M. Cuatro condiciones diferentes dieron dos formas de cristal de MnP4 diferentes. La Forma I pertenecía al grupo P1 y se obtuvo en citrato de sodio 0,1 & # 160 M (pH & # 1605,5) que contenía sulfato de amonio 2,0 & # 160M. Finalmente, la forma II pertenecía al grupo C2 y se obtuvo en: i) acetato de sodio 0,1 & # 160 M (pH & # 1604,6) que contiene sulfato de amonio 2,0 & # 160 M ii) tampón Tris-HCl 0,1 & # 160 M (pH & # 1607,0) que contiene Sulfato de amonio 2,0 & # 160 M y sulfato de litio 0,2 & # 160 M y iii) tampón CAPS de sodio 0,1 & # 160 M (pH & # 16010,5) que contiene NaH 1,2 & # 160 M2correos4/0.8 M K2HPO4 y sulfato de litio 0,2 & # 160M. Los cristales se montaron en bucles de nailon y se congelaron instantáneamente en N líquido.2 en las aguas madres que contienen varios crioprotectores.

Los datos de difracción de rayos X se recolectaron a 100 & # 160K en las líneas de haz X06DA y X06SA en Swiss Light Source (Villigen, Suiza) usando una longitud de onda de 1.0000 & # 160 & # 197, y los detectores Pilatus 2 & # 160M y 6 & # 160M, respectivamente. Los datos de difracción se indexaron, integraron, fusionaron y escalaron utilizando XDS y XSCALE. Solo se presenta la estructura de resolución más alta para cada POD (forma cristalina I) (sus estadísticas de recopilación de datos se muestran en el archivo adicional 2: Tabla S3).

Las estructuras de VP1 y MnP4 se resolvieron mediante reemplazo molecular utilizando la estructura cristalina de P. eryngii VPL (3FMU) como modelo de búsqueda y el programa AutoMR del paquete PHENIX (Lawrence Berkeley Laboratory, Berkeley, CA, EE. UU.). Los modelos finales se obtuvieron mediante sucesivas rondas de refinamiento seguidas de la construcción manual con Coot utilizando & # 963A mapas de densidad de electrones ponderados 2Fo-Fc y Fo-Fc. Se introdujeron moléculas de disolvente en el refinamiento, como se implementó en el paquete PHENIX, y se inspeccionaron visualmente. Se utilizó un total del 5% de las reflexiones para calcular la Rgratis valor durante todo el proceso de refinamiento. El modelo final de VP1 contenía todos menos el último residuo de la secuencia (S331) (que no presentaba ninguna densidad electrónica), un cofactor hemo, dos iones Ca 2+ y 452 moléculas de agua y el modelo final de MnP4 contenía todos los 337 residuos de la secuencia, un cofactor hemo, dos iones Ca 2+ y 1212 moléculas de agua (detalles representativos de los mapas de densidad de electrones de VP1 y MnP4, correspondientes al bolsillo hem, se muestran en el archivo adicional 1: Figura S7). Las estructuras se validaron con MolProbity (The Richardson Laboratory, Duke University, Durham, NC, EE. UU.). El refinamiento y las estadísticas del modelo final se muestran en el archivo adicional 2: Tabla S3. Las figuras se produjeron con PyMOL (Schr & # 246dinger, Portland, OR, EE. UU.). Las coordenadas y los factores de estructura se han depositado con los códigos de acceso PDB [PDB: 4BLK] y [PDB: 4BM1].

Constantes cinéticas en sustratos seleccionados

Los cambios de absorbancia durante la oxidación del sustrato en tartrato 0.1 & # 160 M (a varios valores de pH) se registraron a 25 & # 176C en un espectrofotómetro Biomate5 (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) Usando una concentración de enzima de aproximadamente 0.01 & # 160 & # 956M, estimada a partir de el & # 1013406 de cada isoenzima (Archivo adicional 2: Tabla S1). Las reacciones fueron iniciadas por H2O2 (0,1 & # 160 mM) de adición. Se siguió la oxidación de Mn 2+ a pH & # 1605 controlando el complejo de tartrato de Mn 3+ (& # 1013238 Formación de 6,5 & # 160 mM -1 .cm -1). Se siguió la oxidación de VA a pH & # 1603 para veratraldehído (& # 1013310 9,3 & # 160 mM -1 .cm -1) formación. Se ensayó la oxidación de RB5, ABTS y DMP a pH & # 1603,5, y se monitorizó la desaparición de RB5 (& # 1013598 30 & # 160mM -1 .cm -1) y formación de radical catiónico ABTS (& # 1013436 29,3 & # 160 mM -1 .cm -1) y coerulignona dimérica (& # 1013469 55 & # 160mM -1 .cm -1), respectivamente. La oxidación de ABTS y DMP por VP mostró una doble cinética, con curvas de actividad sigmoidea al aumentar la concentración de sustrato (archivo adicional 2: Figura S8), que permitió el cálculo de dos conjuntos de constantes cinéticas. Constantes cinéticas para la activación enzimática por H2O2 se determinaron usando ABTS 5 & # 160 mM (excepto para MnP1 y MnP6, para los cuales se usó 2 & # 160 mM). Medias y errores estándar para la constante de Michaelis (K metro) y el recambio enzimático (k gato) los valores se obtuvieron por mínimos cuadrados no lineales ajustados al modelo de Michaelis & # 8211Menten.Ajuste de estas constantes a la ecuación normalizada v & # 8201 = & # 8201 (k gato/ K metro) [S] / (1 & # 8201 + & # 8201 [S] / K metro) arrojó los valores de eficiencia catalítica (k gato/ K metro) con sus correspondientes errores estándar.

Para estudiar el efecto de la preincubación a diferentes valores de pH sobre la actividad, los nueve POD se disolvieron (0.05 & # 160 & # 956M) en tampón Britton-Robinson (B & ampR) con un rango de pH de 2 a 9, y se mantuvieron a 4 & # 176C durante diferentes períodos de tiempo. La actividad se determinó por oxidación de una concentración saturante de ABTS (5 & # 160 mM, excepto para MnP1-1096331 y MnP6-1041740, para los cuales se usó 2 & # 160 mM) en tartrato 0,1 & # 160 M (pH & # 1603,5) en las condiciones descritas anteriormente. . Las actividades residuales se midieron después de 1 minuto (para evaluar la supervivencia inicial de la enzima a cada valor de pH) y 1, 4, 24 y 120 horas de incubación. La actividad más alta después de 1 minuto (a cualquier pH) se tomó como actividad del 100%, y el porcentaje de actividad residual en los diferentes tiempos y condiciones de pH se calculó de acuerdo con este valor máximo. Se repitió el mismo experimento con la enzima más estable (MnP4) y la menos estable (MnP3) manteniéndolas a 25 ° C en lugar de 4 ° C a 176 ° C.

Estudios de inactivación térmica

Para estudiar el efecto de la preincubación enzimática a diferentes temperaturas sobre la actividad, los nueve POD (0.05 & # 160 & # 956M) en tartrato 10 & # 160 mM (pH & # 1605) se incubaron a 5 & # 176C durante 10 minutos o 4 horas en la temperatura. rango de 25 a 70 & # 176C. La actividad residual se determinó a 25 ° C, como se describió anteriormente, y la obtenida después de una preincubación a 25 ° C se tomó como 100%. La estabilidad de temperatura se presentó como 10 minutos y 4 horas & # 160T50 actividades valores, es decir, la temperatura a la que se perdió el 50% de la actividad después de la incubación durante los períodos de tiempo anteriores.

Espectroscopia de absorción CD y UV-visible

El efecto del pH y la temperatura sobre la estructura y la unión del cofactor de diferentes POD fue seguido por espectroscopias de absorción de CD y UV-visible. Las mediciones de CD de UV lejano (190 a 250 & # 160 nm) se llevaron a cabo en un espectropolarímetro J-720 (Jasco, Oklahoma City, OK, EE. UU.) Equipado con un controlador de temperatura Peltier y un soporte de celda termostatizado utilizando una longitud de trayectoria de 0,01 & # 160 cm celda de cuarzo. El efecto de tres pH (3, 5 y 8) en los espectros de CD se estimó en diferentes tiempos de incubación (1 & # 160 minuto, 1 hora y 4 horas) a una concentración de proteína de aproximadamente 50 & # 160 & # 956M en 0,1 & # Amortiguador B & ampR de 160 mM, a 25 & # 176C. Los espectros de cinco barridos promediados se corrigieron para la contribución de la línea base del tampón y las elipticidades observadas se convirtieron en elipticidades medias de residuos (& # 952). El efecto de la temperatura sobre los espectros de CD se analizó a una concentración de proteína de aproximadamente 5 & # 160 & # 956 M en fosfato 0,01 & # 160 mM (pH & # 1606). La desnaturalización térmica se estimó aumentando la temperatura de 20 a 70 ° C a 20 ° C y 176 ° C h -1, y grabando la señal de CD a 222 ° C 160 nm. Tmetro representa la temperatura en el punto medio de la transición de despliegue. Los espectros de absorción UV-visible (300 a 800 & # 160 nm) de las dos proteínas después de la incubación a diferentes pH y temperaturas se obtuvieron en un espectrofotómetro de matriz de diodos 8453E (Agilent, Santa Clara, CA, EE. UU.), Utilizando una longitud de trayectoria de 1 & # 160 cm celda de cuarzo. El efecto de tres pH (3, 5 y 8) después de diferentes tiempos de incubación (0, 30, 60, 90, 120, 180 y 240 minutos) se estimó a una concentración de proteína de aproximadamente 3,5 & # 160 & # 956 M en 0,1 & # 160 mM B & ampR buffer, a 25 & # 176C. Los espectros UV-visible de diferentes POD también se recogieron en el rango de 25 a 70 & # 176C, después de 10 minutos de incubación a intervalos de 5 & # 176C, usando una concentración de proteína de aproximadamente 2 & # 160 & # 956M en tartrato de 10 & # 160 mM (pH & # 176) # 1605). T50-Soret representa la temperatura en el punto medio de la transición de pérdida de hemo, según lo estimado por la intensidad de la banda de Soret a 407 & # 160 nm.

Degradación oxidativa de un dímero modelo de lignina

Despolimerización enzimática de lignina sintética

Se preparó un DHP de siringil-guaiacilo radiomarcado (con una relación siringil / guaiacilo de aproximadamente 4: 1) mediante copolimerización de alcohol sinapílico & # 946- [14C] (0,01 & # 160mCi.mmol -1) y coniferil sin marcar. alcohol usando peroxidasa de rábano picante y fraccionado en una columna de 1,8 & # 8201 & # 215 & # 820130 & # 160 cm de Sephadex LH-20 en N, N-dimetilformamida. Las fracciones de alto peso molecular excluidas de la columna (& gt1 & # 160 kDa) se combinaron para su uso en experimentos de despolimerización 64.

ABTS: 2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato) B & ampR: Britton-Robinson CAPS: Ácido N-ciclohexil-3-aminopropanosulfónico CD: Dicroísmo circular DHP: Polímero de deshidrogenación (lignina) DMP: 2,6 -dimetoxifenol dNTP: Trifosfatos de desoxirribonucleótidos DOE: Departamento de Energía DyP: Peroxidasa decolorante de colorante GC-MS: Cromatografía de gases y espectrometría de masas # 8211 GP: Peroxidasa genérica GPC: Cromatografía de permeación en gel HEPES: 4- (2-hidroxietil-etil) -1-piperazonulfónico : Cromatografía líquida de alta resolución HTP: Hemetiolato peroxidasa IPTG: Isopropil - y # 946-D-tiogalactopiranósido JGI: Joint Genome Institute kcat: Constante catalítica Km: Constante de Michaelis LiP: Lignina peroxidasa LRET: Transferencia de electrones de largo alcance MnP: Peroxidasa de manganeso PCR: reacción en cadena de la polimerasa PDB: banco de datos de proteínas PEG: polietilenglicol POD: peroxidasa de clase II de la superfamilia de peroxidasas no animales (plantas-hongos-procariotas) RB5: negro reactivo 5 Rz: reinheitszahl UPGMA: par no ponderado método de grupo con media aritmética VA: alcohol veratrílico VP: peroxidasa versátil.

Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.

ATM y FJR-D concibieron y diseñaron los experimentos. FJM realizó el estudio cristalográfico. EF-F, FJR-D y FJM realizaron los experimentos. EF-F, FJR-D, FJM, AR, MJM, KEH y ATM analizaron los datos. ATM, FJM y KEH escribieron el artículo. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Este trabajo fue apoyado por las subvenciones PEROXICATS (KBBE-2010-4-265397) e INDOX (KBBE-2013-7-613549) de la Unión Europea (a ATM), mediante las subvenciones BIO2011-26694 (a FJR-D) y BFU2011 -24615 (a AR) del Ministerio de Economía y Competitividad de España (MINECO), y por la subvención del DOE de EE. UU. DE-AI02-07ER64480 (a KEH). El trabajo realizado por el DOE JGI de EE. UU. Cuenta con el apoyo de la Oficina de Ciencias del DOE de EE. UU. Con el número de contrato DE-AC02-05CH11231. AG Pisabarro (Universidad Pública de Navarra, Pamplona, ​​España) es reconocida por coordinar el proyecto del genoma de P. ostreatus. Agradecemos a Michael D Mozuch por su ayuda con los estudios de despolimerización de lignina. EF-F reconoce una beca de la Junta de Ampliación # 243n de Estudios del CSIC, cofinanciada por el Fondo Social Europeo, y FJR-D reconoce un contrato MINECO Ram & # 243n y Cajal.

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Expresión de peroxidasa versátil de Pleurotus eryngii en Escherichia coli y optimización del plegamiento in vitro

Degradación fúngica de estructuras recalcitrantes de lignina no fenólica sin lignina peroxidasa


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Palabras clave: células NK, hongo, Pleurotus ostreatus, cáncer de mama, cáncer de pulmón, polisacáridos, glucanos

Cita: EL-Deeb NM, EL-Adawi HI, EL-wahab AEA, Haddad AM, EL Enshasy HA, He Y-W y Davis KR (2019) Modulación de NKG2D, KIR2DL y producción de citocinas por Pleurotus ostreatus El glucano mejora la citotoxicidad de las células asesinas naturales hacia las células cancerosas. Parte delantera. Cell Dev. Biol. 7: 165. doi: 10.3389 / fcell.2019.00165

Recibido: 14 de abril de 2019 Aceptado: 30 de julio de 2019
Publicado: 13 de agosto de 2019.

Bin Li, Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghai, China

Haiming Wei, Universidad de Ciencia y Tecnología de China, China
Yan Wu, Universidad Sun Yat-sen, China

Copyright & # x00A9 2019 EL-Deeb, EL-Adawi, EL-wahab, Haddad, EL Enshasy, He y Davis. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la Licencia de atribución Creative Commons (CC BY). Se permite el uso, distribución o reproducción en otros foros, siempre que se acredite al autor (es) original (es) y al propietario (es) de los derechos de autor y se cite la publicación original en esta revista, de acuerdo con la práctica académica aceptada. No se permite ningún uso, distribución o reproducción que no cumpla con estos términos.


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