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¿Qué significa proteger la ARN polimerasa?

¿Qué significa proteger la ARN polimerasa?



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De este papel

Sin embargo, sobre la base de la fuerte interacción entre NusA y RNAP, proponemos que la actividad acompañante de NusA podría proporcionar una protección más directa y concentrada para RNAP bajo estrés, es decir, NusA podría actuar simultáneamente como un latente protector de RNAP durante el alargamiento y terminación de la transcripción.


Por "protección" los autores quieren decir que en presencia de NusA, algunas proteínas son menos propensas a la agregación después del choque térmico. "Protección", en general, también podría referirse a estabilización, es decir, reducción en las tasas de degradación de la proteína.

Para detectar la influencia de NusA en la agregación inducida por calor, utilizamos lactato deshidrogenasa (LDH). La LDH se incubó a 48 ° C en ausencia o presencia de NusA. Como se muestra en la Fig. 2b, la LDH se agregó lentamente a 48 ° C sin la protección de NusA. Sin embargo, cuando este experimento se realizó en presencia de NusA, la agregación se redujo visiblemente. Estos resultados sugieren que NusA también protege proteínas desplegadas de agregación irreversible durante el estrés térmico.



En E. coli, RpoA y RpoB, los componentes principales de RNAP, son propensos a la agregación bajo estrés por calor in vivo. Se informó que interactuaban con GroEL y DnaK, principalmente para el protección contra la agregación o replegarse a un estado no nativo48,49. Sin embargo, en base a la fuerte interacción entre NusA y RNAP, proponemos que la actividad acompañante de NusA podría proporcionar una protección más directa y concentrada para RNAP bajo estrés, es decir, NusA podría actuar simultáneamente como un protector latente de RNAP durante el alargamiento y terminación de la transcripción.


Desentrañar los medios para alcanzar un fin: terminación de la transcripción de la ARN polimerasa II

La ARN polimerasa II (Pol II) transcribe todos los genes que codifican proteínas eucariotas y la mayoría de los genes de ARN no codificantes. El paso final de la transcripción es la terminación, que conduce a la liberación de Pol II y ARN de la plantilla de ADN a través de un mecanismo mal definido.

La terminación de la transcripción cumple muchas funciones vitales en la célula, como prevenir la interferencia de la ARN polimerasa con elementos de ADN vecinos, reciclar la ARN polimerasa, promover el procesamiento del extremo 3 'del ARN y regular la expresión génica mediante la terminación prematura de la transcripción (es decir, atenuación).

La terminación se puede provocar a través de diferentes vías dependiendo del estado de fosforilación del dominio carboxi-terminal de Pol II (CTD) y la presencia de diversas señales de ARN y factores de terminación. Dos de las vías de terminación mejor estudiadas son la vía dependiente de poli (A) y la vía dependiente de Sen1, que están conectadas a los eventos de procesamiento del extremo 3 'del ARN para los ARNm y los ARN no codificantes, respectivamente.

Se proponen tres mecanismos para causar la terminación de Pol II: cambios conformacionales inducidos por la unión de factores a la colisión de Pol II de una exoribonucleasa con Pol II y / o interrupción del híbrido del sitio activo de Pol II por una helicasa de ARN-ADN. Sin embargo, estos modelos moleculares hasta ahora han sido insuficientes para explicar completamente cómo ocurre la terminación.

Pol II es similar tanto estructural como bioquímicamente a la ARN polimerasa bacteriana, lo que sugiere que puede haber algunas características generales de terminación que son comunes a todas las ARN polimerasas celulares. Estudios recientes que investigan los requisitos para la terminación bacteriana implican a varias regiones de Pol II como dominios efectores de terminación putativos, incluidos la tapa, el bucle de activación, las hélices de sujeción, el muelle y el colgajo.

El estado de fosforilación de los residuos Pol II CTD Ser7, Ser5 y Ser2 es dinámico a lo largo de un gen. Los estudios de localización de todo el genoma sugieren que una combinación de Ser7-P alto y Ser5-P y Ser2-P bajo en el CTD de Pol II en posiciones proximales al promotor puede servir como una señal para desencadenar la terminación dependiente de Sen1.

La localización en todo el genoma de la proteína 1 de CFI (Pcf11), Nrd1 y la proteína de tráfico de ARN 1 (Rat1) revela una superposición extensa de estos factores de terminación a lo largo de genes de ARN codificantes y no codificantes de proteínas. Este patrón es coherente con la idea de que la maquinaria para la terminación dependiente de Sen1 y la terminación dependiente de poli (A) está ampliamente disponible para apuntar a Pol II durante la transcripción de la mayoría de los genes y, de hecho, puede proporcionar una forma de garantizar una terminación a prueba de fallos.


Evitar la contaminación por RNasa

El bacteriófago SP6 ARN polimerasa es una ARN polimerasa dependiente de ADN que es altamente específica para el promotor del fago SP6. La polimerasa de 98,5 KD cataliza in vitro Síntesis de ARN a partir de un molde de ADN clonado bajo el promotor SP6. El ARN sintetizado utilizando la SP6 ARN polimerasa es adecuado para muchas aplicaciones en investigación y biotecnología.

Condiciones de reacción:
Tampón de reacción 1X RNAPol, suplementado con 0,5 mM de cada plantilla de ATP, UTP, GTP, CTP y ADN que contiene el promotor de la ARN polimerasa SP6. Incubar a 37 ° C.

Fuente del producto

Reactivos suministrados

Los siguientes reactivos se suministran con este producto:

SP6 ARN polimerasa M0207SVIAL -20 1 x 0,1 ml 20.000 unidades / ml
Tampón de reacción RNAPol B9012SVIAL -20 1 x 1 ml 10 X

Características de la aplicación

  • Preparación de la sonda de ARN radiomarcada
  • Marcado de ARN no isotópico
  • Preparación para vacunas de ARN
  • Guía de ARN para la selección de genes
  • ARNm para in vitro traslación y microinyección
  • Estudios de estructura, procesamiento y catálisis del ARN
  • Amplificación de ARN
  • RNA antisentido para el experimento de expresión génica

Definición de unidad

Condiciones de reacción

Tampón de reacción 1X RNAPol
Suplemento con ATP 0,5 mM, GTP 0,5 mM, UTP 0,5 mM y CTP 0,5 mM
Incubar a 37 ° C

Tampón de reacción 1X RNAPol
Tris-HCl 40 mM
MgCl 6 mM2
TDT de 1 mM
Espermidina 2 mM
(pH 7,9 a 25 ° C)

Búfer de almacenamiento

Tris-HCl 50 mM
NaCl 100 mM
Β-ME 20 mM
EDTA 1 mM
50% de glicerol
0,1% (p / v) de Triton® X-100
pH 7,9 a 25 y ° C

Condiciones de ensayo de la unidad

Productos complementarios

  • Escalera de dsRNA
  • Mezcla de solución de ribonucleótidos
  • Escalera de ssRNA
  • T7 ARN polimerasa
  • Pirofosfatasa, inorgánica (E. coli)
  • Colorante de carga de ARN, (2X)
  • E. coli Poli (A) polimerasa
  • Inhibidor de ARNasa, murino
  • Pirofosfatasa inorgánica termoestable
  • ARNm Cap 2 O Metiltransferasa
  • Sistema de taponado de vaccinia
  1. Para sondas de ARN de alta actividad específica marcadas radiactivamente, la concentración del nucleótido radiactivo debe limitarse a 6 µM.
  2. Para proteger el ARN contra la ribonucleasa, el inhibidor de la ARNasa (NEB # M0314 o # M0307) debe agregarse a una concentración final de 1 U / & mul.
  3. La ARN polimerasa SP6 es extremadamente sensible a la inhibición de la sal. La concentración total de sal no debe exceder los 50 mM.
  4. La ARN polimerasa SP6 es ligeramente más activa a 40 ° C que a 37 ° C. Se puede considerar la incubación a 40 ° C para el transcrito de ARN que contiene estructuras secundarias fuertes.
  1. Schenborn, E.T. y Meirendorf, R.C. (1985). Nucl. Res ácidos. 13, 6223-6236.
  2. Zinn, K. y col. (1983). Celda. 34, 865-879.
  3. Mayordomo, E.T. y Chamberlin, J. (1982). J. Biol. Chem. 257, 5772-5778.
  4. Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. (1989). Clonación molecular: un manual de laboratorio . (2ª ed.), 10.27-10.37.
  5. Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. (1989). Clonación molecular: un manual de laboratorio. (2ª ed.), 18.82-18.84.
  6. Melton, D.A., Krieg, P.A., Rebagliati, M.R., Maniatis, T., Zinn, K. y Green, M.R. (1984). Nucl. Res ácidos. 12, 7057-7070.
  7. Kreig, P.A. y Melton, D.A. (1984). Nucl. Res ácidos. 12, 7057-7070.
  8. Green, M.R., Maniatis, R. y Melton, D.A. (1983). Celda. 32, 681-694.
  9. Melton, D.A. (1985). Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos. 82, 144-128.
  10. Milligan, J.F., Groebe, R.D., Witherell, G.W. y Uhlenbeck, O.C. (1987). Nucl. Res ácidos. 15, 8783.

Complementar las reacciones con DTT fresco si el tampón tiene & gt 6 meses.

Aumente los rendimientos aumentando las concentraciones de rNTP a 4 mM cada una y MgCl2 a 20 mM.

Herramienta de citas de productos

Especificaciones

  • M0207S_L_v1_0151802
  • M0207S_v1_10018458
  • M0207L_v1_10020002
  • M0207S_v1_10034633
  • M0207S_v1_10039728
  • M0207L_v1_10039730
  • M0207S_v1_10052055
  • M0207S_v1_10058293
  • M0207S_v1_10062864
  • M0207S_v1_10077617
  • M0207S_v1_10086517
  • M0207S_v1_10094846
  • M0207S_v1_10110024

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New England Biolabs (NEB) está comprometido con la práctica de la ciencia ética y creemos que es nuestro trabajo como investigadores hacer las preguntas importantes que, cuando se respondan, ayudarán a preservar nuestra calidad de vida y el mundo en el que vivimos. Sin embargo, esta investigación siempre debe realizarse de manera segura y ética. Aprende más.


Día (s) realizado

1. Koenig M, Dieude M, Senecal, J-L: Valor predictivo de los anticuerpos antinucleares: las lecciones de los autoanticuerpos de la esclerosis sistémica. Autoinmun Rev 20087 (8): 588-593

2. Wollheim FA: Clasificación de la esclerosis sistémica. Visiones y realidad. Reumatología (Oxford) 44 de octubre de 2005 (10): 1212-1216

3. Cavazzana I, Ceribelli A, Paolo A, et al: Anticuerpos anti-ARN polimerasa III: un marcador de esclerosis sistémica con inicio rápido y progresión del engrosamiento de la piel. Autoinmun Rev 20098 (7): 580-584

4. Kuwana M, Kimura K, Kawakami Y: Identificación de un epítopo inmunodominante en la ARN polimerasa III reconocido por sueros de esclerosis sistémica: aplicación al ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas. Artritis Rheum 2002 Octubre 46 (10): 2742-2747


Enzima pol de ARN procariota

En los procariotas, la misma enzima cataliza la síntesis de todos los tipos de ARN: ARNm, ARNr y ARNt. La ARN polimerasa procariota es una molécula pequeña.

La estructura de la ARN polimerasa consta de cinco subunidades de aproximadamente (410 kilo-daltons) α2ββ & # 8217ω con dos unidades α idénticas, que se une al ADN no específicamente a catalizar la síntesis de ARN.

La polimerasa de E. coli tiene un tetramérico Contiene enzimas centrales Subunidades de tipo α y β con la estequiometría α2ββ & # 8217. Esto es suficiente para el alargamiento transcripcional.

Pero la iniciación requiere una subunidad adicional denominada σfactor tiene dos funciones: reconoce al promotor y convierte el complejo promotor cerrado.

Una vez iniciada la transcripción, la σfactor se disocia de la holoenzima. La enzima central puede unirse al ADN en ausencia de σ, pero con baja eficiencia y sin especificidad.

Para unir regiones promotoras específicas, la holoenzima requiere un factor σ con el que reduce en gran medida las regiones de ADN inespecíficas de afinidad, aumentando las regiones promotoras de especificidad para formar las subunidades cinco de la holoenzima. α2ββ & # 8217σω (

La estructura de la ARN polimerasa tiene un surco de 55 Å de largo y 25 Å de ancho.

Esta ranura permite el paso de la doble hélice del ADN que es de 20 Å. La longitud puede aceptar secuencias de 55 a 18 nucleótidos.

Todas las unidades que forman la enzima trabajan juntas para llevar a cabo reacciones de transcripción.

La subunidad β participa en la unión del ADN, la subunidad β contiene parte del centro activo y la subunidad σ participa principalmente en el inicio de la transcripción y se disocia del resto de la enzima después del inicio de la transcripción.

Las ARN polimerasas de organismos procarióticos funcionan de manera similar, aunque algunas subunidades de proteínas difieren en su composición.

¿Qué pasa con el factor σ?

Un factor sigma (factor σ) es una proteína necesaria solo para el inicio de la síntesis de ARN.

Es un factor de iniciación de la transcripción bacteriana que permite la unión específica de ARN pol a promotores de genes.

El factor sigma específico utilizado para iniciar la transcripción de un gen determinado variará, dependiendo del gen y de las señales ambientales necesarias para iniciar la transcripción de ese gen.

Cada molécula de ARN pol holoenzima contiene exactamente una subunidad de factor sigma, que es la bacteria modelo Escherichia coli es una de las que se enumeran a continuación.

El número de factores sigma varía entre las especies bacterianas. E. coli tiene siete factores sigma.

Los factores sigma se distinguen por sus pesos moleculares característicos. Por ejemplo, σ70 se refiere al factor sigma con un peso molecular de 70 kDa.

Factores Sigma especializados:

  • σ70 (RpoD) (o) σA: El & # 8220limpieza interna& # 8221 factor sigma o también llamado factor sigma primario, transcribe la mayoría de los genes en células en crecimiento. Cada célula tiene un factor sigma de "limpieza" que mantiene en funcionamiento los genes y las vías esenciales. En el caso de E. coli y otras bacterias gramnegativas en forma de bastoncillos, el factor sigma & # 8220housekeeping & # 8221 es σ70. Todos los genes reconocidos por σ70 contienen secuencias consenso de promotores similares que constan de dos partes. En relación con la base de ADN correspondiente al inicio de la transcripción de ARN, las secuencias promotoras de consenso se centran de forma característica en 10 y 35 nucleótidos antes del comienzo de la transcripción (–10 y –35).
  • σ19 ​​(FecI): el factor sigma del citrato férrico, regula el gen FEC para el transporte de hierro
  • σ24 (RpoE): el factor sigma de estrés por calor extracitoplásmico / extremo
  • σ28 (RpoF): el factor sigma flagelar
  • σ32 (RpoH): el factor sigma de choque térmico, se enciende cuando las bacterias se exponen al calor. Debido a la mayor expresión, el factor se unirá con una alta probabilidad de la polimerasa-núcleo-enzima. Al hacerlo, se expresan otras proteínas de choque térmico que permiten a la célula sobrevivir a temperaturas más altas. Algunas de las enzimas que se expresan tras la activación de σ32 son chaperonas, proteasas y enzimas reparadoras del ADN.
  • σ38 (RpoS): el factor sigma de la fase de inanición / estacionaria
  • σ54 (RpoN): el factor sigma de limitación de nitrógeno

ADN polimerasas: transcriptasa integradasa inversa y replicación de retrovirus

Abstracto

La transcriptasa inversa (RT), también conocida como ADN polimerasa dependiente de ARN, es una enzima ADN polimerasa que transcribe ARN monocatenario en ADN. Esta enzima es capaz de sintetizar un ADN de doble hélice una vez que el ARN se ha transcrito de forma inversa en un primer paso en un ADN de una sola hebra. Los virus de ARN, como los retrovirus, utilizan la enzima para transcribir de forma inversa sus genomas de ARN en ADN, que luego se integra en el genoma del huésped y se replica junto con él. Durante la replicación de algunos virus de ADN, como los hepadnavirus o pararetrovirus, que también llevan un RT, el genoma del ADN se transcribe a ARN que sirve como plantilla para producir nuevas hebras de ADN viral.

Aunque la RT se descubrió en retrovirus y se pensó que era un paradigma de estos agentes infecciosos, actualmente se sabe que la RT se encuentra en muchos otros sistemas eucariotas y procariotas como telomerasa, retrotransposones, retrones, y se encuentran abundantemente en los genomas de plantas y animales. . La RT retroviral tiene un dominio que lleva una actividad de ribonucleasa H (RNasa H) que es crucial para su replicación. La ARNasa H es una endonucleasa capaz de degradar el resto de ARN de la familia de híbridos ADN-ARN. Otra enzima codificada por virus, la integrasa, se encuentra en la forma dimérica madura de RT o como una enzima libre. La integrasa es vital para la inserción del ADN bicatenario sintetizado por RT en el genoma de la célula infectada por el huésped. Los inhibidores de la actividad de la ADN polimerasa de la RT retroviral se utilizan ampliamente en el tratamiento de patologías producidas por retrovirus como en el caso del síndrome de inmunodeficiencia adquirida.


Medicamentos contra la malaria

También se ha prestado atención a la cloroquina, un conocido fármaco antipalúdico. Un estudio lo probó junto con un antibiótico de amplio espectro, azitromicina. Si bien algunos pacientes de COVID-19 en este pequeño estudio se recuperaron, otros pacientes murieron (a pesar del tratamiento con cloroquina) y algunos pacientes interrumpieron el tratamiento por una variedad de razones, incluida la gravedad de sus síntomas.

Sin embargo, la gente está interesada en cómo la cloroquina y la azitromicina podrían funcionar para el coronavirus. La cloroquina exhibe actividad antiviral y actualmente se usa para tratar enfermedades autoinmunes porque también tiene propiedades antiinflamatorias. La azitromicina es un antibiótico que se usa para tratar infecciones bacterianas, pero también exhibe actividad antiviral, incluso contra el rinovirus que causa el resfriado común. Es posible que deba administrarse cloroquina poco después de la infección para que sea más eficaz contra el coronavirus.

La Organización Mundial de la Salud ha anunciado un programa mundial de ensayos clínicos que prueban posibles tratamientos de COVID-19, incluidos remdesivir, lopinavir / ritonavir, cloroquina y ciertas citocinas antivirales.

El creciente número de pacientes con coronavirus en todo el mundo significa que, junto con el desarrollo de vacunas, el enfoque debe permanecer de lleno en encontrar medicamentos antivirales efectivos que puedan tratar a los que ya están gravemente enfermos por la infección por SARS-CoV-2.


Los tipos de ARN participan en la síntesis de proteínas.

Hay tres tipos principales de ARN que participan en la síntesis de proteínas, estos son:

1. ARN mensajero (ARNm)

  • La transcripción del ADN en ARN comienza cuando la enzima ARN polimerasa se une a una secuencia de nucleótidos en el ADN, llamada promotor. A continuación, se separan las dos hebras de ADN y una hebra sirve como molde para la formación de una hebra complementaria de ARN. La ARN polimerasa se mueve a lo largo del ADN y une los nucleótidos complementarios a la cadena de ARN en crecimiento uno por uno.
  • La enzima solo funciona en la dirección 3`a 5` en su plantilla de ADN, ensamblando ARN en la dirección 5`a 3`. Este proceso es muy parecido a la replicación del ADN con una diferencia importante: la replicación del ADN, una vez iniciada, generalmente copia todo el ADN en la célula, mientras que la síntesis de ARN transcribe solo porciones seleccionadas del ADN.
  • Dado que las moléculas de ADN son de doble hebra, cualquier sección de ADN podría, en principio, transcribirse en las diferentes moléculas de ARN, una complementaria a cada hebra. En la práctica, solo una de las hebras se transcribe en cualquier segmento de ADN. La orientación del promotor indica qué hebra se va a transcribir.
  • Al comienzo de cada ARNm hay un sitio de unión al ribosoma: una secuencia de nucleótidos que se une a un ribosoma de tal manera que el primer codón (AUG) está posicionado correctamente para la traducción, y el último codón (el codón de terminación) puede ser uno. de tres codones: UAA, UAG y UGA. En el otro extremo de una molécula de ARNm, hay una cola de poliadenina (ploy-A) compuesta de hasta 200 residuos de adenina. Parece que esta cola protege al ARNm de la degradación por las enzimas que se encuentran en el citoplasma. 2. ARN ribosómico (ARNr)
  • Los ribosomas, los orgánulos de la síntesis de proteínas, constan de varios tipos de ARNr y alrededor de 70 tipos de polipéptidos.
  • En eucariotas, la producción de ribosomas tiene lugar en un área del núcleo llamada nucleolo, donde se producen varios cientos de miles de ribosomas por hora. Una producción tan rápida es posible sólo porque el ADN de una célula eucariota contiene hasta 600 copias de los genes de ARN ribosómico a partir de los cuales se transcribe el ARNr.
  • Hay cuatro tipos diferentes de ARNr que participan con la proteína en la estructura del ribosoma.
  • Un ribosoma funcional consta de dos subunidades, una grande y otra pequeña. Cuando no participan en la síntesis de proteínas, las subunidades se separan y se mueven de forma independiente. Cada uno puede unirse a una subunidad diferente del tipo opuesto la próxima vez que participe en la síntesis de proteínas.
  • En eucariotas, los polipéptidos de los ribosomas se producen en el citoplasma y luego pasan a través de la envoltura nuclear y entran en el nucleolo, donde el ARNr y los polipéptidos se ensamblan en subunidades ribosómicas. Durante la síntesis de proteínas, se produce una interacción entre el ARNm y el ARNr.

3. Transferir ARN (ARNt)

  • El tercer tipo de ARN que participa en la síntesis de proteínas es el ARN de transferencia (ARNt), que transporta aminoácidos a los ribosomas. Para cada tipo de aminoácido, existe un tipo específico de molécula de ARNt que lo reconocerá y lo transportará. (Los aminoácidos, para los que existen varios codones diferentes, tienen más de un tipo distinto de ARNt).
  • El ARN de transferencia se transcribe a partir de genes de ARNt, a menudo organizados en grupos de siete u ocho genes de ARNt en la misma parte de la molécula de ADN. Todas las moléculas de ARNt tienen la misma forma general. Partes de la molécula se pliegan en bucles característicos, que se mantienen en forma mediante el emparejamiento de bases entre diferentes áreas de la molécula.
  • Hay dos sitios en una molécula de ARNt que son importantes en la síntesis de proteínas. El primer sitio es donde el aminoácido se une a la molécula. Este sitio consta de las tres bases (CCA) en el extremo 3` de la molécula. El otro sitio es el sitio anticodón, que se empareja con el codón de ARNm apropiado en el complejo de ribosoma de ARNm. Esto une temporalmente el tRNA al mRNA, permitiendo que el aminoácido transportado por el tRNA sea incorporado al polipéptido en su lugar apropiado.
  • La síntesis de proteínas comienza cuando el ARNm se une a una pequeña subunidad ribosómica y el primer codón (AUG) se coloca correctamente para la iniciación. El codón AUG luego se empareja con el anticodón del ARNt que lleva metionina. Esta metionina finalmente se convierte en el primer aminoácido de la cadena polipeptídica.
  • Luego, una gran subunidad ribosómica se une al complejo y puede comenzar la reacción de síntesis de proteínas.
  • Un ribosoma tiene dos sitios donde el tRNA puede unirse. Como resultado de los eventos descritos anteriormente, el codón de iniciación (AUG) en la molécula de ARNm se coloca en el primero de estos sitios en el ribosoma: el sitio Peptidyl (P).
  • El codón de ARNm para el segundo aminoácido está alineado con el segundo sitio: el sitio aminoacilo. A partir de este punto, la cadena polipeptídica se alarga a través de un ciclo de tres pasos.
  • El primer paso es la unión del siguiente ARNt a un anticodón, complementario al siguiente codón de ARNm. El aminoácido transportado por este ARNt será el siguiente aminoácido en la cadena polipeptídica.
  • El segundo paso es la reacción de la peptidil transferasa, que da como resultado la formación de enlaces peptídicos. La enzima peptidil transferasa, que cataliza la reacción, es una parte integral de la gran unidad ribosómica. Esta enzima une el primer aminoácido al segundo mediante un enlace peptídico, de modo que el primer ARNt ahora está vacío y el segundo contiene ambos aminoácidos.
  • El tercer paso del ciclo mueve el ribosoma a lo largo del ARNm. Esto lleva el siguiente codón al sitio P del ribosoma y el ciclo comienza de nuevo cuando el anticodón del ARNt apropiado se une al codón, colocando el tercer aminoácido en posición en el sitio A. La cadena polipeptídica en crecimiento se une al aminoácido recién llegado en este tercer ARNt y la secuencia se repite.
  • La síntesis de proteínas se detiene cuando el ribosoma alcanza un codón de parada en el ARNm. Una proteína especial, llamada factor de liberación, se une al codón de terminación y hace que el ARNm salga del ribosoma. Las subunidades ribosómicas se separan, cuando el extremo 5 'del ARNm emerge del ribosoma, y ​​puede unirse a otra subunidad ribosómica pequeña que inicia nuevamente la síntesis de proteínas.
  • Cada molécula de ARNm tiene típicamente más de 100 ribosomas adheridos y transcribiendo su mensaje a medida que avanzan. Un ARNm con muchos ribosomas unidos forma un grupo llamado polirribosoma o polisoma.

Descubierto el objetivo y el mecanismo del fármaco antibacteriano fidaxomicina (Dificid)

Un equipo de científicos internacionales y de la Universidad de Rutgers ha determinado la diana molecular y el mecanismo del fármaco antibacteriano fidaxomicina (nombre comercial Dificid).

La fidaxomicina fue aprobada en 2011 para el tratamiento del patógeno bacteriano de "amenaza urgente" de los CDC Clostridium difficile (C. diff) y actualmente es uno de los dos medicamentos de primera línea para el tratamiento de C. diff.

La fidaxomicina también exhibe una potente actividad antibacteriana contra otros patógenos bacterianos de "amenaza grave" de los CDC, incluidos los resistentes a la meticilina Staphylococcus aureus (MRSA), resistente a la vancomicina Staphylococcus aureus (VRSA) y la bacteria de la tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis. Sin embargo, la baja solubilidad y la baja biodisponibilidad sistémica de la fidaxomicina han impedido el uso de fidaxomicina para el tratamiento de MRSA, VRSA y tuberculosis.

Diseñar derivados de fidaxomicina de próxima generación con actividad clínica mejorada contra C. diff y actividad clínica útil contra MRSA, VRSA y tuberculosis, es esencial saber cómo el fármaco se une e inhibe su objetivo molecular, la ARN polimerasa bacteriana, la enzima responsable de la síntesis de ARN bacteriano.

En un artículo publicado en Célula molecular Hoy, los investigadores informan de los resultados de análisis de microscopía crioelectrónica (crio-EM) y espectroscopía de una sola molécula que muestran cómo la fidaxomicina se une e inhibe la ARN polimerasa bacteriana.

Los investigadores informan de una estructura crio-EM de fidaxomicina unida a la ARN polimerasa de Mycobacterium tuberculosis a una resolución de 3,5 y Aring. La estructura muestra que la fidaxomicina se une en la base de la "pinza" de la ARN polimerasa, una parte de la ARN polimerasa que debe abrirse para permitir que la ARN polimerasa se una al ADN y debe cerrarse para permitir que la ARN polimerasa se adhiera al ADN. La estructura muestra además que la fidaxomicina atrapa la "pinza" de la ARN polimerasa en la conformación abierta.

Los investigadores también informan los resultados de experimentos de espectroscopia de fluorescencia de molécula única que confirman que la fidaxomicina atrapa la "pinza" de ARN polimerasa en la conformación abierta y que definen los efectos de la fidaxomicina en la dinámica de apertura y cierre de la pinza.

Los investigadores muestran que la fidaxomicina inhibe la ARN polimerasa bacteriana a través de un sitio y un mecanismo de unión que difieren de los de las rifamicinas, otra clase de fármacos antibacterianos que se dirigen a la ARN polimerasa bacteriana. El hallazgo de que la fidaxomicina inhibe las funciones de la ARN polimerasa bacteriana a través de un mecanismo y un sitio de unión no superpuestos diferentes explica por qué la fidaxomicina es capaz de matar patógenos bacterianos resistentes a las rifamicinas y por qué la fidaxomicina puede funcionar de forma aditiva cuando se combina con rifamicinas.

Los nuevos resultados permiten el diseño racional basado en la estructura de nuevos derivados de fidaxomicina mejorados con mayor potencia antibacteriana, mayor solubilidad y mayor biodisponibilidad sistémica. Basándose en la estructura de la fidaxomicina unida a su objetivo, los investigadores identificaron átomos de fidaxomicina que no son importantes para unirse al objetivo y, por lo tanto, pueden modificarse sin comprometer la capacidad de unirse al objetivo. Luego, los investigadores desarrollaron procedimientos químicos que permiten la unión selectiva de nuevos grupos químicos en esos átomos, incluidos nuevos grupos químicos que pueden mejorar la potencia, la solubilidad o la biodisponibilidad sistémica.

"Los resultados preparan el escenario para el desarrollo de derivados de fidaxomicina mejorados, en particular derivados de fidaxomicina mejorados que tienen la solubilidad y biodisponibilidad sistémica necesarias para el tratamiento de infecciones sistémicas, como MRSA y tuberculosis", dijo Ebright, profesor de química y biología química de la Junta de Gobernadores y Director de laboratorio del Instituto Waksman de Microbiología en Rutgers, quien dirigió la investigación.

Además de Richard H. Ebright, el equipo de investigación incluyó a Wei Lin, David Degen, Abhishek Mazumder, Dongye Wang, Yon W. Ebright, Richard Y. Ebright, Elena Sineva, Matthew Gigliotti, Aashish Srivastava, Sukhendu Mandal, Yi Jiang, Ruiheng Yin y Dennis Thomas de la Universidad de Rutgers Kalyan Das de KU Leuven Zhening Zhang y Edward Eng del National Resource for Automated Molecular Microscopy y el Simons Electron Microscopy Center Stefano Donadio de NAICONS Srl. Haibo Zhang y Changsheng Zhang de la Academia China de Ciencias de Guangzhou.

El estudio fue apoyado por la subvención R37-GM041376 del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud y subvenciones R01-AI104660 y U19-AI109713-01 del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas de los Institutos Nacionales de Salud. Los datos de Cryo-EM para el estudio se recopilaron en las instalaciones de crio-EM de la Universidad de Rutgers y en el National Resource for Automated Molecular Microscopy, que cuenta con el apoyo del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud y de la Fundación Simons. Los datos de difracción de rayos X para el estudio se recopilaron en la línea de luz 19-ID de Argonne Photon Source, que cuenta con el apoyo del Departamento de Energía y el Centro Nacional de Recursos de Investigación y el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los NIH.


Biología

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