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3: Preparación de frotis bacterianos e introducción a la tinción - Biología

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3: Preparación de frotis bacterianos e introducción a la tinción

Preparación de frotis bacterianos

I. INTRODUCCIÓN
Los frotis bacterianos se preparan con el fin de observar microorganismos bajo el microscopio. La visualización de microorganismos en estado vivo es muy difícil, no solo porque son diminutos, sino porque son transparentes y casi incoloros cuando se suspenden en un medio acuoso. Un frotis bacteriano es una preparación seca de células bacterianas en un portaobjetos de vidrio. Los frotis se pueden hacer a partir de un cultivo seco (de un inclinado, punzante o placa), o de un cultivo húmedo / líquido. Al preparar frotis bacterianos, se deben observar las siguientes cualidades: 1. Las bacterias deben esparcirse uniformemente sobre el portaobjetos y estar lo suficientemente concentradas para ubicarse, pero lo suficientemente dispersas para que se pueda ver su disposición natural. Idealmente, una sola capa de células se logrará con áreas densas en un portaobjetos que a menudo no es útil para el examen. 2. Las bacterias deben fijarse adecuadamente al portaobjetos para que no se eliminen durante los procedimientos normales de lavado en la tinción. 3. Las bacterias no deben deformarse para que se pueda observar su morfología original. La mayoría de las bacterias no tienen color, por lo que generan poco contraste en el campo microscópico. Por lo tanto, para ver bacterias con el microscopio, es necesario aplicar color utilizando un reactivo de tinción. Una vez teñidas, las bacterias pueden observarse y estudiarse con respecto a su morfología (forma, tamaño y disposición). Las manchas son soluciones que contienen un soluto llamado cromóforo disuelto en un solvente. Un cromóforo es la porción que posee color de la solución y, por lo tanto, es responsable del color de las manchas. Las células bacterianas suelen tener una carga superficial negativa, lo que significa que se necesita una tinción con carga positiva para teñir la superficie de la célula. La mayoría de las tinciones son básicas y tienen un cromóforo cargado positivamente. Cuando se aplica el tinte, hay una atracción entre la superficie de la célula cargada negativamente y el cromóforo cargado positivamente, lo que hace que la superficie de la célula adopte el color del tinte. Cuando se aplica una sola mancha, esto se denomina mancha simple. El tinte más común utilizado para frotis (y preparaciones húmedas) es el azul de metileno. También se pueden usar otros tintes como IKI, violeta cristal y safranina. Después de preparar el frotis, el tinte se aplica durante un período de tiempo específico. En la tinción simple, es importante que se permita que la tinción penetre en la pared celular. Por lo general, esto se logra en un minuto. II. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Preparación de frotis bacterianos
A. En 2 portaobjetos limpios, coloque dos asas de crecimiento bacteriano líquido de S. aureus o una aguja de crecimiento bacteriano sólido. B. Si se usa un crecimiento bacteriano sólido, agregue una gota de agua, luego mezcle completamente. C. Extienda la muestra para cubrir aproximadamente la mitad del área del portaobjetos utilizando un asa de inoculación esterilizada con calor. D. Pase el portaobjetos sobre la llama de la lámpara de alcohol y espere a que se seque. E. Prepare 2 frotis bacterianos más con B. subtilis. Los portaobjetos deben estar debidamente etiquetados con el organismo y el tipo de colorante que se utilizará. Tinción simple

A. Una vez que los portaobjetos se hayan enfriado, colóquelos en la rejilla de tinción sobre el fregadero. B. Inunde un frotis de S. aureus y un frotis de B. subtilis con azul de metileno durante 1 minuto. C. Lave suavemente el tinte azul de metileno usando una botella de lavado con agua destilada o del grifo corriente. D. Inunde los 2 frotis restantes con carbol fucsina durante 1 minuto. E. Lave suavemente el tinte de fucsina de carbol con una botella de lavado con agua destilada o del grifo abierto. F. Examine todos los frotis teñidos con objetivos de inmersión en aceite. III. RESULTADOS

B. subtilis teñido con azul de metileno Descripción: en forma de varilla, en sencillos o en cadenas | B. subtilis teñido con carbol fucsina Descripción: en forma de varilla, en sencillos o en cadenas | S. aureus teñido con azul de metileno Descripción: redondo, individual o en racimos | S. aureus teñido con carbol fucsinaDescripción: redondo, individualmente o en racimos |

IV. DISCUSIÓN Y CONCLUSIÓN
Una simple mancha se aplica a un frotis de un solo tinte que colorea la célula de manera uniforme. El propósito de una simple tinción es resaltar toda la población de microorganismos. Una mancha es un procedimiento, el tinte y el frotis utilizados son componentes de ese procedimiento. La mayoría de los tintes son sales en las que uno de los iones está coloreado, refleja la luz de una longitud de onda específica. Este ion se llama cromóforo y se unirá específicamente a una célula o una parte estructural de la célula. El azul de metileno, por ejemplo, es cloruro de azul de metileno (MBCl) que, cuando se ioniza, se convierte en: MB + (cromóforo) + Cl-. El cromóforo se adhiere a partículas cargadas negativamente, lo que permite teñir tales estructuras. Si el ion portador de color (cromóforo) está cargado positivamente, la mancha es básica (ha perdido una carga negativa). Si el cromóforo está cargado negativamente, es ácido (ha perdido una carga positiva). Cuando se usa azul de metileno para teñir bacterias, toda la célula bacteriana se colorea de azul; esta es la esencia de un procedimiento de tinción simple.

En nuestro laboratorio se utilizarán cinco tintes básicos:
COLORANTES BÁSICOS | ABSORBANCIA MAXIMA (NM) |
* Crystal Violet | 590 |
* Safranina | 530 |
* Carbol Fucsina | 544 |
* Azul de metileno | 665 |
* Verde malaquita | 621 |
COLORANTE ÁCIDO | |
* Eosina | 525 |
Mediante el uso de tinciones simples, pudimos apreciar la morfología de S. aureus y B. subtilis. Staphylococcus aureus son bacterias redondas o con forma de coco que se presentan solas, en parejas o en racimos irregulares. Bacillus subtilis, por otro lado, son bacterias en forma de bastón que se presentan solas o en cadenas. V. PREGUNTAS DE INVESTIGACIÓN

1. ¿Cuál es el propósito de la tinción?
* Hacer que las células o microbios sean visibles para la observación morfológica * Ser capaz de diferenciar y clasificar las bacterias en categorías * Mejorar el contraste y resaltar las estructuras bajo el estudio de interés 2. ¿Cómo pueden las tinciones impartir color a las bacterias? Explique el mecanismo involucrado.

Las manchas imparten color a las bacterias en función de su ionización. Los tintes básicos, que tienen grupos cargados positivamente, se unen a partículas cargadas negativamente, mientras que los tintes ácidos, que tienen grupos cargados negativamente, se unen a estructuras cargadas positivamente. 3. ¿Cuál es el principio de tinción simple?

La tinción simple utiliza una única tinción y se utiliza principalmente para la visualización de la morfología que incluye: forma (cocos, bacilos, espirilos), tamaño y disposición (sencillos, cadenas, grupos, pares, tétradas). VI. ARTÍCULO DE LA REVISTA


Preparación de frotis bacterianos y tinción simple

OBSERVACIÓN DE CÉLULAS BACTERIANAS VÍA MICROSCOPIO
En este experimento, hemos aprendido varias técnicas básicas de biología molecular. Aquí están Tinción simple: Solo se usa un tipo de tinte para la tinción simple y tiñe todas las células del mismo color. El objetivo es crear contraste entre la célula y el fondo para observar la morfología celular. Tinción diferencial: una tinción diferencial utiliza más de un tinte y tiñe diferentes tipos de organismos con diferentes colores. Tinción positiva: si la propia célula se tiñe, se denomina tinción positiva. Se pega al espécimen y le da su color. Tinción negativa: si se tiñe el fondo y se visualizan las células haciendo uso de la diferencia de contraste entre los fondos y las células, se denomina tinción negativa. Tinción simple

Salmonella anatum obtenida a partir de caldo líquido y placa de agar se tiñó con tintes de azul de metileno, safranina y violeta cristal, respectivamente. La muestra tomada de la placa de agar está mucho más concentrada que la muestra del caldo. Esperábamos observar la forma de varilla de estas bacterias y ver que en realidad tiene forma de varilla. Algunas partes de los frotis preparados fueron difíciles de observar debido a la alta concentración de frotis. Debe lavarse durante la preparación del frotis. Además, mientras se realiza la preparación de frotis, como un proceso de fijación de calor alto o bajo, o no lavar bien el exceso de tinte, puede causar esto. Además, es importante tener cuidado al tomar muestras de la placa de agar si se toman demasiadas bacterias, esto afectará la observación de las mismas. Parecerá que se unen entre sí. Y no podemos diferenciar la forma de las bacterias si se toma demasiada muestra. Montaje húmedo temporal

Es una técnica en la que la muestra se suspende en un líquido que se coloca sobre un vidrio y se cubre con un cubreobjetos. Las células vivas se pueden examinar al microscopio utilizando esta técnica. Saccharomyces cerevisiae, que se sabe que es inmóvil (y de 5 a 10 micrómetros de diámetro que hacen que sea fácil de observar), se observó al microscopio la levadura para observar su movimiento.


Frotis o células: preparación y fijación

Antes de teñir, fije el material a observar sobre el portaobjetos. Si la preparación no se fija o se pega sobre el portaobjetos, las células se lavan durante el procedimiento de tinción.

Preparación del frotis:

Coloque una pequeña gota de cultivo líquido con un asa de inoculación en un portaobjetos limpio. Si el cultivo se toma de un medio sólido. Coloque una pequeña gota de agua en el portaobjetos y mezcle bien con un poco de cultivo. Extienda la gota sobre el portaobjetos de manera uniforme para formar una película delgada de células. Esta delgada película de células se llama frotis y debe ser lo más uniforme posible.

Fijación de células (frotis) en los portaobjetos:

Después de la preparación de un frotis uniforme, debe fijarse o pegarse sobre el portaobjetos. La fijación es el proceso mediante el cual las estructuras internas y externas de las células y los microorganismos se conservan y fijan en su posición. Inactiva las enzimas que por la noche interrumpen la morfología celular y la dureza de las estructuras celulares para que no cambien durante la tinción y la observación.

Por lo general, se mata una célula y se le pide que se deslice durante la observación microscópica.

La fijación de la célula microbiana se realiza de dos formas:

Fijación por calor o fijación química. La fijación por calor se utiliza habitualmente para observar procariotas. Una película de celda se calienta suavemente mientras un portaobjetos atraviesa una llama. La fijación por calor conserva toda la morfología pero no las estructuras dentro de la célula. La fijación química se utiliza para proteger la subestructura celular fina y la morfología de microorganismos grandes y delicados.

Los fijadores químicos penetran en la célula y reaccionan con los componentes celulares, generalmente proteínas y lípidos, para volverlos inactivos. La mezcla de fijador común contiene etanol, ácido acético, cloruro de mercurio, formaldehído y glutaraldehído.


La preparación de frotis bacterianos implica la extensión del cultivo bacteriano en portaobjetos, secado al aire, fijación por calor antes de la tinción y observación microscópica. La fijación por calor en la preparación del frotis tiene un propósito, mata las células bacterianas en el frotis, adhiere firmemente el frotis al portaobjetos y permite que la muestra absorba las manchas más fácilmente.

  1. Corredera limpia y sin grasa o aceite
  2. Cultivo bacteriano
  3. Asa de inoculación.
  4. Mechero Bunsen.
  5. Agua destilada.

PARA CULTURAS DE AGAR

Coloque un bucle lleno de agua esterilizada en un portaobjetos de vidrio microscópico limpio, sin grasa y esterilizado.

Transfiere asépticamente una pequeña cantidad de crecimiento bacteriano (colonia) de la placa de cultivo Nutrient Agar Media (NAM) a la gota de agua esterilizada con la ayuda de un asa de inoculación esterilizada.

Emulsione las bacterias cultivadas en la gota de agua con el asa de inoculación y extienda la suspensión bacteriana en una superficie del tamaño de una moneda de plata (de EE. UU.) O una moneda de 10 paisa (de INDIA) con el asa de inoculación esterilizada.

Seque el frotis al aire a temperatura ambiente.


Procedimientos de tinción para detectar bacterias

Cuando se usa un único reactivo de tinción y todas las células y sus estructuras se tiñen de la misma manera, el procedimiento se denomina procedimiento de tinción simple.

Este procedimiento es de dos tipos: positivo y negativo (Fig. 17.5). En la tinción positiva, la tinción (p. Ej., Azul de metileno) es básica (catiónica) con carga positiva y se adhiere a la superficie del objeto que tiene carga negativa.

En la tinción negativa, la mancha (por ejemplo, tinta china, nigrosina) es ácida (aniónica) que tiene carga negativa y es repelida por el objeto que está cargado negativamente y, por lo tanto, llena los espacios entre los objetos, lo que resulta en una tinción indirecta del objeto.

2. Procedimiento de tinción diferencial:

Cuando se utilizan más de un reactivo de tinción y objetos específicos (por ejemplo, microorganismos específicos y / o estructura particular de un microorganismo) exhiben diferentes reacciones de tinción fácilmente distinguibles, el procedimiento se denomina tinción diferencial.

La tinción diferencial más utilizada en microbiología es la tinción de Gram y la tinción acidorresistente. La tinción acidorresistente es especialmente útil para identificar Mycobacterium tuberculosis, el agente causante de la tuberculosis.

A. Separación de microbios en grupos:

Un erudito danés Christian Gram en 1884 ideó un procedimiento de tinción diferencial que diferencia las bacterias en grampositivas y gramnegativas. Este procedimiento se llama técnica de tinción de Gram. Esta técnica ha experimentado numerosas modificaciones de vez en cuando y demuestra ser valiosa para teñir frotis de cultivos puros de bacterias.

El procedimiento de tinción (Fig. 17.6) es el siguiente:

I. Se fija una película delgada de cultivo joven (frotis) en un portaobjetos limpio.

II. El frotis se tiñe durante un minuto con violeta cristal de oxalato de amonio. Esta tinción a veces produce más de preparaciones teñidas en las que ciertos organismos gramnegativos (por ejemplo, Gonococcus) también retienen la tinción. Si se encuentra con este problema, se debe utilizar una cantidad menor de violeta cristal.

III. El portaobjetos se lava con agua del grifo durante no más de 2 segundos para eliminar el exceso de mancha.

IV. El portaobjetos se sumerge durante un minuto en solución de yodo Lugol & # 8217s. Las bacterias se tiñen profundamente y tienen un color púrpura intenso debido a la formación del complejo cristal violeta-yodo.

V. El portaobjetos se lava con agua del grifo y se seca.

VI. El portaobjetos se agita suavemente durante 30 segundos en alcohol etílico al 95% y las bacterias gramnegativas secadas por transferencia pierden su tinte en este paso (es decir, se decoloran). Sin embargo, los grampositivos conservan un color púrpura intenso.

VII. El portaobjetos ahora se contratiñe durante 10 segundos en la solución de safranina.

VIII. El portaobjetos se lava con agua corriente, se seca y se examina.

Bacterias grampositivas: violeta oscuro (azul) Bacterias gramnegativas: rosa (rojo).

Aunque se han dado diferentes explicaciones para responder por qué las bacterias responden de manera diferente a la tinción de Gram, parece probable que la respuesta esté relacionada con la naturaleza física de sus paredes celulares, ya que cuando se elimina la pared celular de las bacterias grampositivas, se convierten en gram- negativo. El peptidoglicano parece actuar como una barrera de permeabilidad que previene la pérdida del complejo cristal violeta-yodo.

Cuando las bacterias grampositivas se tratan con un agente decolorante (alcohol), se cree que el alcohol deshidrata la capa gruesa de peptidoglicano, lo que da como resultado la contracción de los poros de peptidoglicano. La contracción de los poros de peptidoglicano evita que el complejo cristal violeta-yodo se escape y las bacterias permanezcan de color púrpura oscuro.

Por el contrario, el peptidoglicano es muy delgado en las bacterias gramnegativas, no está tan fuertemente cruzado como en las grampositivas y tiene poros más grandes. El alcohol, por lo tanto, penetra fácilmente en la capa externa rica en lípidos de la pared celular y extrae suficientes lípidos aumentando así la porosidad.

Por estas razones, el alcohol elimina más fácilmente el complejo violeta-cristal de color violeta oscuro de las bacterias gramnegativas y estas últimas se decoloran.

1. Siempre se deben utilizar cultivos frescos y jóvenes (de menos de 24 horas) para evitar resultados engañosos porque los cultivos viejos de bacterias grampositivas tienden a decolorarse más rápidamente y mostrar gramnegativos.

2. Los frotis deben ser finos y uniformes para evitar bacterias superpobladas.

3. Durante la fijación por calor, debe evitarse un calentamiento excesivo.

4. Debe evitarse la decoloración excesiva.

(ii) Tinción ácido-resistente:

La tinción ácido-resistente es una tinción diferencial desarrollada primero por Paul Ehrlich en 1882 y posteriormente modificada por Ziehl-Neelsen, y está en uso incluso hoy en día por los microbiólogos. La mayoría de las bacterias se tiñen con tinción simple y tinción de Gram, pero algunas bacterias no lo hacen porque tienen componentes cerosos de la pared celular, por lo que su pared celular tiene una permeabilidad limitada.

Estas bacterias pertenecen a géneros como Mycobacterium y Nocardia y se tiñen mediante tinción ácido-resistente; esta última se utiliza para identificar Mycobacterium tuberculosis y M. leprae, los patógenos responsables de la tuberculosis y la laprosía, respectivamente.

La propiedad de resistencia a los ácidos de estas bacterias se correlaciona con un alto contenido de lípidos, lo que las hace difíciles de teñir. Por lo tanto, para teñir estas bacterias se requiere calentar con un colorante fuerte. Una vez que se tiñen las bacterias ácido-resistentes, es difícil decolorarlas incluso con ácido y alcohol. Además, la tinción ácido-resistente también sirve como una buena herramienta de identificación para una serie de bacterias saprofitas inofensivas.

Los reactivos se preparan como se indica a continuación:

Fenol (cristales fundidos por calor) & # 8211 5,0 ml

La fucsina básica se disuelve en etanol y el fenol se disuelve en agua.

Estos dos se mezclan y se guardan durante varios días antes de filtrar y usar:

Disolvente decolorante (ácido-alcohol):

Ácido clorhídrico (concentrado) & # 8211 3.0 ml

Cloruro de azul de metileno & # 8211 0,3 g

El procedimiento de tinción (Fig. 17.7) es el siguiente:

I. Una película delgada de cultivo joven (frotis) se fija con calor y se seca al aire en un portaobjetos limpio.

II. El frotis ahora está inundado con carbol fucsina.

III. El portaobjetos se cuece al vapor sobre agua hirviendo durante 3-5 minutos. Se agrega más tinte de vez en cuando para evitar que el frotis se seque.

IV. El portaobjetos se enfría y se lava con agua destilada hasta que no aparece color en el frotis.

V. El frotis se decolora con disolvente decolorante (ácido-alcohol) durante 15-20 segundos. Algunas células bacterianas aparecen de color rojo (rosa pálido), mientras que otras se decoloran. Los portaobjetos se lavan con agua destilada.

VI. Los frotis ahora se contratiñen con azul de metileno durante 1-2 minutos y se lavan con agua destilada.

VII. Los portaobjetos se secan con papel absorbente y se examinan directamente bajo inmersión en aceite.

Las bacterias acidorresistentes aparecen rojas.

Las bacterias no acidorresistentes aparecen de color azul.

La tinción acidorresistente ayuda a clasificar las bacterias en dos grupos: acidorresistentes y no acidorresistentes. Las bacterias acidorresistentes, particularmente las del género Mycobacterium, no se unen a las manchas simples, pero cuando se tiñen por calentamiento con una mezcla de carbol fucsina (fucsina básica + fenol) retienen carbol fucsina (la mancha primaria) después de lavarlas incluso con ácido fuerte.

Una vez que la fucsina básica penetra con la ayuda del calor y el fenol, las células de las bacterias acidorresistentes no se decoloran fácilmente con un lavado con ayuda de alcohol y, por lo tanto, permanecen rojas.

Esto se debe al contenido bastante alto de lípidos de las paredes celulares de las bacterias acidorresistentes, en particular, el ácido micólico (un grupo de hidroxi lípidos de cadena ramificada) parece ser el responsable de la resistencia a los ácidos. Las bacterias resistentes a los ácidos se decoloran después de lavarlas con alcohol ácido, retienen la contratinción de azul de metileno y, por lo tanto, aparecen de color azul.

1. Si es necesario, se debe agregar más tinte de fucsina de carbol para evitar su evaporación y sequedad.

2. Debe evitarse que la tinción de fucsina de carbol se caliente para evitar preparaciones & # 8220 sucias & # 8221.

3. Debe evitarse la decoloración excesiva del frotis.

B. Visualización de varias estructuras:

(i) Tinción de endosporas:

Las bacterias de los géneros Bacillus y Clostridium forman una estructura excepcionalmente resistente capaz de sobrevivir durante largos períodos en un entorno desfavorable. Esta estructura inactiva se llama endospora ya que se desarrolla dentro de la célula. La morfología y la ubicación de las endosporas varían según la especie y, a menudo, son valiosas para la identificación. La mayoría de los tintes no tiñen bien las endosporas con facilidad.

Se requiere una cantidad considerable de calentamiento para hacer que la mancha penetre en la capa de esporas, una pared gruesa responsable principalmente de la resistencia a las endosporas. Pero una vez teñidos, resisten fuertemente la decoloración. Esta propiedad es la base de las técnicas de tinción con endosporas.

Sin embargo, los microbiólogos utilizan dos procedimientos de tinción para teñir las endosporas. Estos métodos son el método de Schaeffer-Fulton y el método de Dorner. Por conveniencia, aquí se proporciona el método de Schaeffer-Fulton.

El procedimiento de tinción de la endospora (figura 17.8) por el método de Schaeffer-Fulton es el siguiente:

I. Se fija una película delgada de cultivo joven (frotis) de bacterias endosporosas en un portaobjetos limpio.

ii. El frotis se fija con calor sobre el portaobjetos mediante un calentamiento suave.

iii. El frotis se cubre con la solución de verde malaquita, que es una mancha muy fuerte que puede penetrar la capa de esporas de una endospora.

iv. El portaobjetos se mantiene en un soporte adecuado y se calienta con vapor desde abajo durante 5 minutos. Si la mancha se seca durante el calentamiento, se agrega más mancha al frotis de vez en cuando según los requisitos.

v. El portaobjetos se lava suavemente con agua del grifo.

vi. El portaobjetos se tiñe con safrain durante unos 30 segundos.

vii. Luego se lava con agua destilada y se seca con papel secante.

viii. El frotis se observa bajo inmersión en aceite.

La endospora aparece verde mientras que el resto de la célula aparece roja.

Las endosporas son extremadamente resistentes debido a su pared gruesa, la capa de esporas. La capa de esporas no quita la mancha fácilmente. Sin embargo, el verde de malaquita penetra en la capa de esporas de la endospora después de un calentamiento considerable. Una vez teñida, la endospora no se decolora fácilmente, por lo que parece verde incluso después del lavado. Por el contrario, la contratinción no entra en la endospora, pero tiñe el resto del contenido celular que parece rojo.

(ii) Tinción de flagelos:

Muchas bacterias son móviles debido a la presencia de flagelos que se originan en el citoplasma y se proyectan fuera de la pared celular. Los flagelos bacterianos son orgánulos finos, filiformes que son tan delgados (alrededor de 10 a 30 nm de diámetro) que solo pueden observarse directamente con un microscopio electrónico.

Para observar los flagelos con el microscopio óptico, se aumenta el grosor de los flagelos recubriéndolos con mordientes como ácido tánico y alumbre de potasio, y se tiñen con pararosanilina (método Leifson & # 8217s) o fucsina básica (método Gray & # 8217s).

Los procedimientos de tinción de flagelos proporcionan información taxonómicamente valiosa (por ejemplo, presencia, patrón de distribución, número) que se utilizan en la identificación y clasificación de bacterias.

Sin embargo, el método Gray & # 8217s de tinción de flagelos es el siguiente:

Los reactivos se preparan como se indica a continuación:

Ácido tánico (solución acuosa al 20%) & # 8211 2,0 ml

Alumbre de potasio (solución acuosa saturada) & # 8211 5,0 ml

Cloruro de mercurio (solución acuosa saturada) & # 8211 2,0 ml

Fucsina básica (3%) en alcohol al 95% & # 8211 0,4 ml

Las soluciones A y B se preparan mezclando sus ingredientes menos de 24 horas antes de su uso y se almacenan en botellas de colores. Ambas soluciones por separado pueden conservarse indefinidamente.

I. Las bacterias se cultivan en un caldo adecuado. Si es un medio sólido, se agrega una pequeña cantidad de peptona al 1% en la que nadan las bacterias.

II. El medio se elimina por centrifugación para obtener el sedimento.

III. El gránulo se suspende en formalina al 10% para producir una turbidez ligera y tenue y para prevenir los flagelos.

IV. El asa de suspensión se transfiere a un nuevo portaobjetos libre de grasa y se extiende para preparar una película delgada de cultivo joven (frotis).

V. El frotis se inunda con mordiente recién filtrado (solución A) y se deja actuar de 8 a 10 minutos.

VI. El frotis se lava con un chorro suave de agua destilada.

VII. El frotis se inunda con tinción de fucsina básica recién filtrada (solución B) y se deja reposar durante 5 minutos sin calentar.

VIII. El frotis se lava suavemente con agua destilada y se seca al aire.

IX. El portaobjetos se examina directamente bajo inmersión en aceite.

Se observan flagelos teñidos de rojo.

1. Deben utilizarse portaobjetos libres de grasa especialmente limpiados.

2. Los frotis no deben fijarse con calor.

3. Los frotis no se deben secar.

4. Siempre se debe utilizar iluminación reducida en el microscopio para observar los flagelos con claridad.

Las cápsulas bacterianas se confunden más fácilmente con artefactos que cualquier otra estructura perteneciente a los organismos. Dado que las cápsulas a veces se muestran simplemente como áreas no teñidas alrededor de las células bacterianas, existe la tentación de llamar cápsula a cualquier área circundante de este tipo, sin embargo, simplemente representan la tendencia de un medio circundante ligeramente teñido a retraerse de las células bacterianas al secarse.

Por esta razón, la mejor manera de demostrar las cápsulas es teñirlas mediante algún procedimiento que las diferencie de las propias células bacterianas. Aunque existen varios métodos de tinción para lograr esto, el procedimiento del método de Anthony es mucho más simple. E.E. Anthony ideó este método para la tinción de cápsulas en 1931.

Sin embargo, el método de Anthony & # 8217s para la tinción de cápsulas es el siguiente:

Los reactivos utilizados en el procedimiento son los siguientes:

Cristal violeta acuoso (85% de contenido de colorante) & # 8211 La mancha

Sulfato de cobre acuoso (20% CuSO4.5H2O) & # 8211 Agente decolorante y contramancha Agua destilada.

El procedimiento de tinción (Fig. 17.9) es el siguiente:

I. Se colocan dos asas de cultivo joven de bacterias (por ejemplo, cultivos de leche de 36-48 horas de Klebsiella pneumoniae) en un portaobjetos de vidrio limpio.

II. Se prepara un frotis espeso y se seca al aire.

III. El frotis se inunda con tinte violeta cristal durante 2 minutos.

IV. La mancha se lava con sulfato de cobre (20%).

V. La mancha se lava con sulfato de cobre (20%).

VI. Se drena el sulfato de cobre y el frotis se seca con suavidad.

VII. El portaobjetos se examina directamente bajo inmersión en aceite.

Las células bacterianas aparecen de color azul oscuro, rodeadas por una cápsula de color azul violeta que indica que las bacterias están encapsuladas.

Cristal violeta acuoso (85% de contenido de colorante) es la tinción principal y, en su aplicación, tanto el material capsular como la pared celular bacteriana toman el color de la tinción y aparecen de color azul oscuro. Pero la cápsula que no es iónica no absorbe la mancha primaria, mientras que la pared celular que es iónica la absorbe.

El sulfato de cobre acuoso (20%) actúa como agente decolorante y como contramancha. En la aplicación, el sulfato de cobre primero se decolora, la cápsula elimina el cristal violeta y luego le imparte el color azul violeta. Como resultado, la cápsula finalmente aparece azul violeta en contraste con el color azul oscuro de la célula bacteriana.

1. Se debe preparar un frotis abundante para contrarrestar la eliminación de células bacterianas durante el lavado.

2. El frotis no debe fijarse con calor porque el calentamiento da como resultado un encogimiento que puede crear una zona clara alrededor de la celda que es un artefacto y que puede confundirse con la cápsula.

3. Debe evitarse lavar el frotis con agua porque los materiales capsulares son solubles en agua y pueden desprenderse y eliminarse con agua.


Los 5 tipos principales de tinción (con diagrama) | Microbiología

Los siguientes puntos destacan los cinco tipos principales de tinción. Los tipos son: 1. Tinción simple 2. Tinción diferencial 3. Tinción de Gram 4. Tinción ácido-rápido 5. Tinción con endosporas.

Tinción Tipo # 1. Tinción simple:

La coloración de microorganismos mediante la aplicación de un solo colorante a un frotis fijo se denomina tinción simple. Se cubre el frotis fijo con tinte durante un período específico, después de lo cual esta solución se lava con agua y se seca el portaobjetos. Los tintes básicos como el violeta cristal, el azul de metileno y la carbolfucsina se utilizan con frecuencia en la tinción simple para determinar el tamaño, la forma y la disposición de las células procariotas. (Figura 5.1)

Tinción Escribe # 2. Tinción diferencial:

Estos procedimientos de tinción se utilizan para distinguir organismos según las propiedades de tinción. Son un poco más elaboradas que las técnicas de tinción simples en las que las células pueden estar expuestas a más de un tinte o tinción, por ejemplo, el uso de tinción de Gram que divide las bacterias en dos clases: Gram negativas y Gram positivas.

Tinción Escribe # 3. Tinción de Gram:

Es una de las técnicas de tinción diferencial más importantes y ampliamente utilizadas en microbiología. Esta técnica fue introducida en 1884 por el médico danés Christian Gram. El procedimiento de tinción de Gram se ilustra en la figura 5.2.

En el primer paso se tiñe el frotis con colorante básico violeta cristal (colorante primario) seguido de tratamiento con solución de yodo que funciona como mordiente.

El yodo aumenta la interacción entre la célula y el tinte de modo que la célula se tiñe fuertemente. A continuación, el frotis se decolora lavándolo con etanol o acetona. Este paso genera el aspecto diferencial de las tinciones de Gram. Las bacterias Gram positivas retienen el cristal violeta y se vuelven incoloras.

Finalmente, el frotis se tiñe con un simple tinte básico de color diferente al violeta cristal. La safranina es la contratinción más común que colorea las bacterias Gram negativas de rosa a rojo y deja a las bacterias Gram positivas de color púrpura oscuro. (Figura 5.2)

Las diferencias en las respuestas de tinción a la tinción de Gram pueden estar relacionadas con la diferencia química y física de las paredes celulares. La pared celular de las bacterias gramnegativas es una estructura delgada y compleja de varias capas y contiene contenidos de lípidos relativamente altos además de proteínas y mucopéptidos.

La mayor cantidad de lípidos se disuelve fácilmente con alcohol, lo que da como resultado información de poros grandes en la pared celular, lo que facilita la fuga del complejo de yodo violeta cristalino (CV-I) que da como resultado la decoloración de la célula bacteriana.

Que luego toma contra mancha y aparece de color rojo. En contraste, la pared celular de las bacterias gram + ve es gruesa y químicamente simple, compuesta principalmente de mucopéptidos. Cuando se trata con alcohol, provoca la deshidratación y el cierre de los poros de la pared celular, por lo que no permite la pérdida del complejo (CV-I) y la célula permanece de color púrpura.

Tinción Escribe # 4. Tinción ácido-rápido:

Es otro procedimiento de tinción diferencial importante. Se utiliza con mayor frecuencia para identificar Mycobacterium spp. Estas bacterias tienen una pared celular con un alto contenido de lípidos, como el ácido micólico, un grupo de hidroxi lípidos de cadena ramificada, que evitan que los colorantes se adhieran fácilmente a las células.

Pueden teñirse con el método de Ziehl-Nulsen, que utiliza calor y fenol para derivar fucsina básica en las células. Mycrobacterium spp. fueron penetrados con fucsina básica, no se decoloraron fácilmente con alcohol acidificado (alcohol ácido) y, por lo tanto, se dice que son resistentes a los ácidos.

Las bacterias no áridas se decoloran con el alcohol árido y, por tanto, se tiñen de azul con la contratinción de azul de metileno.

Tinción Escribe # 5. Tinción de endosporas:

La formación de esporas tiene lugar en algunos géneros bacterianos para resistir condiciones desfavorables. Todas las bacterias no pueden formar esporas, solo unos pocos géneros bacterianos, incluidos Bacillus, Clostridium, Desulfotomaculum, producen una estructura esporulante dentro de las células vegetativas llamadas endosporas.

La morfología y la ubicación de las endosporas varían según la especie y son valiosas para la identificación. La mayoría de los tintes no tiñen bien las endosporas, pero una vez teñidas, resisten fuertemente la decoloración.

En el procedimiento de Schaffer-Fulton, las endosporas se tiñen primero calentando las bacterias con verde de malaquita, que es una mancha muy fuerte que puede penetrar las endosporas. Después del tratamiento con verde de malaquita, el resto de la célula se lava para eliminar el tinte con agua y se contra tiñe con safranina. Esta técnica produce una endospora verde con células vegetativas rojas. (Figura 5.3)


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