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Recombinación de rojo lambda sin electroporación

Recombinación de rojo lambda sin electroporación


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Todos los protocolos que encontré sobre la recombinación del rojo Lambda utilizan la electroporación como método para introducir (inyectar) el ADN homólogo (generalmente un producto de PCR o un ADN bicatenario lineal) en la célula de E. coli. ¿Puedo usar el método químico (CalCl2 + PEG) y método de choque térmico en su lugar?


Dado que la recombinación de rojo lambda es un evento poco común, debe tener una buena eficiencia de transformación, por lo que la electroporación sería su mejor opción. Además, dado que la expresión del sistema de recombinación normalmente requiere el crecimiento de bacterias a 42º, probablemente inhibirá la expresión de la maquinaria de recombinación con el método químico.


Combinación de métodos de edición de genes para aplicaciones en biotecnología

En 2012, me encontré con el concepto de sistemas de expresión bacteriana en un entorno práctico, cuando Escherichia coli (E. coli) se utilizaron para producir tropoelastina humana recombinante, en el Departamento de Bioquímica de la Universidad de Sydney 1. La proteína sintética tropoelastina es un precursor de la proteína elastina, presente de forma natural en la matriz extracelular (MEC) 2 posteriormente utilizada para aplicaciones de bioingeniería con biomateriales 3,4. La recombinación es un método de ingeniería del genoma que se utiliza principalmente en la vida E. coli bacterias, lo que permite una fácil manipulación del cromosoma bacteriano para la ingeniería metabólica y la producción de una amplia gama de productos bioquímicos 5. La integración de la biología de sistemas, la biología sintética y la ingeniería evolutiva ha permitido ampliamente una variedad de herramientas y protocolos genéticos para la manipulación eficiente y rentable de E. coli en investigación y aplicaciones industriales 6. Para ejecutar protocolos de recombinación, se requiere un conocimiento básico de técnicas moleculares y microbianas. Este es un resumen de los avances actuales de la edición de genes y sus aplicaciones en biología sintética.

Nueva era de biología sintética

En la actualidad, se prevé que las tecnologías genéticas en rápida evolución desempeñen un papel importante para abordar los crecientes desafíos mundiales. La ingeniería genética ha revolucionado los estudios de biología molecular durante los últimos 30 años desde el descubrimiento de las enzimas de restricción 7. Las enzimas de restricción son una herramienta importante en la investigación genómica, similar a las tijeras moleculares que cortan el ADN en un sitio específico y crean un espacio para insertar ADN extraño con fines de edición. La tecnología de ADN recombinante, introducida en la década de 1970, creó una vía para insertar genes extraños en E. coli células huésped a través de vectores lanzadera (un vehículo molecular) llamados plásmidos, para la expresión génica y la producción de proteínas recombinantes (Figura 1). Debido a las limitaciones intrínsecas de las aplicaciones basadas en plásmidos, incluido el bajo rendimiento de proteínas, la dosificación deletérea de genes y una carga metabólica significativa para las células huésped, los genes extraños se integraron más tarde directamente en el E. coli genoma en su lugar. Por lo tanto, durante la última década, se realizaron muchos avances en la ingeniería genética, comenzando con el reemplazo de in vitro (en el laboratorio) tecnología de ingeniería genética recombinante con en vivo (en el organismo) tecnología de recombinación, para obtener resultados más precisos, rápidos y prácticamente eficientes 8. Es importante destacar que el en vivo La tecnología de recombinación no requiere enzimas de restricción ni ligasas de ADN, que eran un componente esencial de la ingeniería genética clásica 9.

Figura 1: .Utilizar enzimas de restricción para cortar un fragmento de ADN de interés y pegarlo con ligasas en los "vectores" del plásmido. El trabajo pionero introducido a principios de la década de 1970 sigue siendo un enfoque ampliamente utilizado (Figura de AbFrontier).

Recombinando

Desde su inicio en 1998, la recombinación o la ingeniería recombinogénica ha permitido la ingeniería directa del cromosoma bacteriano dentro del organismo (en vivo) por recombinación homóloga 9,10. La recombinación homóloga es el proceso mediante el cual se intercambian segmentos de ADN entre dos moléculas de ADN a través de regiones de secuencia idéntica, para dar como resultado la nueva combinación de material genético 7. Bacterias como E. coli, codifican sus propios sistemas de recombinación homóloga, mientras que los virus (o fagos) que habitan en bacterias llevan sus propias funciones de recombinación y estos dos sistemas pueden trabajar con o independientemente el uno del otro 11. La biotecnología ha aprovechado estas proteínas de fagos dentro de las bacterias para hacer uso de la recombinación homóloga para la ingeniería de ADN en E. coli, permitiendo así la clonación de una región de ADN elegida a partir de una mezcla compleja, sin enzimas de restricción ni aislamiento previo 11,12. Los sistemas de fagos más populares (sistemas de virus que habitan bacterias) se conocen como RecET basados ​​en genes codificados por el profago RAC y el rojo lambda, basado en el sistema de recombinación homóloga del bacteriófago λ (lambda), presente en algunos E. coli cepas 13.

Los segmentos de ADN del donante utilizados para la recombinación pueden ser ADN bicatenario lineal (dsDNA) u oligonucleótidos monocatenarios sintéticos (oligonucleótidos ssDNA) 13, que se utilizan de forma eficaz en una variedad de enfoques (para crear cambios de una sola base, pequeñas deleciones, grandes deleciones y pequeñas inserciones) y diseñar ADN en E. coli 9 . El sustrato de ADN del donante lineal con el cambio deseado se puede introducir mediante electroporación en cepas bacterianas para expresar las funciones de recombinación, dejar que se recupere durante un período de tiempo y cribar para identificar colonias recombinantes 5,8. El sistema de recombinación basado en fagos puede catalizar la recombinación homóloga entre el ADN lineal y un replicón como el fago λ, cromosomas bacterianos, plásmidos y cromosomas artificiales bacterianos (BACS). 9. Los investigadores planifican estratégicamente la vía de recombinación más apropiada para producir la construcción deseada basándose en varios protocolos diferentes y extensos en biología molecular 8. En comparación con la ingeniería genética clásica, el proceso de edición entre un sustrato de ADN de donante lineal y un replicón (BAC) es comparativamente menos laborioso y más eficiente a través de la recombinación (Figura 2).

Figura 2: Modificar los clones de BAC en E. coli. a) En la ingeniería genética tradicional, los fragmentos de ADN se cortan y se vuelven a unir utilizando enzimas de restricción y ADN ligasa, para la recombinación homóloga clásica, B) Los problemas asociados con el enfoque tradicional se han superado mediante el uso de la recombinación mediada por fagos en la tecnología de recombinación (Figura de la referencia 12).

Recombinando Lambda Red en Escherichia coli

El ADN lineal introducido en sistemas bacterianos normalmente es propenso a degradarse por las enzimas nucleasas bacterianas 7. Durante la última década, la recombinación de rojo lambda se ha utilizado como una técnica poderosa para alteraciones cromosómicas definidas con precisión en E. coli 10. Tres proteínas rojas lambda derivadas de fagos: Gam, Exo y Beta son necesarias para completar la recombinación del dsDNA 7,10 Gam previene la degradación del DNA bicatenario lineal extraño por parte del E. coli nucleasas, Exo degrada el dsDNA para formar un DNA monocatenario (ssDNA) y la unión Beta facilita la recombinación (Figura 3). El mecanismo exacto de cómo una construcción deseada se recombina con el cromosoma en presencia de las tres proteínas rojas lambda ha sido muy debatido 14. Además, la ingeniería basada en λ Red DNA es el único método que permite la multiplexación (edición secuencial) en un solo paso mediante electroporación directa, por lo que se utiliza ampliamente como herramienta de edición para la ingeniería multiplexada del genoma automatizado (MAGE) 13.

Figura 3: Descripción general del sistema de recombinación rojo del bacteriófago λ utilizado para la recombinación. 1) La proteína exo tiene actividad exonucleasa (5 'a 3') generando proyecciones 3 'en el ADN lineal. 2) Beta se une al ADN monocatenario (voladizos 3 '), promueve el recocido ss y genera ADN recombinante. 3) Una proteína Gam adicional (no mostrada aquí) previene la E. coli enzimas de la degradación de fragmentos de ADN lineal bicatenario necesarios para la recombinación de ADN bicatenario (figura de la referencia 5).

Acoplamiento del sistema CRISPR / Cas9 con Lambda Red Recombineering en E. coli

A pesar de las nuevas técnicas incorporadas, el rendimiento de genes y proteínas con tales sistemas de expresión bacteriana sigue siendo pequeño / insignificante, lo que conduce a un cuello de botella en la ingeniería metabólica y la biología de sistemas. Por ejemplo, la eficiencia de la recombinación mediada por oligonucleótidos de ADNss / ADNds es más alta para modificaciones cortas del genoma, mientras que las modificaciones más grandes ocurren con una frecuencia significativamente menor (& lt1%) 15, lo que requiere el cribado mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, una técnica de amplificación de oligonucleótidos en biología molecular). para identificar las mutaciones deseadas que no dan como resultado un cambio fenotípico claro 15. Además, para seleccionar clones recombinantes, los métodos de recombinación se basan en la inserción de marcadores antibióticos en el gen, que deben eliminarse antes de realizar modificaciones adicionales, lo que provoca cicatrices en el genoma. Las cicatrices promueven el reordenamiento del genoma después de varias rondas de modificaciones, lo que dificulta la ingeniería adicional de la cepa. Estas limitaciones pueden superarse mediante el acoplamiento de la recombinación de rojo lambda con la poderosa herramienta actual en biología molecular agrupada con repetición palindrómica corta regularmente interespaciada (CRISPR) / sistema Cas9, que ha demostrado su capacidad para editar genes de una variedad de organismos, incluidos eucariotas, procariotas y plantas superiores. e incluso líneas celulares humanas 13,15. Por función, Cas 9 es una nucleasa programable que puede mediar una ruptura roma de doble hebra (DSB) en casi cualquier loci de ADN objetivo que no tenga la mutación deseada y, dado que DSB es letal, esto dará como resultado la muerte celular general y, por lo tanto, actuará como una mejor selección. / procedimiento de cribado para células que poseen la modificación deseada generada mediante recombinación homóloga frente al tipo salvaje (células no mutantes) 13. Dado que la recombinación acoplada a CRISPR / Cas9 no depende del marcador antibiótico para la selección, estos mutantes de reemplazo de genes son idealmente sin "cicatrices" 15. El proceso también se realiza en un período de tiempo más corto que los protocolos anteriores.

En 2016, la tecnología avanzó un paso más, para integrar la automatización (MAGE) para una tecnología MAGE combinada basada en recombinación CRISPR / Cas9 y λ Red, conocida como CRMAGE 15. Este sistema se puede multiplexar para permitir la introducción de al menos dos mutaciones en una sola ronda de recombinación con eficiencias similares, para múltiples rondas de ingeniería por día 15. En una sola ronda de recombinación de CRMAGE, los científicos pudieron lograr una eficiencia cercana al 98% para una mutación de un solo punto, lo que no tiene precedentes en comparación con la eficiencia anterior del 5% usando MAGE tradicional. El estudio demostró además que es posible modular la traducción de proteínas con una frecuencia relativamente alta (del 6% al 70%), también dentro de la población celular 15. Por tanto, puede insertarse cualquier elemento regulador para modular la expresión génica o la traducción de proteínas. Técnicamente, incluso es posible obtener una cepa recombinante final limpia al eliminar todo el sistema de edición CRMAGE de la población bacteriana después de la recombinación 15. Para acelerar el proceso de diseño para la edición, el equipo de investigación ha facilitado una herramienta basada en la web que puede predecir los oligonucleótidos para su uso en el proceso de edición. La técnica CRMAGE permitirá la generación de múltiples mutaciones en un solo ciclo y múltiples ciclos en un solo día laboral, para aumentar significativamente la capacidad diaria de ingeniería del genoma de E. coli y otras cepas bacterianas, para posibles aplicaciones industriales, de investigación y de alto rendimiento en biotecnología.

Imagen de póster: Captura de pantalla de "¿Qué es la modificación genética?" video animado de The Royal Society, disponible a través de YouTube.


Mini-lambda: un sistema manejable para la ingeniería cromosómica y BAC

El sistema de recombinación del bacteriófago lambda (lambda) Red se ha utilizado para manipular grandes fragmentos de ADN clonados en P1 y vectores de cromosomas artificiales bacterianos (BAC o PAC). Hasta ahora, este sistema de recombinación se ha utilizado transfiriendo los clones BAC o PAC a células bacterianas que albergan un profago lambda defectuoso. Aquí describimos la generación de un ADN mini-lambda que puede proporcionar las funciones de recombinación de Red y puede introducirse fácilmente mediante electroporación en cualquier cepa de E. coli, incluidas las BAC o PAC que llevan DH10B. El ADN mini-lambda se integra en el cromosoma bacteriano como un profago defectuoso. Además, dado que retiene los sitios de unión, se puede extirpar para curar las células del ADN del fago. Aquí describimos el uso del sistema de recombinación mini-lambda para la modificación de BAC mediante la introducción de un marcador seleccionable en la secuencia del vector de un clon de BAC. Además, utilizando la mini-lambda, creamos una única mutación sin sentido en el gen BRCA2 humano clonado en un BAC sin el uso de ningún marcador seleccionable. La capacidad para generar recombinantes demuestra de manera muy eficiente la utilidad de la mini-lambda como un sistema móvil muy simple para la ingeniería del genoma in vivo mediante recombinación homóloga, un proceso denominado recombinación.


Resultados y discusión

Modificación de los métodos de recombinasa roja

Nuestros primeros intentos de utilizar el protocolo descrito por Datsenko y Wanner [20] para construir profagos recombinantes no tuvieron éxito. Después de varios ensayos, decidimos modificar el protocolo. Las modificaciones permitieron el uso de esta metodología con las características especiales de nuestras cepas, que son portadoras de profagos convertidores de toxina Shiga inducibles.

El inconveniente más obvio fue la activación espontánea del ciclo lítico del fago durante el proceso. Esta afirmación está respaldada por el aislamiento del ADN del fago de los sobrenadantes de los cultivos bacterianos sin inducción previa (datos no mostrados). Esto aumentó la escisión de profagos y / o la liberación de fagos, lo que redujo significativamente la eficacia de la formación de clones recombinantes. Se consideraron dos posibles causas de esta falla. Posiblemente, la escisión del ADN del profago del ADN bacteriano se produjo sin la formación de partículas del fago. En este caso, el gen diana (stx) donde el amplímero debe recombinarse se perdería, lo que dificultaría la recombinación correcta. Alternativamente, después de la escisión, se formaron partículas de fagos y se liberaron de las células mediante lisis. En este caso, se lisaría una proporción significativa de células bacterianas, reduciendo el número de células susceptibles de transformación. Ambos escenarios conducirían a una reducción en la eficacia de la obtención de clones recombinantes. La primera causa no se pudo comprobar, pero la segunda fue confirmada experimentalmente por la moderada reducción de la DO.600 observado en los cultivos de los lisógenos durante el proceso, en comparación con la DO600 de E. coli Cultivos C600 o DH5α (no lisógenos) utilizados como control.

La inducción espontánea del ciclo lítico podría deberse a varias causas que activarían la respuesta SOS. Por ejemplo, la doble aplicación del protocolo para preparar células electrocompetentes (en primer lugar para transformar el plásmido pKD46 y en segundo lugar para transformar el amplímero de PCR) que pueden activar la respuesta al estrés en la célula bacteriana. En cualquier caso, ensayamos varias modificaciones del protocolo original para optimizar nuestra aplicación. Estas modificaciones de cada paso y los resultados obtenidos se describen en esta sección.

Confirmación de la presencia del stx genes después de la transformación del vector pKD46

Examinamos la eficacia de la transformación del plásmido auxiliar pKD46 en el primer paso del método, para evaluar la eficacia de nuestro protocolo de transformación. Se utilizó el vector pBC-SK como control. El vector pKD46 presentó una menor eficacia de transformación que pBC-SK. El número de colonias transformadas fue en promedio de 6 a 10 veces mayor con pBC-SK. Estos resultados podrían deberse al hecho de que pKD46 tiene un origen de replicación sensible a la temperatura y solo se replica a 30 ° C. Por tanto, la tasa de crecimiento de las células transformadas con pKD46 es menor que la de las células transformadas con pBC-SK y cultivadas a 37ºC.

Además de estos resultados esperados, la introducción del vector pKD46 produjo la pérdida del stx 2gen en algunos de los lisógenos. Esto se observó en una alta proporción de las colonias analizadas (Cuadro 1). El porcentaje de pérdida de genes en tales lisógenos fue significativamente mayor (t-Estudiante, pag & lt 0.05) que el porcentaje de stx 2pérdida de genes en células transformadas después de la transformación con el vector pBC-SK, usado como control (Tabla 1). Solo los lisógenos C600 (933W) y C600 (A9) no mostraron ninguna pérdida génica, lo que podría sugerir una mayor estabilidad de los lisógenos obtenidos con la cepa C600.

Desde el stx 2Se requirió el gen para continuar con el protocolo, la presencia del vector y la stx 2gen en los clones seleccionados se confirmó mediante una doble hibridación con los respectivos stx y sondas de recombinasa roja. Solo clones en los que el pKD46 y el stx 2Se observó que los genes podrían usarse en los siguientes pasos para transformar el amplímero que contiene el gen del antibiótico.

Otras secuencias de fagos, como la rho terminador independiente, el cI gen o el Q gen, que están presentes en los fagos estudiados, también estaban ausentes en colonias que carecen de la stx 2gen (datos no mostrados). Esto sugiere que se produjo la escisión de todo el ADN del profago de la célula huésped. Sin embargo, dado que este no era el objetivo de este trabajo, no se llevaron a cabo más investigaciones.

No hay explicación para la pérdida del stx gen en un alto porcentaje de las células transformadas con pKD46. Las condiciones eran las mismas para todos los lisógenos y algunos de ellos no perdieron la stx. Una posible hipótesis es que la presencia del sistema de recombinasa Red podría incrementar la escisión de ciertos profagos del genoma bacteriano de algunos lisógenos, sin formación de virus y sin posterior lisis celular.

Construcción del amplificador

Una de las modificaciones más importantes del protocolo implicó la construcción del amplímero de PCR. En el primer conjunto de experimentos, utilizamos dos conjuntos de cebadores para amplificar el marcador de resistencia que contiene secuencias de extensión de 36 pb y 40 pb (brazos homólogos cortos) con homología a la stx genes (Tabla 2). Se esperaba que estas secuencias compartidas fueran eficaces con el sistema de recombinasa Red. Los cebadores se diseñaron para obtener un amplímero de Tc y un amplímero de Cm que pudieran insertarse en los fagos recombinantes. Sin embargo, no se obtuvieron transformantes resistentes a antibióticos de nuestros lisógenos usando estos cebadores. Por tanto, fueron excluidos del procedimiento experimental.

La presencia de transformantes resistentes a Tc solo se observó en unas pocas ocasiones cuando se utilizaron los cebadores descritos anteriormente. Sin embargo, el casete Tc no estaba presente dentro del stx 2gen pero en algún otro lugar del cromosoma bacteriano, a pesar de que todos los plásmidos utilizados como plantillas de los casetes de antibióticos tenían replicones condicionales para evitar integraciones erróneas como se sugiere en el protocolo original. Digestión de los amplímeros con DpnI fue reducir este problema no mejoró los resultados. El uso de secuencias de homología cortas (36-40 pb) para la recombinación podría posiblemente ser la causa de eventos de recombinación erróneos o la falta de recombinaciones. Por esta razón, se incrementó la longitud de las regiones de homología donde puede actuar la recombinasa. Con este fin, se utilizó una nueva estrategia, basada en el protocolo 3S-PCR [29] para aumentar la longitud de la región de homología compartida por el amplímero y el stx 2gene.

Los eventos de recombinación inusuales son difíciles de explicar. Posiblemente, la presencia del stx Los profagos lambdoides, algunos de los cuales podrían incluir diferentes genes de recombinasa, podrían de alguna manera mejorar la recombinación no homóloga. Esto conduciría a la inserción del casete de resistencia a antibióticos en sitios inesperados fuera del gen diana. De hecho, la secuenciación de varios E. coli genomas ha revelado la aparición generalizada de múltiples integrasas de origen fago [30] con homología de secuencia similar. Estos pueden ayudar a explicar nuestras observaciones, que también han sido descritas por otros autores [31].

Para aumentar la longitud del stx 2región homóloga aguas arriba y aguas abajo del casete de resistencia a antibióticos, se crearon nuevos amplímeros mediante el uso de regiones superpuestas entre tres fragmentos diferentes: el fragmento 3 ', que contiene el stx 2homología el casete de resistencia a antibióticos y el casete 5 ', que también contiene el stx 2homología (figura 1). Algunos amplímeros, como el que contiene tet, se obtuvieron directamente utilizando los tres fragmentos simultáneamente como plantillas en la misma reacción de PCR. Para gato, el fragmento 3 'unido al casete de antibiótico se amplificó en una primera reacción de PCR y el casete de antibiótico unido al fragmento 5' en una segunda. Luego, ambos fragmentos se usaron juntos para obtener el amplímero completo en una tercera reacción de PCR.

Esquema del protocolo utilizado para construir los amplímeros que contienen el stx gen sustituido por el gen de resistencia a antibióticos. La figura muestra el protocolo utilizado para el gato gen como ejemplo.

El uso de regiones homólogas más largas (280 pb en cada lado) en el amplímero que lleva los casetes de antibióticos definitivamente resolvió el problema de los falsos recombinantes (Tabla 2). En la aplicación mencionada anteriormente (29), la razón para el uso de regiones más largas de homología era aumentar la probabilidad del doble evento de recombinación que conduce al intercambio alélico deseado en no-E. coli Bacterias K-12. Esto fue explicado por los autores ya que las funciones del rojo lambda se volvieron menos eficientes para bloquear la degradación del ADN en bacterias que están relacionadas lejanamente con E. coli. Por lo tanto, las regiones de homología más largas aumentaron la eficiencia. Aunque nuestra aplicación se realizó utilizando un E. coli Derivado de K-12, cepa DH5α, la misma estrategia de brazos largos parece ser adecuada para nuestros propósitos.

También se evaluó la cantidad de amplímero a transformar y finalmente se estableció en 0,5 µg de ADN amplificado (Tabla 2). En el protocolo original se establecieron entre 10 y 100 ng de ADN amplificado [20]. Sin embargo, en nuestras manos y utilizando un amplímero más largo que el descrito en el protocolo original, eran necesarias concentraciones más elevadas.

Transformación del amplímero

Inicialmente, utilizamos cultivos de SOB de 5 ml con ampicilina y 10 mM de L-arabinosa como describen Datsenko y Wanner [20]. Sin embargo, no se obtuvieron clones recombinantes. En sucesivos intentos, las células lisogénicas (pKD46 +, stx 2 +) en volúmenes de cultivo de 10, 25 y finalmente 50 ml se utilizaron para preparar células electrocompetentes (Tabla 2). Finalmente se utilizaron células electrocompetentes preparadas a partir de 50 ml de cultivo para obtener clones recombinantes. Este problema no se aplicó en el enfoque descrito por Datsenko y Wanner [20], pero en nuestro enfoque fue necesario obtener pocas colonias recombinantes. Esto confirmó nuestra hipótesis de que en nuestros cultivos el número inicial de células probablemente se redujo por la activación de la lisis de fagos durante el protocolo de preparación de células electrocompetentes o por la presencia de antibiótico en el medio de cultivo. Por tanto, el número mínimo de células en el cultivo inicial necesario para obtener una única colonia recombinante fue de 2,5 x 10 10 UFC / ml.

También se probaron diferentes concentraciones de L-arabinosa. En condiciones óptimas, no se observaron diferencias significativas en nuestros experimentos al usar diferentes cantidades de arabinosa. Analizamos 1 mM (indicado en el protocolo original), 10 mM y 0,1 M de L-arabinosa. Se obtuvieron clones recombinantes en todos los casos. Sin embargo, el mayor número de clones se obtuvo con 0,1 M de arabinosa (Tabla 2). Estos resultados indican que todas las concentraciones probadas estaban dentro del rango necesario para generar la expresión de γβexo sistema genético en una proporción de las células transformadas. Esto es necesario en un sistema que depende de las concentraciones de arabinosa y que se ha descrito como "inducción de todo o nada de PMALO" [32].

Después de la transformación del amplímero, las células se recuperaron en 1 ml de medio SOC y se incubaron durante 1 a 3 horas a 37 ° C (como se sugiere en el método original) o 30 ° C antes de la siembra en placa. Se requirieron tres horas de incubación para obtener recombinantes. Aunque se supone que pKD46 es un vector sensible a la temperatura y no puede replicarse por encima de 30 ° C, las proteínas codificadas por el vector todavía pueden estar activas dentro de las células competentes potenciando la recombinación. No hubo grandes diferencias en el número de clones obtenidos de la incubación a diferentes temperaturas (Tabla 2) aunque se obtuvieron más colonias a 37 ° C. De hecho, la incubación a 37 ° C aumentó la tasa de crecimiento, produciendo más células.

Medios de galjanoplastia

Como medio selectivo se utilizaron placas de agar LB que contenían Tc y Cm. Datsenko y Wanner [20] propusieron el uso de 25 μg / ml para Cm y Km. Inicialmente, probamos concentraciones de 20 μg / ml de Tc o 20 μg / ml de Cm para la recuperación de recombinantes. Sin embargo, no se observaron recombinantes en placas Cm o Tc (Tabla 2). Se obtuvieron resultados positivos cuando se utilizaron concentraciones de antibiótico más bajas en el medio selectivo. Por tanto, se utilizaron finalmente placas LB que contenían 5 µg / ml de Tc o 5 µg / ml de Cm para la recuperación de recombinantes. Una vez en placa, 24 horas de incubación fueron suficientes para visualizar las colonias. A continuación, las colonias se transfirieron a nuevas placas de agar LB con concentraciones de antibiótico más altas (Tc: 20 µg / ml y Cm: 20 µg / ml respectivamente). Por tanto, los lisógenos que llevan fagos recombinantes no crecieron inmediatamente en las concentraciones esperadas de antibióticos, posiblemente debido a que las células bacterianas necesitan recuperarse después del proceso y se dañaron cuando se sometieron directamente a altas concentraciones de antibióticos.

La pérdida del vector se logró después de sucesivos subcultivos e incubación a 43 ° C sin selección de ampicilina, como se describió anteriormente [20]. La pérdida del plásmido se confirmó observando la ausencia del amplímero de PCR, utilizando los cebadores descritos en la Tabla 1 para el vector pKD46.

La Tabla 2 resume todas las variaciones ensayadas en nuestro protocolo el número de clones recombinantes obtenidos con dos de los bacteriófagos utilizando las diferentes modificaciones y las condiciones finales que se establecieron.

Fagos recombinantes

los tet y gato genes fueron introducidos en el stx 2gen de los profagos: ØA9, ØA312, ØA534, ØA549, ØA557, ØVTB55 y 933W. Los genes se colocaron en la posición 251 pb del stx 2-A subunidad y 264 pb aguas arriba del final de la stx 2-B subunidad. La identificación y caracterización del gen respectivo en cada profago recombinante se logró mediante PCR y secuenciación.

La inducción de stx 2Los fagos de los seis lisógenos recombinantes tenían una cinética ligeramente diferente a la de los lisógenos originales. No obstante, todos los lisógenos recombinantes conservaron su capacidad lítica tras incorporar el gen de resistencia a antibióticos. Como se describió anteriormente [33, 34], las placas producidas por stxLos fagos son generalmente poco visibles o turbios en la capa superior de agar. Por lo tanto, la confirmación de la presencia de fagos recombinantes infecciosos se logró mediante la hibridación de transferencia de placa con específicos gato o tet sondas (datos no mostrados).

El casete de resistencia a antibióticos parece permanecer estable dentro del genoma del fago, como se observa después de cuatro pasos de subcultivo sin selección de antibióticos. Sin embargo, queda por dilucidar la estabilidad a largo plazo del gen marcador en el genoma del fago sin selección de antibióticos.

Transductantes recombinantes

Evaluar la capacidad de los fagos recombinantes para infectar y convertir nuevos E. coli cepas, se prepararon suspensiones de los fagos recombinantes. Transducción de E. coli DH5α y E. coli Se realizó C600. Todos los fagos produjeron nuevos transductantes, que conferían resistencia al antibiótico apropiado en DH5α o C600. La presencia de profagos recombinantes en la cepa huésped se confirmó mediante PCR y análisis de hibridación en placa (Figura 2).

A) Número de transductantes (UFC / ml) obtenidos en E. coli DH5α y E. coli C600 con cada fago recombinante que lleva California t o tet genes de resistencia a antibióticos. B) Productos de PCR de cada colonia recombinante portadora de un stx-profago con el respectivo casete de resistencia a antibióticos. 1: stx control de genes, 2: gato control, 3: tet control, 4-5: E. coli DH5α y E. coli Lisógenos C600 con stx-fagos:gato. 6–7: E. coli DH5α y E. coli Lisógenos C600 con stx-fagos:tet-. 8 control de PCR negativo C) Como ejemplo, la transferencia de colonia de DH5α (Ø557 ::tet) hibridada con la sonda específica para el tet gene.

Algunos otros autores han producido recombinantes stx-fagos [9, 15, 16] para diferentes propósitos. Schmidt et al. [9] utilizó el fago φ3538 para infectar y lisogenizar entérico Escherichia coli cepas y para desarrollar una progenie infecciosa a partir de tales cepas lisogenizadas. Allison et al., [15] utilizaron fagos recombinantes para mostrar la primera observación informada de la infección simultánea de un solo huésped con dos fagos Stx genéticamente idénticos. Acheson et al., [16] generó un fago recombinante de conversión de la toxina 1 Shiga H-19B para facilitar el estudio de la transmisión intestinal de stx1-fagos.

En el presente trabajo hemos generado diferentes fagos recombinantes con dos genes de resistencia a antibióticos para utilizarlos con diferentes propósitos. El uso de estos fagos permitirá analizar la transducción en diferentes matrices, como muestras de alimentos o agua. También sería interesante evaluar la inducción de fagos y la transducción luego de diferentes procesos aplicados para tratamientos de alimentos o agua, como alta temperatura o alta presión hidrostática (HHP), lo cual ha sido reportado como un método que puede generar un aumento en la inducción. del ciclo lítico de ciertos stx-fagos [35].

Los fagos recombinantes también serían herramientas útiles para evaluar la capacidad de stx-fagos para generar lisógenos dobles y evaluar si la lisogenia doble está realmente favorecida en STEC, como sugerirían algunas observaciones realizadas en ambientes acuáticos o en cepas aisladas de humanos y animales [15, 33, 36, 37].


Modificación genética sin cicatrices de alta eficacia en Escherichia coli mediante el uso de recombinación con rojo lambda y escisión de I-SceI.

Las modificaciones genéticas de los cromosomas bacterianos son importantes tanto para la investigación fundamental como para la aplicada. En este estudio, desarrollamos un sistema eficiente y fácil de usar para la modificación genética del cromosoma de Escherichia coli, un método de dos plásmidos que involucra la recombinación de rojo lambda (λ-rojo) y la escisión de I-SceI. Se genera una cepa intermedia mediante la integración de uno o más genes marcadores de resistencia y sitios de reconocimiento de I-SceI en o cerca del locus del gen diana, utilizando como diana λ-Red PCR. La cepa intermedia se transforma con un plásmido donante que lleva el fragmento del gen diana con la modificación deseada flanqueada por sitios de reconocimiento I-SceI, junto con un plásmido auxiliar bifuncional para la recombinación λ-Red y la endonucleasa I-SceI. La escisión de I-SceI del cromosoma y el plásmido donante permite la recombinación λ-Red entre roturas cromosómicas y ADN lineal de doble hebra del plásmido donante. Se introducen modificaciones genéticas en el cromosoma y la ubicación de los sitios I-SceI determina la naturaleza de la recombinación y la modificación. Este método se utilizó con éxito para la eliminación de cadA, la eliminación de gdhA, la eliminación sin fisuras de pepD, la mutagénesis dirigida al sitio del gen esencial metK y la sustitución de metK por el gen transportador Rickettsia S-adenosilmetionina. Este método eficaz se puede utilizar con modificaciones genéticas tanto esenciales como no esenciales y beneficiará a la investigación genética básica y aplicada.


DISCUSIÓN

MAGE es una técnica poderosa que puede usarse para generar conjuntos combinatorios de mutaciones diseñadas en una población (4) y / o modificar cientos de alelos en una sola cepa (5). Hemos diseñado cepas optimizadas para la ingeniería del genoma multiplex en un esfuerzo por optimizar la edición extensa del genoma. Previously, we showed that converting a selectable allele in the vicinity of multiple non-selectable alleles enriches the candidate pool for highly modified clones (9). Additionally, we demonstrated that exonucleases are capable of degrading single-stranded MAGE oligos even when these oligos are protected using phosphorothioate bonds (Mosberg, J.A., Gregg, C.J., et al., in review). Inactivating ExoI, ExoVII, ExoX, RecJ and 㮾xo significantly enhanced multiplex AR frequencies (Mosberg, J.A., Gregg, C.J., et al., in review). This showed that intracellular MAGE oligos are a limiting factor in Redβ-mediated recombination. In the current work, we demonstrate that available ssDNA on the lagging strand of the replication fork is another limiting factor that can be increased by disrupting the interaction between DnaG primase and DnaB helicase on the replisome.

In order to increase ssDNA on the lagging strand of the replication fork, we introduced two known mutations in primase (DnaG)—K580A and Q576A. These mutations have been shown in vitro to increase OF size by interrupting the primase–helicase interaction on the replisome (13). Based on the measurements of Tougu et al. (13), we estimate that the K580A mutation increases OF length by 𢏁.5-fold and the Q576A mutation increases OF length by 𢏈-fold (Supplementary Table S2). EcNR2.dnaG.K580A and EcNR2.dnaG.Q576A exhibited significant increases in the mean number of alleles converted and decreases in the proportion of clones with zero non-selectable alleles converted. Furthermore, the strongest enhancement was observed in EcNR2. dnaG.Q576A (the variant with the longest OFs of the strains reported herein), with an intermediate enhancement observed in EcNR2.dnaG.K580A (the variant with intermediate-sized OFs). This relationship between recombination frequency and OF length further supports the model in which Redβ mediates annealing at the lagging strand of the replication fork (3,15,16,19), and our hypothesis that ssDNA on the lagging strand of the replication fork is a limiting factor during this process. With this in mind, we unsuccessfully attempted to generate a DnaG Q576A/K580A double mutant, suggesting that such an extensive manipulation of the DnaG C-terminal helicase interaction domain (24) was lethal.

Our results indicate that intracellular concentrations of MAGE oligos and the accessibility of their genomic targets are both limiting. To further increase the number of simultaneous mutations that can be generated by CoS-MAGE, it is helpful to understand whether the AR frequency is limited predominantly by the number of oligos that enter the cytoplasm, or whether kinetics are also relevant. Since a maximum of 9 ARs was observed for the 10-oligo sets compared to a maximum of just 12 ARs for the 20-oligo set, oligo uptake may be limiting. However, the fact that primase modulation—in addition to nuclease inactivation𠅎nhances AR frequency underscores the kinetic constraints regarding Redβ-mediated annealing. Each missed opportunity to anneal (i) increases the number of wt alleles in the population due to replication and (ii) decreases the number of MAGE oligos available, via dilution (cell division) and degradation (nucleases). Increasing the concentration of each reactant (i.e. intracellular oligos and accessible genomic targets) would increase the kinetics of annealing. Therefore, the number of intracellular oligos may limit the maximum number of possible mutations, but kinetics appear to be a significant force limiting the population-wide AR frequency average.

Interestingly, the nuclease-deficient Nuc5- strain (Mosberg, J.A., Gregg, C.J., et al., in review) performed statistically similarly to the EcNR2.dnaG.Q576A strain for Sets 1 and 2, whereas EcNR2.dnaG.Q576A strongly outperformed the nuclease-deficient strain for Set 3 ( Tables 1 and ​ and2 2 see also Mosberg, J.A., Gregg, C.J., et al., in review). While oligo design parameters such as type of designed mutation (4), oligo length (4), oligo secondary structure (4) and off-target genomic homology (5) are major determinants of AR frequency, our results highlight the relevance of genomic context. This has previously been difficult to demonstrate, but is apparent from the discrepancy in performance of the same oligo sets tested in our Nuc5- (Mosberg, J.A., Gregg, C.J., et al., in review), EcNR2.dnaG.Q576A, and Nuc5-.dnaG.Q576A strains. For example, different regions may have different replication fork speed or priming efficiency. These factors could locally modulate OF length, thus affecting Redβ-mediated AR frequency (although replication fork speed did not appear to be a major factor in vitro (13)). Therefore, increasing the region that must be replicated by a single OF may profoundly increase AR frequency for oligos targeting such regions. Alternatively, certain oligos may be more susceptible to nuclease degradation, so removing the responsible nucleases would disproportionately improve AR frequency for such oligos. With this in mind, we tested whether combining primase modification and nuclease removal would enhance MAGE performance more than either strategy used individually. Indeed, Nuc5-.dnaG.Q576A consistently performed the best ( Figures 3 and ​ and5) 5 ) of all tested strains. Therefore, the two disparate strategies can be combined for a larger and more robust MAGE enhancement.

To explore the extent to which OF localization impacts CoS-MAGE performance, we tested whether placing 10 oligos within a single putative OF would yield subpopulations of unmodified (few alleles converted) and ‘jackpot’ (most alleles converted) recombinants. However, CoS-MAGE using the densely clustered lacZ oligos ( Figure 4 ) produced a similar AR distribution to the ones observed for Sets 1𠄳 ( Figure 3 ), which target regions of the genome spanning several putative OFs. Since mutations within a single putative OF behaved similarly to mutations spread across many OFs, nascent OF placement does not appear to be a critical determinant of multiplex AR frequency. A number of hypotheses could explain why the expected ‘jackpots’ are not observed. Most likely, MAGE oligos are limiting due to degradation and/or lack of uptake. Thus, it is possible that most cells lack some of the oligos necessary for generating a majority of the desired mutations. Additionally, OF extension may occur too fast for all of the MAGE oligos to anneal before the OF occludes their targets. Still another explanation could be that ssDNA binding proteins occlude ssDNA on portions of the lagging strand, rendering these regions non-accessible for Redβ-mediated annealing. Finally, it is also possible that several MAGE oligos annealed within a single OF could destabilize lagging strand synthesis, leading to selection against highly modified ‘jackpot’ clones. Indeed, Corn and Berger (25) hypothesize that DnaG primase has evolved to only initiate synthesis when multiple DnaG units are bound to DnaB Helicase, as OF synthesis away from the replisome could be detrimental. Since polIIIlag dissociates from the replisome after completing an OF (26), the rapid and repeated dissociation of polIIIlag caused by multiple nearby MAGE oligos could inhibit lagging strand synthesis as the replisome proceeds beyond the target region. In the absence of the rest of the replisome, a cytosolic PolIII holoenzyme alone can synthesize 1.4 kb on a ssDNA template primed by 30 nt DNA oligos (27), but this activity is considerably diminished compared to that of an intact replisome. Therefore, if OFs are not completed when the replisome is in close proximity, this could result in persisting ssDNA that could destabilize the chromosome and/or cause lesions when the next replication fork passes through.

We also investigated whether targeting a greater number of alleles would increase the resulting number of conversions in our enhanced strains ( Figure 5 ). Although the mean number of alleles converted (mean ± std. error of the mean) increased from 2.59 ± 0.19 with 10-oligo Set 3 to 4.50 ± 0.30 (1.74-fold) with 20-oligo Sets 3 + 3X for Nuc5-.dnaG.Q576A, the mean number of alleles converted for EcNR2.dnaG.Q576A only increased from 2.54 to 2.96 (1.17-fold). The superior enhancement for the nuclease-depleted Nuc5-.dnaG.Q576A strain suggests that the intracellular oligo concentration is a limiting factor for highly multiplexed MAGE (㸐 alleles targeted). Therefore, enhancing DNA uptake and/or preservation may be a fruitful means of further improving MAGE. However, the greater multiplexibility of Nuc5-.dnaG.Q576A could also be due to the 10 new Set 3X oligos being more responsive to decreased exonuclease degradation than to increased lagging strand ssDNA availability. Additionally, there may be other limiting factors such as insufficient Redβ or unidentified host proteins. Although there is no known precedent for limiting amounts of λ Red proteins during recombination (28), our novel ability to attain 12 simultaneous non-selectable ARs ( Figure 5 A) shows that our improved strains are in uncharted territory for probing the limits of λ Red recombination.

Given that DnaG primase acts solely on the lagging strand of the replication fork, we expected that the primase modifications would only enhance lagging strand recombination. Therefore, the performance of leading-targeting CoS-MAGE in our strains was surprising, as EcNR2.dnaG.Q576A significantly outperformed EcNR2 (*pag = 0.018). Furthermore, while the total number of tolC+ recombinants was far smaller (� 2 -fold) for leading-targeting CoS-MAGE, the AR frequency of non-selectable alleles in these recombinants was still quite impressive, especially in extremely close proximity to the selectable allele. This suggests that one leading strand recombination event strongly correlates with multiple additional recombinations. Two possible explanations for the superior performance of EcNR2.dnaG.Q576A in leading-targeting CoS-MAGE are that (i) an impaired primase–helicase interaction increases accessible leading strand ssDNA or (ii) infrequent Redβ-mediated strand invasion initiates a new replication fork that travels in the opposite direction and swaps which strand is the lagging strand.

There is strong support for primase function affecting the dynamics of replication on both the lagging and leading strands (26,27,29). Lia et al. (26) observed phases in which OF synthesis is faster than helicase progression at the replication fork, alternating with phases in which helicase progression outstrips the rate of OF synthesis by PolIIIlag. These results demonstrate that DnaB-PolIIIdirigir does not progress at the same instantaneous speed as PolIIIlag (26). Furthermore, Yao et al. (29) showed that the velocity of leading-strand synthesis decreases during lagging strand synthesis, while its processivity increases. Perhaps less frequent primase–helicase binding leads to transient asynchrony of the helicase and PolIIIdirigir. Given that PolIII tends to release from the replication fork more readily than does DnaB helicase (29), a transiently increased fork rate and decreased PolIIIdirigir processivity could exacerbate such an asynchrony, creating a leading strand trombone loop similar to those observed during lagging strand synthesis. However, the effects of lagging strand synthesis on leading strand replication have been historically difficult to demonstrate in experiments beyond single-molecule studies (29). Given that instantaneous changes in replication dynamics appear to occur on timescales relevant to Redβ-bound oligo recombination, it is conceivable that snapshots of exposed ssDNA on the leading strand template could be recorded by measuring rates of leading-targeting AR. Single-molecule analysis of the Q576A variant could explore this hypothesis.

Alternatively, Redβ has been reported to facilitate strand invasion in vitro (30). If this also occurs en vivo, such strand invasion would produce a D-Loop that could act as a new origin of replication (31). Therefore, invasion of one leading–targeting MAGE oligo could initiate a replication fork traveling in the opposite direction. In the reverse orientation, the leading strand would become the lagging strand so that upstream oligos would become lagging targeting and much more likely to recombine. This could lead to the highly modified clones that we observed during leading-targeting CoS-MAGE (Supplementary Figure S1). If this is the case, the non-selectable alleles would be upstream of the tolC selectable marker. Since co-selection is most effective downstream of the selectable marker (9), this may explain why co-selection enhancements decay rapidly with distance on the leading strand.

In this manuscript, we have identified available ssDNA on the lagging strand of the replication fork as a limiting factor in multiplex genome engineering. Compared with a standard recombineering strain (EcNR2), EcNR2.dnaG.Q576A displays on average 62% more alleles converted per clone, 239% more clones with 5 or more allele conversions and 38% fewer clones with 0 allele conversions in a given round of CoS-MAGE with 10 synthetic oligos ( Table 2 ). We used this strategy to build on our recent advances (Mosberg, J.A., Gregg, C.J., et al. in review), generating the Nuc5-.dnaG.Q576A strain, which has extended OFs and also lacks five potent exonucleases. These modifications exploited two distinct mechanisms that together increased the robustness and potency of CoS-MAGE, enabling an average of 4.50 and a maximum of 12 ARs in single cells exposed to a pool of 20 different synthetic AR oligos ( Figure 5 ). Additionally, 48% of recombinants had 5 or more ARs and only 8% had 0 modified non-selectable alleles. Furthermore, in a given round of CoS-MAGE with 10 synthetic oligos, Nuc5-.dnaG.Q576A displays on average 111% more alleles converted per clone, 527% more clones with 5 or more allele conversions and 71% fewer clones with 0 allele conversions in comparison with EcNR2 ( Table 2 ). This improvement in MAGE performance will be highly valuable for increasing the diversity explored during the directed evolution of biosynthetic pathways (4) and for enabling the rapid generation of desired genotypes involving tens to hundreds of ARs (5).


High-Efficiency Scarless Genetic Modification in Escherichia coli by Using Lambda Red Recombination and I-SceI Cleavage

FIG 1 Diagram of the two-plasmid method. (A) Antibiotic cassette fragment with I-SceI recognition sites integrated at a target via λ-Red-mediated recombination, creating an intermediate strain. (B) The intermediate strain, with a mutation(s) and I-SceI recognition sites, was transformed with the donor plasmid. Expression of I-SceI was induced by l -rhamnose or IPTG. I-SceI recognition sites in the donor plasmid and the chromosome were cleaved. Integration of the donor fragment at the cleaved site of the chromosome was mediated by λ-Red recombination. FIG 2 Plasmids used for this method. (A) pREDTKI and pREDTAI (helper plasmids), with arabinose-inducible (araB promoter) λ-Red recombinase functions and IPTG-inducible (trc promoter) I-SceI expression. (B) pKSI-1 (modular plasmid for donors), based on the high-copy-number vector pBluescript II KS(−), with an MCS and two I-SceI recognition sites. (C) Part of plasmid pMDIAI (template plasmid), with the apramycin resistance gene flanked by FRT sites and I-SceI recognition sites. For pMDISI, the apramycin resistance gene was replaced with the spectinomycin resistance gene. Pink arrow, binding sites for primers MDF and MDR.
ModificaciónHelper plasmid/promoter for I-SceI expressionDonor plasmid backboneMarker eviction rate (no. of Apr- and/or Spc-sensitive colonies/no. of tested colonies)Donor plasmid curing rate (no. of Amp- or Kan-sensitive colonies/no. of tested colonies)Correct modification rate, confirmed by PCR (no. of colonies with expected PCR bands/no. of tested colonies)Correct modification rate, confirmed by PCR fragment sequencing (no. of colonies with expected sequence/no. of tested colonies)
cadA supresiónpREDIA/rhaBpBackZero-T4/103/43/33/3
pREDTKI/trcpMD19-T20/2018/2018/204/4
gntT integraciónpREDTKI/trcpMD19-T8/107/87/74/4
pepD seamless deletionpREDKI/rhaBpKSI-13/82/32/22/2
pREDTKI/trcpKSI-16/86/66/66/6
metK mutaciónpREDKI/rhaBpKSI-19/305/99/94/4
pREDTKI/trcpKSI-118/1818/1816/184/4
metK reemplazopREDTKI/trcpKSI-12/42/22/22/2

Markerless knockout and knock-in of selected genes. (i) Knockout of cadA.

(ii) Knock-in of gdhA.

(iii) Multiple modifications.

Seamless deletion of pepD.

FIG 3 Seamless pepD deletion and PCR analysis. (A) Construct with 40-bp short arms homologous to the pepD ORF and a 600-bp pepD segment replaced by a marker. (B) Construct with arms with upstream (U) and downstream (D) homology to pepD, with truncated 1.0-kb pepD segments and the apramycin (apr) resistance gene seamlessly deleted, from ATG to TAA. (C) PCR analysis of pepD expresión. Band sizes: BL21(DE3) (wild-type pepD), 2.5 kb intermediate strain (pepD::apr), 3.2 kb final strain (ΔpepD), 0.9 kb.

Modifications in the essential metK gene.

FIG 4 Modifications to metK gene and PCR analysis. (A) Construct with IsceI-apr-IsceI cassette inserted into yqgC and IsceI-spc-IsceI cassette inserted into galP. yqgC y galP are nonessential genes next to metK. (B) Wild-type (WT) metK and resistance genes were replaced by mutated metK or the SAM transporter gene. los galP fragment and speA-yqgB-yqgC fragment were homologous arms. (C) PCR analysis of metK. Band sizes: MG1655 (wild-type metK), 2.8 kb intermediate strain A10 (yqgC::apr galP::spc), 5.9 kb final strain with mutated metK, 2.8 kb (the same length as wild-type metK) final strain with metK replaced by SAM transporter gene, 2.6 kb.

Recombineering with overlapping single-stranded DNA oligonucleotides: testing a recombination intermediate

A phage lambda-based recombination system, Red, can be used for high-efficiency mutagenesis, repair, and engineering of chromosomal or episomal DNA in vivo in Escherichia coli. When long linear double-stranded DNA with short flanking homologies to their targets are used for the recombination, the lambda Exo, Beta, and Gam proteins are required. The current model is: (i) Gam inhibits the host RecBCD activity, thereby protecting the DNA substrate for recombination (ii) Exo degrades from each DNA end in a 5' --> 3' direction, creating double-stranded DNA with 3' single-stranded DNA tails and (iii) Beta binds these 3' overhangs to protect and anneal them to complementary sequences. We have tested this model for Red recombination by using electroporation to introduce overlapping, complementary oligonucleotides that when annealed in vivo approximate the recombination intermediate that Exo should create. Using this technique we found Exo-independent recombination. Surprisingly, a similarly constructed substrate with 5' overhangs recombined more efficiently. This 5' overhang recombination required both Exo and Beta for high levels of recombination and the two oligonucleotides need to overlap by only 6 bp on their 3' ends. Results indicate that Exo may load Beta onto the 3' overhang it produces. In addition, multiple overlapping oligonucleotides were successfully used to generate recombinants in vivo, a technique that could prove useful for many genetic engineering procedures.

Cifras

Model for Red-mediated recombination. λ…

Model for Red-mediated recombination. λ Exo enters a dsDNA end and degrades one…

Model to explain the high…

Model to explain the high recombination frequency of dsDNA with 5′ overhangs. Los…


Introducción

Essential bacterial genes are an especially interesting target for DMS because they play an important role in bacterial evolution (Long et al, 2015 Maddamsetti et al, 2017 ), the emergence of antibiotic resistance (Walsh, 2000 Allen et al, 2010 ), and strain engineering (Winkler et al, 2016 de Jong et al, 2017). It is important to modify the essential genes in their native genomic context. Expressing essential genes on plasmids alters the cellular fitness because of different expression levels due to copy number effects (Gibson et al, 2013 ) and the loss of epigenetic regulation. Current genome mutagenesis techniques suffer from low-editing efficiencies and mutational biasing, which greatly decrease the quality of the fitness data (i.e., due to the overabundance of wild type or a few over-represented members). As such, comprehensive DMS of essential genes using these approaches has remained elusive, especially in bacteria.

Bacterial genome-editing technologies have advanced greatly in the past decade. One technology is multiplexed automated genome engineering (MAGE) that is based on lambda Red-mediated recombination of single-stranded oligos for desired allelic exchange on the genome or “Recombineering” (Wang et al, 2009). The efficiency of introducing a single nucleotide change using recombineering is often very low and context-dependent (Sharan et al, 2009). Using MAGE, efficiency and throughput are improved by re-transforming the same large pool of oligos over repeated cycles (Wang et al, 2009). This technique has been successfully used for several outstanding synthetic biology and metabolic engineering applications (Wang et al, 2009 Sandoval et al, 2012 Lajoie et al, 2013b Raman et al, 2014 Amiram et al, 2015). However, it may be difficult to apply MAGE for DMS of essential genes. Due to the repeated transformation cycles during library construction, the mutations that are deleterious or even neutral to the host would be lost (Wang et al, 2009). Repeated heat shock and electroporation during the recombineering cycles in the MAGE protocol (Wang et al, 2009 ) would also add additional stress that would be detrimental to the diversity in essential genes. Additionally, in order to increase the efficiency of recombination in MAGE, significant modifications such as deletion of methyl-directed mismatch repair (MMR) and DNA primase (dnaG) are required, which change the native genetic context (Wang et al, 2009 Sawitzke et al, 2011 ). Deletion of mismatch repair systems increases the background mutation rate (Isaacs et al, 2011 ), which may also confound fitness estimates.

Genome-editing technologies developed using CRISPR/Cas9-mediated recombineering have helped address several challenges with MAGE. A chimeric guide RNA (gRNA) programs the Cas9 endonuclease to induce a DNA double-strand break (DSB) at any genomic target upstream of a 5′-NGG-3′ PAM sequence and complementary to the 20-bp spacer sequence in the gRNA (Jinek et al, 2012). In several bacteria, including Escherichia coli, the Cas9:gRNA-mediated DNA DSB induces cell death due to a lack of adequate DSB repair pathways (Jiang et al, 2013). Therefore, Cas9:gRNA-induced DSBs can select for PAM substitutions introduced by recombineering (Cong et al, 2013 Jiang et al, 2013). Synonymous PAM-inactivating mutations (SPMs) can be coupled to other mutations in the same recombination template for precise genome manipulation with high efficiency using a single transformation step (Pyne et al, 2015 Reisch & Prather, 2015 Bassalo et al, 2016 Chung et al, 2017 Wang et al, 2018 ).

High-throughput genome editing with Cas9-mediated recombineering was achieved recently using CRISPR-enabled trackable genome engineering (CREATE) (Garst et al, 2017). Using CREATE, the DNA encoding the gRNA expressed under a constitutive promoter was covalently linked to the DNA repair template on 250-bp editing cassettes (Garst et al, 2017). Over 100,000 editing cassettes can be synthesized on microarray chips and subsequently cloned in high-throughput into cells with active Cas9 and lambda Red recombination to generate genome-wide mutation libraries. The editing cassettes on the plasmid also serve as the barcode to track the mutations before and after selection to assign fitness scores to each mutation (Garst et al, 2017). The technology has been used for directed evolution of E. coli proteins, pathways, and strains (Shalem et al, 2014 Cobb et al, 2015 Cho et al, 2017 Liang et al, 2017 Liu et al, 2017 Lu et al, 2017 Wu et al, 2017a , b Zhu et al, 2017 Bassalo et al, 2018 ). However, applying CREATE for DMS proved to be challenging. Anywhere between 10 and 60% of randomly chosen gRNA targeting different genomic loci have been shown not to induce Cas9:gRNA-induced cell death (Cui & Bikard, 2016 Zerbini et al, 2017). Consequently, due to variable selection, editing efficiency can vary between 0 and 100% across gRNAs (Garst et al, 2017 Zerbini et al, 2017). Cells with gRNAs that fail to induce DSB-mediated cell death can grow significantly faster than cells with active gRNAs undergoing DSBs and editing (Jiang et al, 2015 Cui & Bikard, 2016 ). Consequently, in high-throughput non-DSB-inducing gRNAs, with low-editing efficiency, take over the population and reduce overall editing efficiency to only

1–4% (Bassalo et al, 2018 ). Several gRNAs also cause unintended mutations on the genome that are not encoded in the repair template (Cui & Bikard, 2016 Zerbini et al, 2017). Consequently, cells with no edits and unintended mutations can be falsely tracked as beneficial mutations. Finally, each gRNA is coupled to a different synonymous PAM mutation (SPM) and synonymous mutations can lead to significant fitness effects, especially in essential genes (Lind et al, 2010 Agashe et al, 2013 Lajoie et al, 2013a ). Because of these limitations, CREATE experiments have largely been limited to finding mutants with large fitness effects in the presence of strong selective pressures (Bassalo et al, 2018 Pines et al, 2018 ).

We posited that in order to target a single genomic locus, we could use a single pre-screened gRNA and synonymous PAM-inactivating mutations (SPM). In this study, we discuss the CRISPR/Cas9-mediated genomic error-prone editing (CREPE) technology. As opposed to other Cas9-mediated high-throughput technologies in E. coli, in the CREPE protocol we use a single gRNA to integrate an error-prone PCR library of the target with the SPM on the genome (Fig 1). Recently, a similar technology, CASPER, was reported in yeast (Jakočiūnas et al, 2018 ). However, yeast has a significantly higher recombination efficiency than bacteria such as E. coli. Recombination efficiency with linear dsDNA templates is very low in E. coli (Murphy et al, 2000 ), and recombineering using dsDNA template with limited single nucleotide changes is poorly understood. Therefore, we varied the homology arm length and the Cas9 recombineering system to improve recombination and our understanding of recombination using a repair template with single nucleotide changes. We successfully developed a platform that efficiently generates unbiased and diverse genomic mutant libraries with > 80% editing efficiency for non-essential genes and > 55% efficiency for essential genes. Additionally, while CASPER was used for directed evolution, we adapted CREPE for use as a DMS platform to study essential E. coli genes in their native genomic context. Using CREPE, we scored the fitness of naturally accessible mutations in the RNA polymerase beta subunit that confer resistance to rifampicin.


Discusión

We demonstrated previously that Red-mediated recombination with synthetic single-strand oligos is very efficient and independent of RecA in E. coli. Only λ Beta appears to be required for this ssDNA recombination (Table 3) (9, 28, 36). Oligos that correspond to either of the two complementary DNA strands generate recombinants, but invariably one oligo recombines more efficiently than the other. By testing six markers in different regions of the chromosome, a pattern emerged (9). At each position, the most efficient of the two complementing oligos was the one corresponding to the lagging-strand DNA (i.e., the same sequence as the Okazaki fragments). We proposed that oligo-directed recombination occurred at the replication fork, and that the “lagging-strand oligo” is more easily annealed by Beta because of larger gaps present in the lagging strand (9, 29). Three points from the results presented here bear on our previous proposal that Beta-mediated recombination with ssDNA oligos occurs at the replication fork. First, we have demonstrated that four different oligos recombine more efficiently when each is targeted to the lagging strand than when targeted to the leading strand (Table 4). Second, we show that MMR can depress the appearance of recombinants by >100-fold (Table 2). The MMR functions MutS, MutL, MutH, UvrD helicase, and Dam methylase are required for mismatch repair at the replication fork (37). Third, when recombination occurs without bias due to MMR efficiencies, we see incredibly high recombination frequencies of 25%. It is difficult to come up with other mechanisms that generate a single-strand gap at a specific site in 25% of the cells during the time period of the experiment. We do not yet understand why 75% of the cells are resistant to recombination despite saturating levels of oligo. Among several possibilities, some cells may not be electrocompetent, may be in a state resistant to recombination, or may have the target sequestered from the oligo.

Although the lagging-strand oligos generate more recombinants than the leading-strand oligo, the leading-strand oligos are still very recombination proficient. Comparing four oligos (Table 4), lagging-strand recombinants are on average 30-fold more frequent than the leading strand. This may be explained by a proportionally different amount of ssDNA generated during replication on each side of the fork. By this logic, the gaps on the lagging-strand side would be 30 times greater than the gap on the leading-strand side. Of course, other factors could be responsible for this difference, because the type of replication and the factors present at the leading and lagging strands are different (38, 39).

One possible alternative we have explored elsewhere is that transcription generates single-strand regions and affects recombination bias (40). We found that gene transcription does not affect the strand bias observed for oligo-mediated recombination. Our results here strengthen that observation by showing that replication direction is critical to the strand bias.

There are eight possible mismatch pairs, and MutS protein has been shown to bind to each pair in vitro (41, 42). The four oligos used here generate four of those eight mismatches. Binding by MutS protein and repair by the MMR system have a similar hierarchical pattern for the eight mismatch pairs (42, 43). The pattern is G·T, A·C, A·A, G·G>T·T, T·C, A·G>C·C, where the C·C mismatch is very weakly bound and poorly corrected. Our studies support a similar pattern of repair efficiency with G·G>T·C>A·G>C·C. A 370-fold difference in repair exists between the well repaired G·G and the poorly repaired C·C mismatches (see lagging strand in Table 4). The same hierarchy and efficiency of correction were found for both the lagging and leading strands.

Because C·C mismatches are not recognized by MMR in other bacterial species (20, 44), this particular feature of oligo recombination might have the potential to create high recombination frequencies in other bacteria. For this reason and others, the ability to transfer the homologous recombination system to other bacterial species and even to eukaryotes would be very useful. Because ssDNA at the replication fork is bound by Ssb protein (45, 46), and Beta protein is important for the interaction between the oligo and the chromosome target, Beta may interact directly and specifically with Ssb (29). The λ Red system has been shown to work in Salmonella typhimurium (47–49), a species very closely related to E. coli, and it may also work in other related Gram-negative bacteria. However, for more distantly related bacteria, it may be necessary to provide Beta-like functions from phage endogenous to those bacteria. Exo- and Beta-like proteins have already been identified in other bacterial phages and even eukaryotic viruses such as HSV-1 (50, 51).

Mismatch repair functions are known to prevent DNA exchange between related species by blocking recombination between homologous but divergent sequences (homeologous recombination) (24). A difference between the role of mismatch repair in homeologous recombination and in replication is that in the former, MutS and MutL appear to be required, whereas MutH and UvrD helicase have less importance (24, 25, 52). It is believed that MutS and MutL bind mismatches generated during homeologous exchanges, and the binding itself aborts further recombination without causing repair (53, 54).

Our results suggest the inhibition of oligo-mediated recombination by MMR functions is more analogous to the correction of DNA replication errors than to the role of MMR functions during homeologous recombination. MMR functions tested, including UvrD and MutH, appear to remove mismatches generated during oligo recombination and replication (Table 2). Also, unlike homeologous recombination, Feinstein and Low (55) found that during E. coli conjugation between sequences with very few mismatches, the MMR system inhibited recombination and that, like oligo-mediated recombination, MutH and helicase are required. Perhaps, as we suggest for oligo recombination, the incoming strand transferred during normal conjugation is annealed at the replication fork. An alternative is that the recombination intermediates formed generate a new replication fork (39, 56, 57) and recruit the MMR complex. A recent discovery that ssDNA modification of murine embryonic stem cells is inhibited by MMR is consistent with our results and may indicate that in stem cells, the modification is also at the replication fork (58).

los en vivo recombination technologies we describe, due to their efficiency, accuracy, and simplicity, may replace classical in vitro genetic engineering techniques. The λ Red-mediated homologous recombination system, which we use as a genetic engineering tool, is particularly useful for modifying the genome of E. coli, as well as cloned genome segments from other organisms (29, 59, 60). This study creates new opportunities for genome modification and en vivo analyses of DNA mechanics. Using synthetic oligos, recombinants with the chromosome and episomes can occur at such high efficiencies that selection is not required. Oligos that create C·C mispairs are recombined into the DNA of cells at efficiencies approaching 25% among the survivors of electroporation. In other words, it might be possible to generate a C replacement of G anywhere in the chromosome at these high efficiencies if the change is not toxic to the cell. Recombination levels approaching 25% were also found for any oligo-generated mismatch in strains defective for the MMR functions tested. This advance in technology allows efficient genetic modifications and may permit nucleotide analogs and adducts to be incorporated directly into the chromosome for en vivo biochemical studies.


Ver el vídeo: Hablemos sobre Electroporación (Julio 2022).


Comentarios:

  1. Todal

    Excusa, se elimina

  2. Gogul

    Estoy de acuerdo, la opinión muy divertida

  3. Najja

    Se ha detenido en un foro y ha visto este tema. ¿Me permites ayudar?

  4. Eferleah

    De acuerdo, muy divertida opinión.

  5. Zulubar

    Yo sobre tal y tal no escuché todavía

  6. Trypp

    jovencito



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