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Clase 22: Genómica, Proteómica y Metabolómica - Biología

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Clase 22: Genómica, proteómica y metabolómica

Genómica y sus aplicaciones

Un curso de pregrado ofrecido por el Centro de Enseñanza y Aprendizaje de Biología.

  • Ofrecido por el Centro de Enseñanza y Aprendizaje de Biología
  • ANU College ANU Joint Colleges of Science
  • Materia del curso Biología
  • Áreas de interés Plant Science
  • Carrera académica UGRD
  • Convocante del curso
    • Dr. Xin Hou
    • Profesor Justin Borevitz
    • BIOL6163
    • Ofrecido por el Centro de Enseñanza y Aprendizaje de Biología
    • ANU College ANU Joint Colleges of Science
    • Materia del curso Biología
    • Áreas de interés Plant Science
    • Carrera académica UGRD
    • Convocante del curso
      • Dr. Xin Hou
      • Profesor Justin Borevitz
      • BIOL6163

      Este curso se ha ajustado para participantes remotos, sin embargo, es preferible la asistencia a las actividades en el campus.

      El objetivo de este curso es enseñar genómica, transcriptómica, proteómica, metabolómica y fonémica utilizando organismos modelo que representan plantas y animales. El curso cubrirá desarrollos recientes en genómica, expresión génica y ARN pequeños, biología sintética, epigenética, proteómica, genética de avance rápido y mapeo de próxima generación. Un objetivo del curso es desarrollar habilidades en diseño experimental dentro del contexto del aprendizaje de la biología, incluyendo: regulación de la transcripción y traducción, respuesta al estrés, transducción de señales y la ingeniería y regulación de vías metabólicas.

      Opción de la vía de honores (HPO)

      El HPO consiste en un aprendizaje interactivo y basado en la investigación, ejercicios prácticos sobre técnicas moleculares, incluida la RT-PCR cualitativa para medir la abundancia de ARNm. Los ejercicios prácticos adicionales brindan experiencia de habilidades de laboratorio adicionales, una oportunidad para desarrollar análisis de datos más complejos y habilidades interpretativas y una extensión de la teoría cubierta en el curso.


      Por qué la proteómica no es la nueva genómica y el futuro de la espectrometría de masas en biología celular

      La espectrometría de masas (MS) es una parte esencial del conjunto de herramientas de proteómica del biólogo celular, que permite análisis a escalas moleculares y de todo el sistema. Sin embargo, la proteómica todavía está por detrás de la genómica en popularidad y facilidad de uso. Discutimos las diferencias clave entre la ómica basada en la EM y otras tecnologías de la ómica en auge y destacamos lo que vemos como el futuro de la EM y su papel en nuestra comprensión cada vez más profunda de la biología celular.

      A mediados de la década de 1990, la EM entró con fuerza en el campo de la biología celular, cuando se hizo evidente su potencial para identificar y cuantificar proteomas completos. En 2014, Naturaleza publicó un número titulado & # x0201cThe human proteoma, & # x0201d que contiene estudios que analizan el proteoma de tejidos humanos y líneas celulares utilizando EM y generan una gran cantidad de datos (Kim et al., 2014 Wilhelm et al., 2014). Ese mismo año, Hebert et al. (2014) publicó & # x0201c El proteoma de levadura de una hora, & # x0201d, donde demostraron que aproximadamente una hora de separación cromatográfica junto con MS de alto rendimiento es suficiente para lograr una amplia cobertura de proteoma para un organismo simple como la levadura. Este fue un hito para la proteómica basada en EM, lo que demuestra el alto rendimiento de la técnica. Hoy en día, el número de instalaciones y servicios centrales de proteómica está creciendo, lo que indica que la técnica alcanzó un nivel de solidez y reproducibilidad que puede separarse de laboratorios de investigación específicos que tengan la experiencia técnica requerida para la EM. Uno podría pensar que el campo de la proteómica es donde estaba el campo de la genómica hace & # x0223c15 años. Sin embargo, una estadística interesante surge del recuento de publicaciones científicas: en los últimos 10 años más o menos, los estudios de genómica han estado creciendo a un ritmo más rápido que la proteómica (Fig. 1 A). ¿Cómo es que la proteómica no es todavía la nueva genómica? ¿Qué le falta a la EM para convertirse en la herramienta ideal para una caracterización integral de los sistemas biológicos? Desde este punto de vista, destacamos los obstáculos comunes que impiden la interpretación exitosa de datos en el campo de la EM y los contrastamos con el rápido progreso observado en el campo de la genómica. También discutimos cómo la comunidad de biología celular, al superar estos obstáculos en la interpretación de datos y el intercambio de material, puede utilizar la EM para alcanzar niveles más profundos de análisis a nivel de una sola célula y de todo el sistema.

      EM pasado, presente y futuro. (A) Número de publicaciones que contienen los términos genómica, proteómica o metabolómica en el título o en el resumen (basado en PubMed). Cada valor por año se normalizó por el total de todos los años analizados. (B) La misma representación se remonta a 1996. Los artículos se contaron si contenían el término & # x0201cmass spectrometry & # x0201d más el término que figura en la leyenda. (C) Representación de aplicaciones de estudios proteómicos basados ​​en EM. La ionización ambiental permite la identificación específica del sitio de los analitos; la reticulación conserva las interacciones.

      ¿Por qué las aplicaciones y los resultados de la EM siguen siendo tan difíciles de interpretar?

      Por definición, un espectrómetro de masas determina la relación masa / carga de una señal ionizada en fase gaseosa, que se puede convertir en la masa de la molécula. Por lo tanto, se pueden realizar innumerables experimentos en los que se utiliza una masa o un desplazamiento de masa como lectura. La proteómica se utiliza principalmente para (a) la identificación de péptidos, proteínas y modificaciones postraduccionales (b) la medida de la cantidad de proteínas o el recambio, mediante la combinación de técnicas de etiquetado con EM (c) la caracterización de la estructura de la proteína y (d) la identificación de interacciones de proteínas con proteínas o ácidos nucleicos (p. ej., He et al., 2016). Esta plétora de aplicaciones requiere esfuerzos enfocados y, por lo tanto, los laboratorios de EM se han especializado para optimizar los métodos para una aplicación de interés. Hoy en día, es común referirse a un laboratorio de proteómica dedicado al análisis de la estructura de las proteínas y a un laboratorio diferente para las interacciones entre proteínas y proteínas, ya que la configuración instrumental completa probablemente sea diferente. Esta especialización de laboratorios no se ha producido en genómica, ya que experimentos como la secuenciación de inmunoprecipitación de cromatina, la secuenciación de ARN, el ensayo de cromatina accesible a transposasa con secuenciación de alto rendimiento y la secuenciación profunda requieren tipos de conocimientos similares en el funcionamiento del instrumento y en el análisis de datos.

      Además, el campo de la EM se enfrenta a diferentes dificultades del campo de la genómica. Parte del problema es que las secuencias de nucleótidos de sensibilidad se pueden amplificar, lo que permite análisis hasta el nivel de una sola célula, lo que actualmente es imposible para proteínas y metabolitos, además de raras excepciones. Otra dificultad se relaciona con la distribución gratuita de software para el análisis de datos en genómica, las herramientas bioinformáticas casi nunca son propietarias, mientras que es una práctica mucho más común para la proteómica y la metabolómica. Por último, los resultados de MS suelen ser más complejos de interpretar, ya que el resultado depende del método de adquisición y la plataforma de análisis de datos. Además, un desafío considerable en el campo de la EM es definir cuánto es & # x0201creal en el resultado. & # X0201d Todo científico de EM que se ha ocupado de la colaboración conoce la sensación de mirar a un biólogo a los ojos mientras pregunta, & # x0201d # x0201c ¿Este metabolito está presente en mi muestra? ¿Y se ha ido después del tratamiento? & # X0201d A veces, la respuesta no es simple & # x0201cyes & # x0201d o & # x0201cno. & # X0201d Los espectrómetros de masas son instrumentos muy sensibles (límite de detección & # x0003c attomoles), sino que definen el umbral entre señal y ruido es difícil. Es posible que pueda seleccionar una señal que, una vez fragmentada, produzca un patrón muy similar al metabolito de interés. Además, los espectrómetros de masas son instrumentos cuantitativos; la intensidad de la señal puede correlacionarse con su abundancia en la muestra. Sin embargo, la señal del analito de interés podría mezclarse con ruido de fondo, ya que otros metabolitos podrían tener masas isobáricas, es decir, la misma composición atómica pero diferente estructura. Por lo general, la respuesta al colaborador es: & # x0201c ¡Veo una molécula con la misma masa que su metabolito de interés y no puedo detectar una señal en el tratamiento! & # X0201d Puede decir por sus ojos que una la respuesta es deseable. Se trata más de un problema de comunicación que de resultados poco fiables o poco claros. Los científicos están acostumbrados a realizar análisis a nivel del genoma que pueden realizarse a partir de una sola célula con una determinación inequívoca de una ubicación genómica específica o de la presencia de una mutación. Un espectrómetro de masas detecta todo lo que ioniza, no solo la biomolécula de interés. De hecho, los espectrómetros de masas ofrecen alta resolución (& # x0003e400,000 masa / & # x00394mass), alta precisión de masa (& # x0003c1 ppm), alta sensibilidad (& # x0003cattomol) y alta velocidad (12 & # x0201320 Hz), lo que significa que pueden generar fácilmente 12 & # x0201320 espectros de masas en un segundo de análisis. La proteómica, la metabolómica y la lipidómica se ocupan de muestras muy complejas con un amplio rango dinámico en abundancia de analitos. La complejidad de la muestra conduce a espectros mixtos de interpretación difícil, y el rango dinámico de la muestra perjudica la cuantificación lineal para señales poco abundantes. La gran sensibilidad de la EM es un riesgo de falsos positivos, por lo que los analistas expertos tienden a ser conservadores a la hora de proporcionar resultados.

      Dados los desafíos en la interpretación de datos, ¿cómo podemos confiar en los resultados de la EM?

      Para ayudar a reducir el riesgo de falsos positivos, los esfuerzos técnicos se han centrado en la cromatografía de gases y líquidos para optimizar el acoplamiento en línea a MS, ya que la cromatografía reduce la complejidad de la señal dentro de cada escaneo de MS y aumenta la confianza en la identificación de espectros. Aunque la tecnología de la EM se ha vuelto más rápida y sensible, también se han desarrollado más y mejores herramientas bioinformáticas para la EM (Fig. 1 B). Actualmente existen alrededor de 20 motores de búsqueda de bases de datos diferentes para análisis de proteómica, varios de ellos gratuitos, lo que refleja el esfuerzo por la identificación segura de espectros y mezclas de proteínas. Se observa una tendencia similar para la metabolómica, a pesar de que, en cierto sentido, es un campo académico más joven que la proteómica y hay menos herramientas disponibles. Gracias a los recientes avances computacionales, la cuantificación de proteínas es más precisa. El recuento espectral se basó literalmente en el recuento de espectros que identificaron una determinada proteína, utilizando un enfoque similar a los análisis genómicos que cuentan el número de lecturas que cubren una secuencia específica. Sin embargo, la MS no puede proporcionar la profundidad de cobertura proporcionada por la secuenciación de alto rendimiento. Los péptidos de baja abundancia se detectan dentro de una MS ejecutada por uno a cinco espectros, que son valores insuficientes para una cuantificación precisa. Hoy en día, el software extrae automáticamente la intensidad o el área de los cromatogramas iónicos y asocia esas señales con identificaciones de péptidos o metabolitos generados dentro de la misma ejecución de MS. Por tanto, se presta especial atención a la cromatografía, que debe proporcionar picos definidos y con forma de Gauss. Recientemente, la cuantificación mejoró en precisión gracias a métodos de adquisición independientes de datos (Gillet et al., 2012), que permiten la extracción de cromatogramas de precursores y de fragmentos de un analito, aumentando la confianza en la selección de la señal adecuada. La proteómica y la metabolómica son ahora disciplinas cuantitativas fiables, mientras que hace unos años fueron etiquetadas como & # x0201csemi-quantitative & # x0201d. Sin embargo, la reproducibilidad es aún menor que en genómica, ya que los cromatogramas iónicos son más complejos de extraer con alta confianza en comparación con las lecturas de bibliotecas de ADN. Por lo tanto, las estadísticas estrictas, como la corrección para múltiples pruebas, casi nunca se aplican a los valores cuantitativos de los estudios de EM, y el cambio de un solo pliegue a veces se usa erróneamente como un umbral para filtrar los resultados relevantes (por ejemplo, Najm et al., 2015).

      ¿Qué aporta la EM a la biología celular?

      A pesar de importantes limitaciones, la EM tiene indudables ventajas. Aunque es obvio, mucha información sobre el fenotipo celular no se puede detectar de otra manera, incluidas las modificaciones postraduccionales de las proteínas, las interacciones de las proteínas, la abundancia de metabolitos y, no menos importante, la estequiometría de las proteínas (Schwanh & # x000e4usser et al., 2011). Los experimentos que comparan la muestra A con la muestra B suelen ignorar el concepto de impedimento proteico. Sin embargo, es importante tener en cuenta que las proteínas ocupan la gran mayoría de la célula y que el número de biomoléculas tan grandes afecta la forma y el comportamiento de la célula. Probablemente, una proteína regulada al alza de 20 a 40 copias tiene un efecto diferente que una que cambia de 10 a 20 millones de copias, aunque los resultados muestren el mismo cambio doble. Los resultados de la EM se ven afectados inevitablemente por este problema. Por ejemplo, se identifican menos proteínas en una fibra muscular que sus respectivas células madre. Esto no solo se debe a las dificultades para homogeneizar un tejido diferenciado, sino también a que una célula especializada expresa más copias de proteínas específicas, suprimiendo la señal de otras. Tener en cuenta una comprensión cuantitativa de la abundancia de proteínas y las proporciones relativas de proteínas en las células no solo es necesario para obtener una mejor comprensión del sistema estudiado, sino que también ayuda con la normalización adecuada de los datos y facilita el diseño experimental.

      ¿Hacia dónde se dirige la EM?

      Incluso con muchas adaptaciones especializadas de los protocolos y equipos de la EM, cierta información es difícil de extraer en función de la masa del analito de interés, lo que revela importantes límites técnicos sobre las cuestiones biológicas celulares que se pueden abordar con la EM. Por ejemplo, estudiar el plegamiento de proteínas es un desafío, ya que dos proteínas con la misma secuencia pero plegamiento diferente producen una única señal en la EM. Este límite técnico ha sido abordado en parte por el desarrollo de la movilidad iónica (Kanu et al., 2008), que consiste en un tubo dentro del espectrómetro de masas lleno de gas que genera un rozamiento sobre las moléculas que vuelan hacia él (Fig.1 C ). Intuitivamente, una proteína desplegada tiene una sección transversal más grande que una plegada, por lo que se retendrá durante un período más largo y la mezcla generará dos señales distintas. Se trata básicamente de una nueva dimensión de separación, que se puede utilizar para analizar por separado dos especies a pesar de tener la misma masa. Curiosamente, la movilidad iónica ha ganado más popularidad en la comunidad de la metabolómica que la de la proteómica, lo que puede deberse a que los metabolitos incluyen una gran cantidad de moléculas con la misma masa intacta. La fragmentación de MS, también llamada MS en tándem o MS / MS, se usa para aumentar la confianza en la identificación del analito, ya que el patrón de fragmentación de un péptido o metabolito es más único que su masa intacta. Por lo tanto, la MS / MS puede usarse para discriminar entre múltiples especies con la misma masa intacta, pero a veces es insuficiente y, por lo tanto, la movilidad iónica ha ayudado a aumentar la confianza al caracterizar una característica adicional del analito llamado & # x0201cdrift time. & #. x0201d

      Más allá de las mejoras técnicas para interrogar mejor los mismos temas de biología celular, el campo también está bajo presión para ampliar el nivel de análisis. En la actualidad, a los laboratorios de EM se les pregunta de forma rutinaria: & # x0201c¿Podemos hacer análisis de células individuales? & # X0201d Esta pregunta suele ser importante porque una muestra puede ser una mezcla de tipos de células heterogéneos que no se pueden clasificar fácilmente. La proteómica y la metabolómica viven en el eterno conflicto entre simplificar el flujo de trabajo mientras se mantiene la profundidad de cobertura, determinar la localización de analitos específicos y adoptar estrategias de purificación cada vez más complejas. Desafortunadamente, no es posible determinar la localización de orgánulos de proteínas o metabolitos a partir de un lisado de tejido si la muestra de tejido se homogeneiza antes del análisis de EM. Así, una nueva disciplina en la EM está ganando popularidad & # x02014imagen (Fig. 1 C). Cualquier molécula que vuele y se ionice potencialmente entra en el espectrómetro de masas. Bajo este supuesto, se han desarrollado algunas fuentes de iones para cargar y sublimar analitos, generando un campo llamado & # x0201cambient MS & # x0201d (Cooks et al., 2006). La fuente de iones es normalmente un láser, pero también podría ser una ionización por electropulverización por desorción (Tak & # x000e1ts et al., 2005). Finalmente, la muestra se coloca sobre un soporte y se escanea generando una imagen pixelada. Cada uno de esos píxeles corresponde a un espectro, por lo que es posible controlar la localización de un analito específico extrayendo los espectros que contienen dicho ion de una manera similar a la cromatografía de iones extraídos. Hoy en día, la EM de imágenes ha alcanzado aplicaciones traslacionales (por ejemplo, iKnife [Balog et al., 2013]). iKnife aprovecha las características de los bisturíes electroquirúrgicos utilizados durante las disecciones y crea un pequeño aerosol del tejido durante el corte. Dicho aerosol puede introducirse en un espectrómetro de masas y los espectros generados se controlan en tiempo real. Al tener el software instruido para identificar la huella digital de espectros, por ejemplo, tejidos sanos y tumorales, es posible determinar sobre la marcha la naturaleza del tejido que se extirpa.

      Hacia una visión integrada de la EM y otros análisis ómicos

      La generación de imágenes MS y la movilidad iónica han impulsado rápidamente el campo al mejorar la interpretación y resolución de datos, y estos desarrollos se han recibido con gran interés y entusiasmo. Atestiguando un cambio en el campo, en la conferencia anual de la Sociedad Estadounidense de Espectrometría de Masas de 2016, tres sesiones orales se dedicaron exclusivamente a la movilidad iónica y cuatro a la obtención de imágenes, mientras que solo una sesión combinó enfoques antiguos basados ​​en la EM, incluida la electropulverización, asistida por matriz desorción / ionización láser y analizadores de masas. El enfoque reciente en la obtención de imágenes de la EM muestra que el futuro de la EM va más allá de la detección masiva. Llegamos a una etapa en la que la secuenciación de alto rendimiento y la EM abarcan todas las disciplinas a gran escala que podemos definir: genómica, transcriptómica, proteómica, metabolómica y lipidómica. Con esta cantidad de información, ¿cómo no lo sabemos ya todo? La mayoría coincide en que combinar los resultados de todas esas técnicas es el futuro de la biología celular (Gomez-Cabrero et al., 2014). Sin embargo, los desafíos anidados en la infraestructura computacional necesaria son significativos. Primero, los sistemas son muy dinámicos. Los mecanismos epigenéticos están regulados a lo largo de toda la vida Los metabolitos varían en un solo día debido a que el reloj circadiano (Minami et al., 2009) cambia el estado de fosforilación de proteínas en milisegundos, por ejemplo, en los sinaptosomas (Craft et al., 2008). El tiempo debería ser entonces una variable al fusionar las diferentes ómicas en el estudio de un sistema biológico, pero esto requiere múltiples mediciones y agrupaciones, lo que no siempre es factible. Otro problema es la comunicación entre campos. Destacamos algunos malentendidos entre científicos con experiencia en secuenciación o basados ​​en MS, pero hay más presentes. La solución no es simple, pero una colaboración más interdisciplinaria sería un buen punto de partida. Además, especulamos que no solo se impartirán clases de genómica, sino también de proteómica y metabolómica en los cursos de bioquímica y biología molecular.

      En conclusión, prevemos que en los próximos 10 años habrá al menos un espectrómetro de masas en cada departamento de biología. La flexibilidad y el potencial de la EM quedan por explotar al máximo, y la creatividad de los investigadores de la EM solo está limitada por las preguntas que se plantean. Aplicaciones como la proteómica se están convirtiendo en un servicio técnico de rutina que ya no requiere investigadores altamente especializados, pero, en nuestra opinión, todavía no lo hemos logrado. Se necesitarán algunos años más para que otras aplicaciones, como la metabolómica, muestren todo su potencial, y se necesitan científicos altamente capacitados enfocados en el avance de la tecnología para impulsar el campo. La movilidad iónica y las imágenes han demostrado su relevancia, pero teniendo en cuenta la cantidad de investigación en curso sobre los desarrollos metodológicos, es seguro asumir que lo mejor aún está por llegar. Por último, las aplicaciones emergentes como la microfluídica, es decir, la aplicación de células enteras en la EM, todavía tienen que ir más allá de las pruebas de concepto, y recomendamos mantener la mente abierta al respecto, ya que la EM es capaz de hacer esto y mucho más. La EM todavía tiene mucha optimización por delante, pero también mucho que ofrecer, y estamos entusiasmados con la futura investigación colaborativa basada en la EM para proporcionar información sobre los rincones de la biología celular que antes eran inaccesibles.


      Enseñanza dirigida por la investigación

      Todos los conferenciantes son expertos en el campo en el que están dando conferencias. El material de la conferencia presentado se basa en nuevas investigaciones que proporcionan conocimientos actuales y ejemplos de los conceptos biológicos fundamentales enseñados. Esto expone a los estudiantes a las técnicas y la innovación actuales, que los conecta con las ideas actuales en el campo de la ciencia. Además, los estudiantes tienen la oportunidad de interactuar con una variedad de científicos en diferentes etapas de su carrera, lo que permite un entorno para que los estudiantes hagan conexiones para posibles proyectos de investigación futuros.

      Además, las conferencias complementan el componente práctico del curso, que tiene como objetivo fomentar y enseñar las habilidades requeridas en un entorno de investigación. Estas habilidades van desde técnicas prácticas básicas, hasta aprender a analizar críticamente y discutir la teoría detrás de la ciencia, todo mientras se racionalizan y se aplican a los resultados obtenidos en la práctica.


      Metodología de ensayo

      Mientras que los ácidos nucleicos comprenden de cuatro a cinco motivos químicos similares, las proteínas y metabolitos abarcan una amplia gama de tamaño, polaridad y estructura, lo que plantea considerables desafíos analíticos. Para una revisión detallada de las metodologías proteómicas y metabolómicas, se remite al lector a otras revisiones en profundidad (15 & # x0201318). La espectrometría de masas (MS), que diferencia iones (por ejemplo, fragmentos de péptidos o metabolitos) sobre la base de la relación masa-carga, ha sido un caballo de batalla importante tanto para la proteómica como para la metabolómica. Normalmente, la EM se acopla a técnicas de separación iniciales, como la cromatografía líquida (CL) o la cromatografía de gases, que pueden tener un efecto sustancial sobre qué analitos se miden en última instancia. La electroforesis en gel bidimensional también se ha utilizado ampliamente en proteómica, mientras que la espectrometría de resonancia magnética nuclear ha sido una alternativa importante para la metabolómica. Para la EM, las proteínas deben digerirse enzimáticamente en múltiples péptidos y fragmentos de péptidos más pequeños antes del análisis. Este requisito de preparación de muestras preanalíticas complejas ha limitado históricamente el rendimiento de la proteómica basada en EM. Más recientemente, se han desarrollado métodos altamente multiplexados que capturan y detectan cientos o miles de proteínas (15,19). La captura de proteínas específicas se logra utilizando anticuerpos o aptámeros marcados con nucleótidos (basados ​​en ácidos nucleicos), y luego la detección y cuantificación se basan en la oligomerización de ácidos nucleicos. La amplitud, sensibilidad y rendimiento de estos enfoques los convierte en poderosas herramientas de investigación que se pueden aplicar a grandes poblaciones de estudio. Tanto para la proteómica como para la metabolómica, la validación del ensayo es importante. Tradicionalmente, esto ha implicado el uso de un enfoque ortogonal para confirmar los mejores resultados, por ejemplo, ELISA para proteínas o MS en tándem para metabolitos. Debido a que los enfoques proteómicos y metabolómicos generalmente proporcionan información sobre los niveles relativos de proteínas o metabolitos, en lugar de concentraciones absolutas, también pueden ser necesarios métodos ortogonales para la cuantificación absoluta.


      Abstracto

      La metabolómica es un campo apasionante en la biología de sistemas que proporciona una lectura directa de las actividades bioquímicas que tienen lugar dentro de un individuo en un momento determinado. Los niveles de metabolitos están influenciados por muchos factores, incluido el estado de la enfermedad, el medio ambiente, los medicamentos, la dieta y, lo que es más importante, la genética. Gracias a su naturaleza dinámica, los metabolitos son útiles para el diagnóstico y pronóstico, así como para predecir y controlar la eficacia de los tratamientos. Al mismo tiempo, los fuertes vínculos entre los perfiles genéticos y metabólicos de un individuo permiten la investigación de las vías que subyacen a los cambios en los niveles de metabolitos. Por lo tanto, para que el campo de la metabolómica rinda todo su potencial, los investigadores deben tener en cuenta los factores genéticos subyacentes a la producción de metabolitos y el papel potencial de estos metabolitos en los procesos patológicos. En esta revisión, se describen los aspectos metodológicos relacionados con el perfil metabolómico y cualquier vínculo potencial entre la metabolómica y la genética de algunas de las enfermedades reumáticas más comunes. También se discuten los vínculos entre la metabolómica, la genética y los campos emergentes como el microbioma intestinal y la proteómica.


      Diagnósticos y biosensores personalizados: una revisión de la biología y la tecnología necesarias para la medicina personalizada

      La explotación de los florecientes campos de la genómica, la proteómica y la metabolómica mejora la comprensión de la fisiología humana y, fundamentalmente, las mutaciones que señalan la susceptibilidad a enfermedades. A través de estos campos emergentes, son posibles enfoques de diseño racional para el diagnóstico, el desarrollo de fármacos y, en última instancia, la medicina personalizada. La medicina personalizada y las técnicas de prueba en el lugar de atención deben cumplir una serie de limitaciones para su aplicabilidad en el mundo real. Los dispositivos de punto de atención (POCD) deben proporcionar en última instancia una alternativa rentable a las pruebas de laboratorio costosas y que requieren mucho tiempo para ayudar al personal de atención médica con el diagnóstico de enfermedades y las decisiones de tratamiento. Las tecnologías de sensores también se están expandiendo más allá de las clases más tradicionales de biomarcadores (ácidos nucleicos y proteínas) hacia los metabolitos y la detección directa de patógenos, lo que finalmente aumenta la paleta de técnicas disponibles para el uso de la medicina personalizada. Las tecnologías necesarias para realizar dichos diagnósticos también han evolucionado rápidamente, y cada generación es cada vez más sensible y selectiva, al tiempo que se preocupa más por los recursos. En última instancia, el obstáculo final para todas estas tecnologías es poder impulsar la adopción por parte del consumidor y lograr un resultado médico significativo para el paciente.


      Manual de investigación del genoma: genómica, proteómica, metabolómica, bioinformática, cuestiones éticas y legales

      Christoph W. Sensen estudió Biología en las Universidades de Mainz, Dusseldorf y Koln, Alemania. Después de completar su trabajo postdoctoral en el Laboratorio Europeo de Biología Molecular (EMBL) en Heidelberg, se unió al Instituto de Biociencias Marinas (Consejo Nacional de Investigación), Canadá en 1994. De 1997 a 2001, Christoph Sensen fue nombrado Gerente de Proyectos en Canadian Bioinformatics Resource ( CBR-RBC) y ocupó una cátedra completa en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Calgary en 2001. Christoph Sensen es autor de numerosos artículos científicos y ha editado dos libros para Wiley.

      HONORES Y PREMIOS:
      Premio al Logro Destacado Corporativo de 1998 de la NRC por la Contribución Destacada al Equipo Canadiense de Recursos Bioinformáticos
      desde 06.2002 Miembro de la Facultad Internacional, Escuela Internacional de Posgrado en Bioinformática e Investigación del Genoma
      Premio de honor de Computerworld 2003
      2003 El premio Duke's Choice Award por las mejores aplicaciones y productos Java en JavaOne 2003


      Metabolómica y lipidómica

      La metabonómica, o metabolómica, es la menos madura de la tríada de biología de sistemas, que también incluye la genómica y la proteómica. La distinción entre metabonómica y metabolómica a menudo ha sido confusa e inconsistente en la literatura. Nicholson et al. inicialmente se definió "metabonómica" como la medida cuantitativa de las perturbaciones en el complemento de metabolitos de un sistema biológico integrado en respuesta a algunos estímulos, mientras que "metabolómica" se consideró como estas medidas en células individuales o tipos de células [1-4]. En su mayor parte, estos términos han sido usados ​​indistintamente por individuos que informan desviaciones en las concentraciones de metabolitos tanto en el sistema como en los niveles celulares debido a enfermedades, administración de fármacos o diferentes condiciones de crecimiento. En el grupo de Separaciones Ómicas y Espectrometría de Masas, consideramos la 'metabolómica' como la determinación cuantitativa de cambios relacionados con el tiempo o dependientes de estímulos en el complemento de peso molecular pequeño de un sistema biológico integrado, célula o tipos de células. De manera similar, la 'lipidómica' es un subconjunto de la metabolómica dedicada a la medición cuantitativa de lípidos.

      La metabolómica tiene su origen en los primeros trabajos de medicina ortomolecular iniciados por Robinson y Pauling [5-10], así como en el trabajo de análisis de flujo metabólico y control metabólico de Kacser [11-16] (además, la influencia del perfil metabólico en el el diagnóstico y la detección de errores congénitos del metabolismo [17-19] no pueden ignorarse, pero no se discutirán aquí). Pauling definió la medicina ortomolecular como la preservación de una salud óptima y el tratamiento de enfermedades mediante la variación de las concentraciones de sustancias endógenas necesarias para la salud [5]. Un componente esencial de la medicina ortomolecular que se relaciona directamente con la metabolómica es el diagnóstico ortomolecular, o el proceso de determinar las concentraciones de diversas sustancias en el cuerpo humano y cómo pueden relacionarse con una enfermedad determinada [5]. Los esfuerzos iniciales de Robinson y Pauling se centraron en el diseño e implementación de instrumentación para mediciones cuantitativas confiables de volátiles en la orina y el aliento humanos [20-22], que pronto fueron seguidos por mediciones cuantitativas y generalmente no dirigidas de tantas sustancias como fuera posible en un dado el análisis junto con cálculos de reconocimiento de patrones con el fin de asignar a los individuos a varios estados de enfermedad [5-7] o grupos de edad [9,10,23]. Sus análisis no dirigidos de sustancias de bajo peso molecular combinados con técnicas de reconocimiento de patrones para distinguir los estados sanos de los enfermos (o normales de los perturbados) equivalen al concepto actual de metabolómica, como se acepta generalmente en la actualidad. De manera similar, Kacser ha contribuido a la comprensión general de los parámetros y variables que deben tenerse en cuenta en los análisis de control metabólico correctamente diseñados [11]. Parámetros, como las constantes de la enzima Michaelis (Kmetro), cifras de facturación (kgato) y constantes de inhibición (KI), representan las limitaciones constantes de un sistema dado, otras como la cantidad y la calidad de la enzima se consideran bajo el control (dentro de los límites) del investigador. Alternativamente, las variables representan los niveles de metabolitos en sí mismos, que están directamente determinados por los parámetros de un sistema [11]. De particular importancia fue la idea de que las reservas de metabolitos y sus flujos no solo dependían de aquellos componentes de la vía a la que tradicionalmente se pensaba que pertenecían (p. Ej., Fumarato en el ciclo del ácido cítrico), sino también de cualquier vía a la cual o desde que pueden contribuir o derivarse (por ejemplo, fumarato en el metabolismo de la tirosina). Este pensamiento puede haber inspirado el concepto de Nicholson del "superorganismo", que describe las interacciones entre el metaboloma de un animal complejo con los de los diversos microorganismos que viven simbióticamente dentro de ese animal [3,24,25].

      Despite the essential conceptualization of metabolomics by Robinson and Pauling, a number of researchers have contributed in parallel to the refinement of that concept into a format that is consistent with other major omics approaches. The laboratories of Laseter [26-28], Novotny [29,30], and Sweeley [31] had also developed and applied gas chromatography-based methods in comparative metabolic profiling studies of various biological samples during the same timeframe. Similarly, the work of van der Graaf [32-34], among others [30,35], has furthered the use of pattern recognition approaches (also known as ‘chemometrics’) to process data from metabolic profiling experiments in order to differentiate among comparative samples. These myriad efforts culminated in the first printed reference to the ‘metabolome’ [36] and the first occurrence of the word in a title [37] in 1998. Fiehn has further clarified this field by defining four basic types of metabolite analyses: 1) targeted metabolite analysis, 2) metabolic profiling, 3) metabolomics, and 4) metabolic fingerprinting [38,39]. Again, the terms describing these types of metabolite analyses tend to be used interchangeably and often incorrectly (as defined by Fiehn) in the literature. However, standardization of nomenclature is only one of the many goals established by both the Metabolomics Society [40] and the U.S. National Institutes of Health (at the Metabolomics Standards Workshop) [41].

      Metabolomics Technologies

      The majority of pre-metabolomics and early metabolomics studies have utilized nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy- [1,2,42-48] and gas chromatography (GC)-based approaches [6-10,20-23,26,29,31]. However, investigators have also applied high performance liquid chromatography (HPLC) coupled with UV detection [49], pyrolysis-mass spectrometry (MS) [50,51], and inductively-coupled plasma (ICP) atomic emission and ICP-MS [52] among other techniques. Current metabolomics and metabolic profiling studies rely almost exclusively on 1 H NMR, GC-MS and LC-MS due to the technological maturity of the corresponding instrumentation, the recent independent advancements made in all three fields, and the realization by the instrumentation industry that these three approaches offer the most potential for successful results.

      Despite this solid foundation and the great strides made in technology and knowledge over the past decade, present capabilities still fall below desired levels in terms of analytical throughput, sensitivity, comprehensiveness, and data quality required to support many important applications. The complexity and heterogeneity of metabolites are considerably greater than those seen with genes or proteins, despite the fact that the average elemental composition (in terms of C, H, N, O, S, and P) of a metabolite is C4.938H6.793norte0.4279O1.774S0.04590PAG0.06987, which is not terribly different from that of a peptide, i.e., C4.938H7.758norte1.358O1.477S0.0417 [53]. Yet it is the manner in which these elements are arranged in a metabolite that governs its chemical properties and leads to the technical challenges in providing high throughput, sensitive, and comprehensive analyses of the metabolome. As a result, comprehensive, high quality metabolomics and lipidomics investigations require diverse, specialized equipment and highly trained personnel with interdisciplinary expertise in bioinformatics, biochemistry, physiology, and spectrometry.

      Omics Separations & Mass Spectrometry Group Metabolomics and Lipidomics Capabilities

      Sample preparation and instrumental methods

      Based on previous studies (e.g. Figure 1), we find that the Folch method is amenable for the extraction of the metabolome and lipidome in untargeted studies. Briefly, samples are treated with chloroform/methanol (2:1, v/v) in a 5-fold excess to the sample volume, followed by agitation to thoroughly mix the solution. Samples are then centrifuged to separate precipitated protein from water- and lipid-soluble metabolites. The aqueous and lipid fractions are removed and dried in vacuo.

      For polar metabolite analysis, residues from aqueous fractions are reconstituted in pyridine containing methoxyamine, prior to methoxyamination of reactive carbonyl groups. Hydroxyl and amine groups are subsequently derivatized using norte-metilo-norte-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide with 1% trimethylchlorosilane. Derivatized samples are then analyzed using GC-MS according to a method developed by the Oliver Fiehn laboratory. GC is unsurpassed in terms of separation peak capacity, which is a measure of the number of chromatographic peaks that can be baseline-resolved within the analysis time. Because the stationary phase is coated on the inside of the unpacked GC column, system back pressure is negligible, and separations are typically performed on 30 m capillary columns at carrier gas flow rates of

      1 L/min, leading to highly efficient separations with chromatographic peak widths of a few seconds. In addition, standardization of the electron ionization source to 70 eV by the GC-MS industry, coupled with its overall high reproducibility has enabled development and utilization of commercial and custom mass spectral databases for high-throughput and automated metabolite identifications. Because GC-MS analyses are performed in the gas phase and chemical derivatization is required to increase the volatility of sample constituents, it is not amenable to the analysis of relatively large biomolecules (e.g., >500 Da), as they either exceed the upper mass limit of the mass spectrometer (

      1000 m / z for some instruments) or cannot be made volatile within the temperature limits of the instrument. However, GC-MS has proven to be an exceptional tool for the untargeted, quantitative analysis of small, polar metabolites (e.g., amino and small organic acids, sugars, etc.) and fatty acids.

      For lipid analysis, dried lipid extracts are reconstituted in isopropanol and analyzed directly using capillary LC coupled with high resolution MS and employing a combined top down/bottom up lipidomics approach. With this approach, complex lipid molecular species are separated using reversed-phase chromatography and identified based on accurate mass and characteristic fragment ions in sequential full scan and tandem (MS/MS) mass spectra. In addition to adding confidence to the identification of detected lipids, the high mass resolution provided by TOF and Orbitrap MS instruments increases the coverage of the lipidome. Figure 2 illustrates this point, where both a major (in terms of abundance) and minor lipid species differing by 46 ppm are detected in the same spectra. Despite the high quality LC separations in routine operation at PNNL, the complex nature of biological samples prevents complete chromatographic separation of all sample constituents and only mass spectrometers with sufficient high resolution are capable of resolving molecules with such similar m / z. We have also recently developed a novel software, LIQUID (Lipid Informed Quantitation and Identification) for identification of lipids detected in LC-MS/MS-based lipidomics analyses. For more details on LIQUID, see the Algorithm Development page.


      Metabolomics: a systems biology approach for enhancing heat stress tolerance in plants

      Comprehensive metabolomic investigations provide a large set of stress-related metabolites and metabolic pathways, advancing crops under heat stress conditions. Metabolomics-assisted breeding, including mQTL and mGWAS boosted our understanding of improving numerous quantitative traits under heat stress.

      Abstracto

      During the past decade, metabolomics has emerged as a fascinating scientific field that includes documentation, evaluation of metabolites, and chemical methods for cell monitoring programs in numerous plant species. A comprehensive metabolome profiling allowed the investigator to handle the comprehensive data groups of metabolites and the equivalent metabolic pathways in an extraordinary manner. Metabolomics, together with transcriptomics, plays an influential role in discovering connections between stress and genes/metabolite, phenotyping, and biomarkers documentation. Further, it helps to decode several metabolic systems connected with heat stress (HS) tolerance in plants. Heat stress is a critical environmental factor that is globally affecting the growth and productivity of plants. Thus, there is an urgent need to exploit modern breeding and biotechnological tools like metabolomics to develop cultivars with improved HS tolerance. Several studies have reported that amino acids, carbohydrates, nitrogen metabolisms, etc. and metabolites involved in the biosynthesis and catalyzing actions play a game-changing role in HS response and help plants to cope with the HS. The use of metabolomics-assisted breeding (MAB) allows a well-organized transmission of higher yield and HS tolerance at the metabolome level with specific properties. Progressive metabolomics systematic techniques have accelerated metabolic profiling. Nonetheless, continuous developments in bioinformatics, statistical tools, and databases are allowing us to produce ever‐progressing, comprehensive insights into the biochemical configuration of plants and by what means this is inclined by genetic and environmental cues. Currently, assimilating metabolomics with post-genomic platforms has allowed a significant division of genetic-phenotypic connotation in several plant species. This review highlights the potential of a state-of-the-art plant metabolomics approach for the improvement of crops under HS. The development of plants with specific properties using integrated omics (metabolomics and transcriptomics) and MAB can provide new directions for future research to enhance HS tolerance in plants to achieve a goal of “zero hunger”.


      Microbiome and Microbial Sciences

      Research Area Leaders: Rob Knight and Victor Nizet

      The Microbiome & Microbial Science Research Area focuses on the numerous critical interactions of humans with the microbial world, in both health and disease. The diverse and cross-disciplinary faculty members of this research area apply fundamental principles of microbiology, immunology, molecular cell biology , pharmacology, -OMICs (genomics, proteomics, metabolomics) and systems biology to understand the composition and function of the human microbiome, and to elucidate the molecular and cellular pathogenesis of viral, bacterial fungal and parasitic infectious diseases.

      The microbes that normally inhibit our gut, skin and mouth provide the vast majority of our body’s gene content, and function to help us digest and process nutrients, while generating their own waste and metabolites. Importantly, these microbes constantly interact with, and help shape, our immune systems. It is now recognized that the makeup of our microbiome influences diverse diseases including food allergies, obesity, inflammatory bowel disease, colon cancer, rheumatoid arthritis, atherosclerosis, asthma and even the brain function and behavior. Microbial communities we encounter in the home, hospital and outdoor environments further influence our health status. Understanding our microbiome and its role in human health can inspire novel diagnostic, preventative and therapeutic interventions. Indeed, the rich chemical and metabolic diversity of the microbiome is itself a promising source for new drug discovery.

      Infectious diseases caused by bacteria, viruses, fungi and other parasites remain major causes of death, disability, and social and economic disruption. Infections are most prevalent in developing countries and among the poorest people, with limited or no access to integrated health care, prevention tools and medications. Ongoing threats include HIV/AIDS, malaria and neglected tropical diseases, and pandemic influenza and coronavirus disease . Increasing pathogen resistance to antibiotics (e.g. MRSA, multi-resistant tuberculosis, C. difficile) poses a critical threat to modern medicine as we know it. Research in the track seeks innovative infectious disease therapies to counteract this threat, through high-throughput screening, chemical genomics, and innovative strategies such as virulence factor inhibition, immune boosting, designer vaccines, probiotics and bacteriophage.  

      Faculty members in the Microbiome and Microbial Sciences research area are located not only in Departments throughout UC San Diego School of Medicine and Skaggs School of Pharmacy & Pharmaceutical Sciences, but also across the broader UC San Diego Campus including Biological Sciences, Chemistry & Biochemistry, Bioengineering, and the Scripps Institution of Oceanography.  The training area is part of a campus-wide initiative of the same name, and works in close collaboration with the UC San Diego Center for Microbiome Innovation, the joint UC San Diego/La Jolla Institute of Allergy & Immunology Program in Immunology, and the upcoming Collaborative to Halt Antibiotic-Resistant Microbes (CHARM).

      BMS provides a  unified core curriculum  for all first-year students. Based on their interests, students can choose from a range of elective courses to fill their 15-unit elective requirement. Courses related to this research area are listed below.  


      Ver el vídeo: Clase 22. Filogenómica I (Mayo 2022).


Comentarios:

  1. Spengler

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  2. Gregg

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  3. Kedal

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