Información

¿Cómo el daño del ADN causa el envejecimiento en la levadura?

¿Cómo el daño del ADN causa el envejecimiento en la levadura?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Según tengo entendido, en el envejecimiento de la levadura hay células hijas y células madre. La célula hija tiene ADN recién "fresco" y la célula madre muere después de algunos recuentos de replicación.

¿Qué sucede con el daño del ADN acumulado en la célula madre de la levadura?

Una de las teorías del envejecimiento humano es la acumulación de daños en el ADN nuclear. La célula de levadura hija es un clon de la madre y tiene el mismo ADN. ¿Qué pasa con este daño?

Edite para simplificar: ¿Por qué el daño del ADN no se transfiere en absoluto a la célula hija? El mecanismo de reparación en humanos evidentemente no es perfecto, porque el daño del ADN es una de las principales teorías del envejecimiento. Entonces, si morimos a causa de esto, ¿cómo se las arregla la levadura para evitar los efectos perjudiciales del daño del ADN que causan el envejecimiento en los seres humanos?


En las células eucariotas no hay diferencia entre una célula madre y una hija; la última es una copia exacta de la célula madre. Esto es válido también para las levaduras, por ejemplo, para las células humanas. Lo único que sucede con el tiempo es que los telómeros al final de los cromosomas se acortan (a menos que la célula tenga una telomerasa activa que la mayoría de las células no tiene) y alcanza el límite de Hayflick donde cada división adicional conducirá a una escasez de codificar regiones cromosómicas y por tanto causar problemas. Si las células no adquieren ningún otro daño cromosómico y tienen suficientes recursos, este sería el límite de su vida.

Por supuesto, hay daños en el ADN que ocurren con el tiempo. La mayoría de ellos son reparados por el sistema altamente eficiente de reparación de daños en el ADN de las células eucariotas, que consta de diferentes puntos de control durante el ciclo celular. Estos puntos de control se encuentran en la transición entre las diferentes fases del ciclo celular. Si se identifica un daño en el ADN, el ciclo celular se detiene para permitir la reparación del daño del ADN mediante proteínas especiales y para evitar que las células dañadas sufran mitosis (aquí el punto de control G2-M es importante). Esto funciona esquemáticamente como en esta figura (del artículo de Wikipedia sobre reparación del ADN):

Si el daño del ADN no se puede resolver, las células entrarán en senescencia (básicamente entrarán en un estado latente permanente) o sufrirán apoptosis. Si hay daños que (por cualquier motivo) no se detectan o se producen durante la reparación de las roturas de la doble hebra del ADN mediante la unión de extremos no homólogos, estos se replican y heredan por generaciones posteriores. A menos que estos errores ocurran durante el proceso de replicación, las células madre e hija son genéticamente idénticas.

Entonces, las células eucariotas adquieren daño en el ADN con el tiempo (una de las razones por las que los embarazos tardíos representan un mayor riesgo que los primeros), pero somos diferentes de la levadura en un punto: la levadura tiene una telomerasa activa, que no está activa en la mayoría de nuestras células ( principalmente excepto en células madre). Si las células acumulan demasiados daños cromosómicos, morirán.

Las referencias que se enumeran a continuación profundizan en el tema y son interesantes de leer.

Referencias:

  1. Regulación negativa de la actividad de la telomerasa de levadura a través de una interacción con una región aguas arriba del cebador de ADN
  2. Control del ciclo celular en el riñón.
  3. La evolución de diversas respuestas biológicas al daño del ADN: conocimientos de la levadura y p53
  4. Daño y decisiones del ADN: CtIP coordina la reparación del ADN y los puntos de control del ciclo celular
  5. Respuestas celulares al daño del ADN: una señal, múltiples opciones

Antecedentes de las diferentes teorías del envejecimiento.

Este video, de un profesor titular de la Universidad de Liverpool que se especializa en envejecimiento, analiza las teorías del envejecimiento. Toca la teoría del daño del ADN.

Teoría del envejecimiento del daño del ADN.

Tenga en cuenta que cuando hablamos de la teoría del daño del ADN, estamos hablando específicamente del daño al proceso de renovación celular por los mecanismos de reparación del daño del ADN en las células madre.

El envejecimiento por mutaciones no es lo mismo que el daño del ADN que causa el envejecimiento y realmente no puede causar envejecimiento en la levadura. La idea de que las células adquieren daño con el tiempo debido al ADN mutado es fundamentalmente diferente a la teoría del envejecimiento del daño del ADN. Los mecanismos que conducen al daño del ADN están muy bien cubiertos en la respuesta de @Chris.

El efecto sistémico sugerido que tiene el daño del ADN en el cuerpo humano provoca una incapacidad para renovar las células debido a la falta de células madre viables. Esto contribuye al proceso de envejecimiento en el organismo.

En la levadura, este proceso de agotamiento de las células madre no ocurre (en su mayoría son unicelulares). En los comentarios, parece que en realidad está hablando de envejecimiento basado en mutaciones en su pregunta original. Las mutaciones se transmiten a las células hijas. Pero estas células hijas no parecen envejecer o morir más rápido (si la célula parental tiene 5 días, la célula hija no parece tener 5 días). Esta es la razón fundamental por la que esta forma de envejecimiento sigue siendo menos estudiada: realmente no tiene sentido que las mutaciones generales causen envejecimiento.

Resumen

Para responder directamente a la pregunta: "¿Cómo el daño del ADN causa envejecimiento en la levadura?"

La pregunta no captura la imagen completa y confunde la teoría del envejecimiento animal del daño del ADN con el daño general del ADN a nivel celular.

Existen muchas teorías sobre el envejecimiento. Nadie sabe cuáles influyen más o menos en el envejecimiento. La levadura es un buen modelo para algunos tipos de modelos de teoría de la edad, pero quizás no en el caso del envejecimiento basado en daños en el ADN. Aunque experimentan daño en el ADN en forma de mutación, esto no causa envejecimiento de la misma manera que el daño en el ADN podría causar envejecimiento en humanos porque son organismos unicelulares y no experimentan las mismas relaciones entre tejidos que las más complejas. los organismos tienen.


Ediciones

Esta respuesta se ha cambiado ampliamente desde su primer borrador en función de preguntas y consultas adicionales del OP en los comentarios. Decidí mantener algunos puntos importantes que se plantearon y desestimaron.

¿Por qué no hay transferencia de daño del ADN a la célula hija?

Puede ocurrir daño al ADN y es transferido a la celda hija. Sin embargo, el daño es muy raro.

Entonces, ¿cómo sobrevive la levadura? Las células madre humanas envejecen y mueren o contraen cáncer. Pero la levadura no. Los humanos parten de una célula. Y muere. La levadura comienza a partir de una célula y vive para siempre (dividiéndose una y otra vez)

Editar después de los comentarios:

Unicelular

En la levadura no existen sistemas entre tejidos. El daño mutado simplemente se transmite si la célula es viable. Además, la suposición de que viven para siempre no es del todo precisa. Pero el ADN se transmite en su forma mutada o dañada.

Multicelda

El envejecimiento basado en el daño del ADN es un gran problema para los animales. (Dolle et al 2013) Mostró que el daño del ADN a una única vía de reparación provoca un envejecimiento acelerado (pero tenga en cuenta que no hubo un aumento en la mutación durante este envejecimiento).

pero hablando de cáncer, no es tan buen ejemplo, mi error. Pero en los seres humanos, el envejecimiento NO es como el cáncer; ocurre en TODO el cuerpo y en todas las células. Entonces, en todas las células hay algún daño en el ADN.

Otra edición: Tenías razón al hablar del cáncer en este contexto. La teoría del envejecimiento del daño al ADN es que los pequeños cambios (daño) en nuestro ADN se acumulan con el tiempo y dañan los tipos de células al dañar varias vías de reparación del ADN.

El daño se acumula y con el tiempo son viables menos células madre para la renovación y la reparación celular de otras células dañadas se ralentiza.

Además, este mismo principio fundamental de daño por mutación que ocurre con el tiempo puede conducir a mutaciones que desconectan los mecanismos de control celular y conducen al cáncer. Aunque estas mutaciones no aumentan con la edad (Hill et al., 2005).

Por ejemplo, la rata topo desnuda vive 10 veces más que la de especies comparables (menos envejecimiento) y no se ha observado que adquiera cáncer de forma natural (menos cáncer). La teoría implica que las dos cosas están bastante relacionadas debido a la forma en que cambia el ADN, pero no que específicamente la mutación sea una causa o resultado del envejecimiento.

Hablo más sobre el envejecimiento. Porque hay un envejecimiento en la levadura. Y una de las teorías del envejecimiento de los humanos: la acumulación de daños en el ADN. Y qué Chris escribir es que es realmente raro.

** Las células madre están dañadas. ** Ya no estoy completamente seguro de lo que quiere decir con envejecimiento en levadura. Las levaduras no dependen de un número limitado de células madre para la renovación celular, no envejecen de la manera que usted podría pensar. Simplemente proliferan el tipo celular mutado. No hay impacto en un organismo más grande como en el envejecimiento humano.

Daño en el ADN. La levadura es un organismo muy útil para comprender la bioquímica y la genética subyacentes del envejecimiento, no los sistemas de envejecimiento en general. Estos son dos campos de estudio diferentes. No está claro de qué está hablando en este momento.

También hay envejecimiento en lugares donde no hay células madre, como el cerebro, no hay renovación de células, solo las células existentes envejecen, se dañan, mueren y no se reemplazan.

Dolle 2006 descubrió que el daño espontáneo del ADN en relación con la edad se producía en el hígado pero no en el cerebro.


Estrés oxidativo y envejecimiento: aprendiendo de las lecciones sobre levadura

La levadura Saccharomyces cerevisiae ha jugado un papel vital en la comprensión de las bases moleculares del envejecimiento y la relación del proceso de envejecimiento con el estrés oxidativo (acumulación no homeostática de especies reactivas de oxígeno, ROS). Las respuestas antioxidantes de mamíferos y levaduras son similares y más del 25% de los genes relacionados con enfermedades degenerativas humanas tienen homólogos cercanos en la levadura. La redundancia genética reducida de la levadura facilita la visualización del efecto de un gen eliminado o mutado. Al manipular las condiciones de crecimiento, las células de levadura pueden sobrevivir solo fermentando (niveles bajos de ROS) o respirando (niveles aumentados de ROS), lo que facilita el esclarecimiento de los mecanismos involucrados en la adquisición de tolerancia al estrés oxidativo. Además, las bases de datos de levaduras son las más completas de todos los modelos eucariotas. En este trabajo destacamos el valor de S. cerevisiae como modelo para investigar la respuesta al estrés oxidativo y su impacto potencial sobre el envejecimiento y las enfermedades relacionadas con la edad.


Introducción

La estabilidad de los extremos cromosómicos en las células de levadura se mantiene mediante un complejo ADN-proteína específico de los telómeros (Lydall, 2003). Un componente clave de esta capa de telómero es una proteína de unión al ADN de una sola hebra, Cdc13p (Nugent et al., 1996). en un cdc13-1 mutante incubado a la temperatura no permisiva, los telómeros descubiertos se reconocen como roturas de doble hebra, lo que lleva a la acumulación de ADN monocatenario en los extremos de los cromosomas (Garvik et al., 1995 Maringele y Lydall, 2002), lo que induce un punto de control de daño al ADN señal (Garvik et al., 1995) y promover una detención del ciclo celular terminal en G2 / M (Weinert y Hartwell, 1993). Cuando estas células vuelven a la temperatura permisiva después de una detención prolongada, solo una pequeña proporción se recupera. Esta muerte celular se ha atribuido a la pérdida de genes esenciales ubicados en las regiones subteloméricas (Garvik et al., 1995 Booth et al., 2001), conversión de ADN monocatenario en los telómeros en lesiones letales no reparadas (Jia et al., 2004). ) y / o la formación de fusiones cromosómicas de extremo a extremo (DuBois et al., 2002).

Recientemente, Qi et al. (2003) han demostrado que morir cdc13-1 las células muestran marcadores fenotípicos de apoptosis como la exposición de fosfatidilserina en la valva externa de la membrana plasmática, la acumulación de especies reactivas de oxígeno (ROS) e inducción de la actividad de caspasa basada en la retención del inhibidor de caspasa FITC-VAD-FMK. La unión de la secuencia de valil-alanil-aspartil (VAD) a una caspasa de mamífero activada permite que la fracción de fluorometilcetona (FMK) reaccione con la cisteína del sitio activo, lo que da como resultado la inactivación y marcaje fluorescente de la proteína (Grabarek y Darzynkiewicz, 2002). La levadura expresa una única proteasa similar a caspasa, Yca1p. Al igual que las caspasas de mamíferos, Yca1p sufre una escisión, lo que activa su actividad proteolítica hacia varios sustratos de caspasas sintéticas in vitro (Madeo et al., 2002a). La actividad de Yca1p puede inhibirse mediante Z-VAD-FMK (Madeo et al., 2002a). El FITC-VAD-FMK no escindido se puede lavar fácilmente de las células viables, pero las células muertas retienen el FITC y se pueden detectar por fluorescencia verde en la citometría de flujo. Por tanto, el marcaje in vivo de levadura con FITC-VAD-FMK se ha atribuido a la activación auténtica de la caspasa (Madeo et al., 2002a Qi et al., 2003 Herker et al., 2004 Wadskog et al., 2004). Supresión de MEC1, un homólogo de la quinasa ATM / ATR de levadura, evitó este cdc13-1 apoptosis, lo que sugiere que los telómeros desprotegidos generan una MEC1-Señal de muerte apoptótica dependiente (Qi et al., 2003).

En este informe, mostramos que la muerte celular inducida por la inactivación de Cdc13p no depende de la proteasa similar a caspasa Yca1 o del aumento de la producción de ROS. Además, demostramos que las mediciones de citometría de flujo de la actividad de caspasa y producción de ROS, utilizando inhibidores de caspasa conjugados con fluorocromo y dihidrorrodamina 123 (DHR123), respectivamente, se confunden al unirse a células de levadura ya muertas. Este trabajo sugiere que el análisis de citometría de flujo de las células de levadura que mueren está sujeto a artefactos importantes e indica la necesidad de reinterpretar los resultados anteriores sobre los mecanismos de muerte de las células de levadura.


MATERIALES Y MÉTODOS

Cepas y medios de levadura

Una cepa de levadura de tipo salvaje (4741) y un mutante de replicación de ADN isogénico (4741dna2-1) (Kuo y Campbell, 1983) se utilizaron para todos los experimentos. Se usó medio líquido YPD (glucosa al 2%, extracto de levadura al 1%, peptona al 2%) para cultivar células de levadura a 24 ° C, la temperatura de crecimiento permisiva para la adn2-1 cepa.

Aislamiento de células jóvenes y viejas por elutriación

Para el aislamiento de células jóvenes y viejas, el WT4741 cepa y la cepa isogénica que contiene el adn2-1 mutación, 4741dna2-1, se diluyeron apropiadamente y se cultivaron a 24 & # x000b0C en dos litros de YPD que contenían 35 & # x003bcg / ml de cloranfenicol. Células de tipo salvaje, WT4741, se cultivaron por primera vez durante & # x0223c10 generaciones (A600 = 10). Luego se aislaron por elutriación células de 3 & # x000d7 10 8 10 generaciones de edad y luego se inocularon en dos litros de medio YPD fresco y se cultivaron de nuevo durante & # x0223c8 generaciones (A600 = 1,5). Tanto las células jóvenes (1 a 3 generaciones) como las viejas (16-18 generaciones) se aislaron mediante una segunda elutriación, produciendo 2 & # x000d7 10 9 células jóvenes y 4,8 & # x000d7 10 8 células viejas. Las células se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ° C. Tenga en cuenta que las extracciones de ARN no se realizaron en las células de tipo salvaje de 1 a 3 generaciones y de 10 generaciones recolectadas en A600 = 10. El último cultivo de células de tipo salvaje se hizo crecer a una densidad tan alta para evitar hacer tres elutriaciones para cada cultivo, minimizando así el tiempo de preparación. Las células jóvenes de tipo salvaje y las células de tipo salvaje de 18 generaciones utilizadas para la extracción de ARN se recolectaron muy por debajo del límite de diauxie basado en la densidad del cultivo en el momento de la recolección (& # x0003c3.2) (DeRisi et al., 1997 ).

Para el aislamiento de jóvenes y mayores adn2-1 células mutantes, 5 & # x000d7 10 8 4741dna2-1 Se inocularon células que crecían exponencialmente en dos litros de YPD que contenían 35 & # x003bcg / ml de cloranfenicol y se cultivaron durante & # x0223c8 generaciones a 24 & # x000b0C (A600 = 1,5-2). Joven y viejo 4741dna2-1 las células se separaron por elutriación. Recolectamos 1,2 & # x000d7 10 9 células de 1 a 3 generaciones de edad, y el rendimiento de células de 8 generaciones fue de 3,6 & # x000d7 10 8. Una vez más, se tuvo cuidado de cosechar mucho antes del cambio diauxico. Las muestras de células jóvenes y viejas elutriadas se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ° C.

Se puede encontrar una descripción completa de la técnica de elutriación en (Diamond, 1991). Brevemente, los sedimentos de células recolectadas de los cultivos de crecimiento exponencial se lavaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS 136,89 mM NaCl, 2,68 mM KCl, 5,37 mM Na2HPO4, 1,76 mM KH2correos4, pH 7,4) y las células se resuspendieron en 20 ml de PBS y albúmina de suero bovino (2 mg / ml). Los grupos de células se separaron mediante irradiación sónica (30 s) y la suspensión de células se filtró con una malla (3-64 / 32 NITEX Tetko, Briarcliff Manor, N.Y.). A continuación, se cargó la cámara de elutriación con 20 ml de suspensión celular correspondiente a & # x0223c3 & # x000d7 10 11 células (2 litros de cultivo, A600 = 10, primera elutriación) para WT4741 y & # x0223c7 & # x000d7 10 10 celdas para 4741 adn2-1 (2 litros de cultivo, A600 = 2). El joven salvaje y adn2-1 las células se aislaron fijando el caudal del agua inyectada en la centrífuga a 45 ml / min y la velocidad del rotor de la centrífuga a 1400 rpm. El viejo tipo salvaje y adn2-1 las células se elutrieron fijando el caudal a 85 ml / min y la velocidad del rotor, respectivamente, a 900 rpm y 1550 rpm (centrífuga J-6M con rotor JE-10 & # x000d7 Beckman Coulter, Fullerton, CA). La preparación de las células antes de cargarlas en el elutriador tomó & # x0223c1 h. Una vez cargadas, las células jóvenes se aislaron en 30 min a 24 ° C y luego se colocaron a 4 ° C. Se necesitaron & # x0223c3 h para aislar las fracciones de células viejas. En cuanto a las células jóvenes, realizamos la elutriación de las células viejas a 24 & # x000b0C, y luego las células se colocaron a 4 & # x000b0C. El análisis de citometría de flujo reveló que la distribución del ciclo celular era la misma para las células elutriadas y no elutriadas.

Tinción de calcofluor

Teñimos las células jóvenes y viejas elutriadas con abrillantador fluorescente (Calcofluor White M2R Tinopal UNPA-GX # F3543) para contar las cicatrices de las yemas y establecer la edad de las células aisladas por elutriación. Aproximadamente 106 células se lavaron una vez en 150 & # x003bcl de sorbitol 1 M y se resuspendieron en 150 & # x003bcl de abrillantador fluorescente (10 mg / ml) durante 5 min a 4 & # x000b0C. Después de lavarse cuatro veces con sorbitol 1 M reciente, las células se resuspendieron en 20 & # x003bcl de sorbitol 1 M y luego se observaron bajo un axioscopio de fluorescencia (Carl Zeiss, Jena, Alemania).

Inmunofluorescencia indirecta

Los nucleolos fueron monitoreados por inmunofluorescencia indirecta usando anticuerpos monoclonales dirigidos contra la abundante proteína nucleolar Nop1 (Aris y Blobel, 1988 Mays Hoopes et al., 2002). Después de 1 h de incubación con tampón de fosfato de potasio (KPO4), cloruro de magnesio (MgCl2), y formaldehído al 37%, las células se colocaron en tampón de sorbitol 2 M y se trataron con Zymolyase (0,3 mg / ml Zymolyase 20T, 0,1% & # x003b2-mercaptoetanol) a 30 & # x000b0C durante 45 min para la WT4741 colar y 15 min para el 4741dna2-1 cepa. A continuación, las células se fijaron en portaobjetos recubiertos de teflón de ocho pocillos pretratados con polilisina al 0,1% (6040805 ICN Biomedicals, Costa Mesa, CA). Después de 15 min en solución de bloqueo (PBS, albúmina de suero bovino al 0,5%, albúmina de pollo al 0,5%, Tween 20 al 0,5%), las células se incubaron con los anticuerpos primarios diluidos a 1: 2000 en la solución de bloqueo durante 2 ha temperatura ambiente. A continuación, las células se lavaron cuatro veces en tampón de bloqueo y se incubaron durante 2 h con el anticuerpo secundario, anti-ratón de conejo diluido a 1: 5000 en solución de bloqueo. Después de la incubación, las células se lavaron cuatro veces en solución de bloqueo e inmediatamente se combinaron con 4 & # x02032,6 & # x02032-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Se usó DAPI a 50 ng / ml como se describió anteriormente (Mays Hoopes et al., 2002). A continuación, se observaron las células bajo un axioscopio de fluorescencia (Carl Zeiss) acoplado con una cámara Orca 2 (Hamamatsu, Bridgewater, NJ).

Citometría de flujo

Para el análisis de citometría de flujo, las muestras se fijaron en etanol al 70%. Después de una digestión durante la noche con RNasa I (8 mg / ml en PBS) a 37 ° C y una digestión de 4 h con proteinasa K (1 mg / ml) a 50 ° C, las células se resuspendieron en yoduro de propidio en PBS (50 ° C). # x003bcg / ml), sonicado (ciclo de trabajo de salida 3-20%, 15 s) y filtrado con malla (3-64 / 32 NITEX Tetko). La cepa de control (WT4741) se cultivó asincrónicamente a 24 ° C (con un 52% de células de la cepa de control con contenido de 1C y un 48% con contenido de 2C) y hasta la saturación para identificar el pico de 1C (100% con contenido de 1C).

Experimentos y análisis de microarrays de ADN

Se aislaron células viejas y jóvenes de tipo salvaje como se describe en & # x0201c Aislamiento de células jóvenes y viejas por elutriación. & # X0201d Las células elutriadas de seis de estos experimentos (un total de 12 litros), produciendo 4,8 & # x000d7 10 8 células cada una. , fueron agrupados. Se usaron muestras de estas células para múltiples extracciones de ARN (ver más abajo). Viejo y joven adn2-1 las células se aislaron como se describe en & # x0201c Aislamiento de células jóvenes y viejas por elutriación. & # x0201d Las células elutriadas de ocho de tales experimentos (un total de 16 litros), produciendo 3,6 & # x000d7 108 células cada una, se combinaron. Se usaron muestras de estas células para múltiples extracciones de ARN (ver más abajo).

Las extracciones de ARN se realizaron con cloroformo caliente / fenol seguido de una columna Rneasy (74104 QIAGEN, Valencia, CA). El ADNc se sintetizó usando un cebador oligo (dT) (18418-012 Invitrogen, Carlsbad, CA) y transcriptasa inversa Powerscript (8460-1 BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA) usando 60 & # x003bcg de ARN total para cada reacción. El ADNc se marcó durante la transcripción inversa con dCTP marcado con Cy5 (rojo, PA55021 Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) o dCTP marcado con Cy3 (verde, PA53021 Amersham, Biosciences), de acuerdo con las instrucciones del proveedor (BD Biosciences Clontech ). Se utilizaron preparaciones de ARN independientes para cada preparación de ADNc.

Los niveles de ARN en células jóvenes y viejas se determinaron por duplicado para cada cepa mediante un método radiométrico utilizando análisis de hibridación de microarrays. Realizamos dos experimentos de control (uno para el tipo salvaje y otro para adn2-1), que consistió en una determinación de los niveles de ARN en células jóvenes de la misma cepa, alternativamente marcadas con Cy3 y Cy5. También realizamos cuatro experimentos de hibridación que consistieron en una comparación entre los niveles de ARN en células jóvenes y células viejas de la misma cepa. Para cada cepa, tipo salvaje y adn2-1, se realizaron dos experimentos de hibridación. En el primer experimento, se utilizó Cy3 para preparar el ADNc de células jóvenes y Cy5 para células viejas. En el segundo experimento, los tintes se cambiaron para eliminar cualquier sesgo que pudiera haber sido introducido por diferencias específicas de genes en la incorporación de los dos tintes. Por ejemplo, se usaron cantidades iguales de los colorantes marcados con Cy3 y Cy5, unidos a sus respectivos ADNc, para cada matriz (al menos 20 pmol). Además, como se acaba de mencionar, se utilizaron aislamientos de ARN independientes para cada preparación de ADNc para controlar las posibles diferencias debidas a los procedimientos de extracción. Las hibridaciones se realizaron en microarrays de ADN de Corning Microarrays Technology (Fountain Valley, CA). El CMT Yeast-S228c Gene Array versión 1.31 contiene & # x0003e6160 productos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (& # x0223c1 kb) que representan marcos de lectura abiertos (ORF) de la secuencia completa S. cerevisiae genoma, más 108 genes de control de Bacillus subtilis. Para la hibridación, los microarrays se incubaron en 50 & # x003bcl de solución de hibridación (esperma de salmón sonicado al 1%, formamida al 24,75%, SSC 4,95 & # x000d7, SDS al 0,099% y ditiotreitol 0,99 mM) durante 10-18 ha 42 & # x000b0C . Después del lavado (1 min en 2 & # x000d7 SSC, 0.1% SDS a 42 & # x000b0C 5 min en una nueva solución de 2 & # x000d7 SSC, 0.1% SDS a 42 & # x000b0C 10 min en 0.1 & # x000d7 SSC, 0.1% SDS 15 s, 2 min, 2 min y 1 min en 0.1 & # x000d7 SSC 15 s en 0.01 & # x000d7 SSC), se adquirieron imágenes separadas para cada tinte y se obtuvieron relaciones de intensidad de fluorescencia para todos los genes (Genepix-Pro3.0 Escáner Axon 4000A).

Realizamos el análisis utilizando MArray, un software que permite al usuario analizar conjuntos de datos de microarrays individuales o emparejados (Wang et al., 2002). MArray define la calidad de los experimentos de microarrays y evalúa la reproducibilidad de los experimentos replicados. El análisis consta de tres pasos: filtrado, normalización e interpretación. Durante el filtrado, se eliminaron todos los puntos vacíos o marcados negativamente (el coeficiente de la bandera viene dado por el archivo Genepix) (ver datos complementarios http://woldlab.caltech.edu/

lesur / old_and_joung_cells / MArray_output.pdf). Eliminamos los genes que no mostraban un perfil de expresión consistente en los duplicados (por ejemplo, genes que se expresaban más en las células jóvenes de tipo salvaje en el primer experimento pero que luego se expresaban más en las células viejas de tipo salvaje en el experimento repetido). Después de todo el filtrado, 5733 genes de tipo salvaje y 6141 adn2-1 quedaron genes. La intensidad de señal mínima de cada punto se estableció en cero. Usamos dos experimentos de control para cuantificar el ruido debido a la técnica por sí misma, especialmente el sesgo del tinte, y para establecer los umbrales para identificar los genes expresados ​​de manera significativamente diferencial en células viejas o jóvenes en cada cepa. Esto establece los límites de intensidad para interpretar las matrices experimentales. Luego, normalizamos la intensidad de las células jóvenes / viejas mediante el uso de la normalización dependiente de la intensidad de las proporciones, como lo describe Yang. et al. (2002). Los datos se presentan como el fondo sustraído, las proporciones normalizadas jóvenes / mayores para cada matriz. Para cada cepa, las relaciones de expresión informadas son el promedio de las dos relaciones de expresión células jóvenes / células viejas después de la normalización de las dos hibridaciones en las que se invirtieron los colorantes fluorescentes Cy3 y Cy5 (véanse las tablas en los datos complementarios). Para demostrar la reproducibilidad de las hibridaciones, calculamos los coeficientes de correlación para cada conjunto de experimentos invertidos.

El experimento completo también se realizó nuevamente comparando células jóvenes aisladas sin elutriación con células viejas aisladas por elutriación. Los genes activados cayeron en las mismas vías identificadas en los datos reportados. Los resultados no se incluyen porque las células jóvenes no se aislaron por elutriación como estaban en el conjunto de datos presentado aquí, lo que hace imposible el promedio de los datos. Sin embargo, cabe señalar que los resultados se superponen significativamente y dan lugar a interpretaciones idénticas.

La base de datos de proteomas de levadura (http://www.incyte.com/proteome/mainmenu.jps), la base de datos del genoma de Saccharomyces (http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces) y las anotaciones de MIPS Comprehensive Yeast La base de datos del genoma (http://mips.gsf.de/proj/yeast/CYGD/db/index.html) se utilizó para la interpretación de los perfiles de expresión. Además, fue valiosa la comparación de nuestros resultados con las bases de datos generadas recientemente que describen las respuestas transcripcionales en la levadura a diversos estreses ambientales, condiciones que prolongan la vida útil y a varias mutaciones que conducen al daño o reparación de los cromosomas (Jelinsky y Samson, 1999 Gasch et al., 2000, 2001 Jelinsky et al., 2000 Rep et al., 2000 Kaeberlein et al., 2002 Lin et al., 2001 Lin et al., 2002 ).

RT-PCR cuantitativa de transcripción inversa en tiempo real

La confirmación de las transcripciones expresadas diferencialmente se realizó utilizando el sistema de detección de PCR en tiempo real iCycler IQ (Bio-Rad, Hercules, CA) en ADNc obtenido de células viejas y jóvenes aisladas con el sistema de elutriación. Se obtuvo el ARN total de cada muestra y se trató con desoxirribonucleasa (catálogo nº 1906 Ambion, Austin, TX) para eliminar la contaminación del ADN. El ADNc se sintetizó usando 5 & # x003bcg de ARN y el kit de síntesis de ADNc iScript de Bio-Rad (catálogo nº 170-8891).

Se amplificaron cuatro microlitros de una dilución en serie de 10 veces (10, 100, 1.000 y 10.000) de ADNc obtenido por transcripción inversa en una mezcla de reacción de 25 - & # x003bcl que contenía 1 & # x000d7 SYBR Green Supermix (nº de catálogo 170-8880 Bio-Rad) y 25 pM de cada cebador. Cada muestra se analizó por triplicado. Después de 3 minutos Taq etapa de activación a 95 ° C, las reacciones se sometieron a 50 ciclos de desnaturalización de 10 s a 95 ° C y una extensión de 10 sa 54 ° C. Los cebadores se adquirieron de IDT Integrated Technologies (Coraville, IA). Se eligieron pares de cebadores para minimizar la dimerización del cebador y generar un amplicón entre 100 y 150 pares de bases. Los datos ópticos se recopilaron durante la etapa de recocido de cada ciclo. Después de la PCR, los productos de reacción se fundieron durante 1 min a 95 ° C y luego la temperatura se fijó en 54 ° C y se aumentó a 94 ° C en incrementos de 0,5 ° C. Se recopilaron datos ópticos durante la duración del aumento de temperatura. Esto se hizo para asegurar que solo se amplificara un producto de PCR por reacción.

La expresión relativa de los productos de RT-PCR se determinó utilizando el modelo matemático de M.W. Pfaffl (Pfaffl, 2001). Este modelo calcula la expresión relativa usando la razón de la ecuación = [(Eobjetivo) & # x00394Ct objetivo (control - muestra)] / [(Eárbitro) & # x00394Ct ref (control - muestra)]. La proporción de un gen diana se expresa en una muestra frente a un control en comparación con un gen de referencia. miobjetivo es la eficiencia de la PCR en tiempo real de la transcripción de un gen diana, Eárbitro es la eficiencia de la PCR en tiempo real de una transcripción de un gen de referencia, & # x00394Ctobjetivo es la desviación Ct del control: muestra de la transcripción del gen diana y & # x00394Ctárbitro = Ct desviación del control - muestra de la transcripción del gen de referencia. El gen de referencia que usamos es TUB1 porque es una transcripción estable no regulada en cada uno de nuestros conjuntos de datos de microarrays. Se estudiaron nueve genes diana que pertenecen a la vía recombinacional en el tipo salvaje y el adn2-1 son. Para el cálculo de la relación células viejas / células jóvenes, se deben conocer las eficiencias individuales de la PCR en tiempo real (E) y la desviación & # x00394Ct. Calculamos las eficiencias según E = 10 [-1 / pendiente]. Debido a que cada muestra se analizó por triplicado, se utilizó el valor Ct medio en la ecuación y los valores & # x00394Ct fueron las diferencias en los valores Ct promediados entre células viejas y jóvenes para el mismo gen. Se eligió la muestra de control que contenía la misma concentración de ADNc para compararla con el gen diana.


RESULTADOS

Inducción de muerte por peróxido de hidrógeno, ácido acético y choque hiperosmótico

Elegimos peróxido de hidrógeno y ácido acético para inducir PCD y fenotipo TUNEL positivo en S. cerevisiae, para determinar la naturaleza de las lesiones de ADN detectadas por el ensayo TUNEL. La muerte celular similar a la apoptosis provocada por estos dos compuestos ha sido ampliamente caracterizada por varios laboratorios (Madeo et al., 1999, 2002 Ludovico et al., 2001a, 2002 Fabrizio et al., 2004 Wissing et al., 2004 Giannattasio et al., 2005). Recientemente se ha descrito que el choque hiperosmótico por glucosa al 60% (peso / peso) también induce el fenotipo TUNEL positivo, así como otros marcadores apoptóticos (Silva et al., 2005). Las células se cultivaron en precultivo durante la noche y luego durante dos generaciones en medio fresco antes del tratamiento con peróxido de hidrógeno, ácido acético o glucosa al 60% (p / p), como se describe en Materiales y métodos. Se tomaron muestras en el tiempo cero y en varios puntos de tiempo, como se indica en la Figura 1. Las células se esparcieron en medio YPD sólido y las unidades formadoras de colonias (c.f.u.) se contaron después de 3 d de incubación. El porcentaje de supervivencia se calculó como el número de c.f.u. obtenido en cada punto de tiempo dividido por el número de c.f.u. obtenido en el tiempo 0. El tratamiento con peróxido de hidrógeno 10 mM inició la muerte celular (Figura 1A) sin fase de retardo. La muerte celular por ácido acético 175 mM a pH 3,0 mostró una fase de retraso inicial de ~ 30 min, antes de que la muerte celular fuera evidente (Figura 1B). El tratamiento durante 200 min con ácido acético 175 mM a pH 3,0 o peróxido de hidrógeno 10 mM o glucosa al 60% (p / p) durante 10 h (Figura 1C) resultó en una supervivencia de ~ 10%, que en nuestra experiencia y en la de otros (Madeo et al., 1999) da el mayor rendimiento de células positivas a TUNEL. El tratamiento durante 20-25 min con peróxido de hidrógeno 150 mM (Figura 1D) dio aproximadamente la misma supervivencia restante que 10 mM durante 200 min, lo que representa una inducción de la muerte celular aproximadamente 10 veces más rápida.

Figura 1. S. cerevisiae Se incubó BY4741 con peróxido de hidrógeno (A) 10 mM o ácido acético 175 mM, pH 3,0 (B), glucosa (C) al 60% (peso / peso) o peróxido de hidrógeno (D) 150 mM. Las muestras se tomaron en los puntos de tiempo indicados y se colocaron en placas sobre medio YPD sólido. c.f.u. se contaron después de 2 d de incubación a 30 ° C. La supervivencia relativa se traza en el X-axis (100% corresponds to the number of c.f.u. at time 0). Values are mean ± SEM of three independent experiments.

TUNEL Stains Both SSBs and DSBs in S. cerevisiae

Cells grown as described in Materiales y métodos were fixed with formaldehyde and subsequently digested with Zymolyase to remove the cell wall. Cells were treated with DNaseI to generate chromosomal DSBs. DNaseI cleaves both DNA strands at approximately the same site, producing DNA fragments with blunt ends or to a lesser extent protruding termini of one or two nucleotides. The cells were then stained with TUNEL protocol according to previously published protocols (Madeo et al., 1997). The nuclei was intensely stained by TUNEL in cells treated with DNaseI (Figure 2, DNaseI) This staining does not occur in nontreated cells (Figure 2, negative control). Positive TUNEL staining was also obtained by treatment with N.BbvCIA nicking endonuclease (Figure 2, N.BbvCIA). N.BbvCIA is a restriction enzyme engineered to cut one DNA strand only. This result shows that the free 3′-OH exposed in SSBs in S. cerevisiae is a good substrate for the terminal transferase in the TUNEL reaction. Cells treated with hydrogen peroxide or acetic acid (as described in Materiales y métodos), but no added restriction enzymes, did also show TUNEL staining (Figure 2, hydrogen peroxide and acetic acid). TUNEL staining is more diffuse and has slightly higher background for the hydrogen peroxide-treated cells. Nevertheless, nuclei are clearly visible against the background.

Figure 2. Bright field and epifluorescence images of TUNEL and in situ ligation-stained cells. Left column, TUNEL staining of exponentially growing cells, fixed and treated with DNaseI or N.BbvCIA nicking endonuclease. Right column, in situ ligation staining of exponentially growing cells, fixed and treated with BsuRI (blunt endonuclease) or DNaseI and N.BbvCIA (nicking endonuclease). Row marked negative control shows exponentially growing cells stained with TUNEL or in situ ligation staining. Rows marked hydrogen peroxide and acetic acid show cells incubated for 200 min with 10 mM hydrogen peroxide or 175 mM acetic acid, pH 3.0. Left, phase-contrast microscopy right, fluorescence microscopy of the same cells. Bar, 5 μm.

ISL Assay Specifically Stains DSBs in S. cerevisiae

Cells were also subjected to ISL staining with a fluorescent double-stranded DNA hairpin probe according to the methods published by Didenko and coworkers (Didenko and Hornsby, 1996 Didenko et al., 1999). A small double strand fluorescent DNA probe is ligated to sites of DSBs. It has been shown to specifically stain mammalian apoptotic cells (Didenko et al., 2003). The probe cannot ligate to single-stranded DNA breaks and is therefore in theory more specific for DSBs than TUNEL staining. Specific ISL staining, visually similar to staining by TUNEL, was evident in cells treated with DNaseI and the blunt restriction enzyme BsuRI (Figure 2, in situ ligation, DNaseI and BsuRI). There was no detectable staining in the absence of endonucleases (Figure 2, in situ ligation, negative control). ISL does not stain cells treated with nicking endonuclease N.BbvCIA, confirming that SSBs do not facilitate ligation of the ISL probe (Figure 2, N.BbvCIA). These results show that both TUNEL and ISL procedures are equally efficient at detecting DSBs in S. cerevisiae chromosomal DNA, but TUNEL assay also detects nicked DNA. Cells treated with peroxide or acetic acid did not show any ISL staining (Figure 2, hydrogen peroxide and acetic acid), indicating that these cells do not contain blunt DSBs.

Staggered DSBs Can Be Discriminated by ISL in Combination with Klenow DNA Polymerase

ISL has been used to distinguish between different types of staggered DSBs in combination with Klenow DNA polymerase (Didenko et al., 2003). Theoretically, if DSBs with 5′ overhangs are present, the DNA polymerase activity of Klenow will synthesize the missing DNA in the presence of dNTPs and produce blunt ends. In contrast, if DSBs breaks with 3′ overhangs are present, the Klenow 5′-3′ exonuclease activity will degrade the overhang until the DNA is blunt.

To test whether ISL could discriminate between different types of DSBs in S. cerevisiae, we performed ISL on cells treated with endonucleases producing 5′ or 3′ overhang. Cells were grown, fixed, and Zymolyase treated, as described above, and subsequently treated with restriction endonucleases, creating either 1-base pair 3′ overhangs (HhaI) or 1-base pair 5′ overhangs (Bme1390I). None of the enzyme-treated samples showed any positive staining with ISL assay (Figure 3, − Klenow). This shows that ISL does not stain staggered DSBs. ISL staining is restored to cells treated with HhaI and to cells treated with Bme1390I, by treatment with Klenow DNA polymerase and Klenow DNA polymerase plus dTNPs, respectively (Figure 3, + Klenow). This means that different types of staggered double-stranded DNA ends can be discriminated by the ISL assay in yeast. The intensity is lower than for the DNaseI or BsuRI treatment (Figure 2), probably due to incomplete transformation of staggered DSBs.

Figure 3. Bright field and epifluorescence images of in situ ligation-stained cells. Exponentially growing cells were treated with HhaI (1-base pair 3′ overhang) and Bme1390I (1-base pair 5′ overhang) endonucleases. The cells in the right column were treated with Klenow (+ Klenow, HhaI) or Klenow + dNTPs (+ Klenow, Bme1390I) before in situ ligation staining. Left, phase-contrast microscopy right, fluorescence microscopy of the same cells. Bar, 5 μm.

We reasoned that the lack of ISL staining of cells treated with hydrogen peroxide or acetic acid (Figure 2, hydrogen peroxide, acetic acid) may be that they contain staggered DSBs that are not detectable by ISL. We added Klenow or Klenow and dNTPs to cells treated with hydrogen peroxide or acetic acid in a manner similar to the experiment described in Figure 3, but the ISL staining was still negative (Figure 4). This indicates that hydrogen peroxide- or acetic acid-treated cells do not contain staggered DSBs with 1-base pair overhangs.

Figure 4. Bright field and epifluorescence images of in situ ligation-stained cells. In situ ligation staining of cells incubated for 200 min with 10 mM hydrogen peroxide or 175 mM acetic acid, pH 3.0. The cells were treated with Klenow (left column) or Klenow + dNTPs (right column) before in situ ligation staining. Left, phase-contrast microscopy right, fluorescence microscopy of the same cells, Bar, 5 μm.

Chromosomal DNA Is Damaged in Cells Treated with Hydrogen Peroxide, Acetic Acid, or High Concentrations of Glucose

In our hands, ISL assay together with Klenow or Klenow + dNTPs is limited in the overhang length of staggered DSBs that the method can overcome. We treated cells with enzymes creating four-base pair overhangs with subsequent Klenow transformation to blunt DSBs, and we noted a considerable decrease in the ISL signal (our unpublished data) compared with the treatments with HhaI and Bme1390I (Figure 3). This led to the hypothesis that cells treated with hydrogen peroxide or acetic acid may have staggered DSBs with long overhangs, undetectable by ISL.

To overcome this difficulty, we analyzed chromosomal DNA from cells treated with hydrogen peroxide, acetic acid, or glucose-induced hyperosmotic shock using PFGE (Figure 5A). Samples were taken at six time points between zero and 200 min (hydrogen peroxide, acetic acid) or 10 h (hyperosmotic shock). DNA from cells treated with hydrogen peroxide after 200 min (Figure 5A, hydrogen peroxide, lane 200 min) was completely degraded to a smear of fragments slightly shorter than S. cerevisiae chromosome I (225 kb) but still of a considerable size. The DNA from acetic acid-treated cells showed less degradation but still a visible smear and chromosomal bands of lower intensity (Figure 5A, acetic acid, lanes 60–200 min). DNA from cells killed by hyperosmotic shock showed degradation over 10 h comparable to that of hydrogen peroxide-treated cells (Figure 5A, glucose 60%, lanes 6–10 h). This is the first time that clear DNA degradation has been shown in S. cerevisiae associated with PCD.

Figure 5. Genomic DNA analyzed by PFGE from viable cells (A and C–E) or fixed S. cerevisiae cells (B). Cells were exposed to 10 mM hydrogen peroxide, 175 mM acetic acid, pH 3.0, 60% (wt/wt) glucose, or 150 mM hydrogen peroxide as indicated in the figure. Lanes marked as control were loaded with DNA isolated from exponentially growing cells without further treatment. Samples were collected after various periods as indicated (minutes) except for treatment with 60% (wt/wt) glucose, where time points are indicated in hours. (D) Cells were exposed to 10 mM hydrogen peroxide or 175 mM acetic acid, pH 3.0, and isolated chromosomal DNA was subsequently treated with S1 nuclease to degrade nicked DNA. Lane marked control S1 is similar to control lanes, but the DNA was treated with S1 nuclease before PFGE. (E) Lanes 1 and 2 show chromosomal DNA from nontreated cells, digested with N.BbvCIA nicking endonuclease (1) or DNaseI (2).

DNA Fragmentation by Hydrogen Peroxide Requires Active Enzymes

Cells were fixed with 3.7% (vol/vol) formaldehyde before treatment with 10 mM hydrogen peroxide for 200 min or 150 mM for 25 min (Figure 5B) to test whether the presence of active enzymes is necessary for DNA fragmentation to proceed. Fixing cells with formaldehyde preserves the structure of cells and enzymes, but it eliminates enzymatic activity. The fixed cells treated with hydrogen peroxide show no DNA damage, indicating that the DNA fragmentation requires some enzymatic activity within the cell and that fragmentation is not due to a direct chemical reaction between hydrogen peroxide and DNA (Figure 5B). In addition, purified yeast chromosomes were not degraded by 10 mM hydrogen peroxide in vitro for 200 min (our unpublished data).

DNA Fragmentation by Hydrogen Peroxide Does Not Occur after Treatment with High Concentrations of Hydrogen Peroxide

A common observation regarding PCD is that specific markers of PCD usually only occur within a rather limited window of treatment intensity. At too high intensity of the treatment, the cell is presumed to die from complete breakdown (necrosis) before any PCD process can be initiated. Chromosomal DNA was fragmented during 200-min treatment with 10 mM hydrogen peroxide (Figure 5A). During this process, the fraction of viable cells decreases from 100 to ∼5–10% (Figure 1A). The DNA in S. cerevisiae cells treated with 150 mM hydrogen peroxide remained intact (Figure 5C) for the 25 min necessary for a decrease from 100 to ∼1% surviving cells (Figure 1C). This result shows that cell death is only associated with DNA fragmentation for treatment of relatively low intensity.

DNA Damage in Hydrogen Peroxide- or Acetic Acid-treated Cells Is Primarily Made Up of SSBs

Lack of ISL staining of cells treated with hydrogen peroxide or acetic acid combined with the finding that TUNEL assay is not specific for DSBs led us to the hypothesis that the main type of DNA damage detected by TUNEL in our experiments consists of SSBs. This hypothesis can be tested by treatment of the DNA with S1 nuclease that will preferably attack at sites of single-stranded DNA breaks, reducing SSBs to DSBs, causing the DNA to migrate faster on the gel. Figure 5D shows a PFGE gel with DNA from cells treated with hydrogen peroxide or acetic acid, with and without treatment with S1 nuclease. Untreated DNA (Figure 5D, lane control) shows little degradation with S1 nuclease treatment (Figure 5D, lane control S1), indicating that no or few single-stranded breaks are present in untreated cells. Comparing the same time points for hydrogen peroxide- and acetic acid-treated cells without (Figure 5A) and with S1 treatment (Figure 5D, lanes marked +), there is an enhanced degradation upon S1 treatment. We conclude that the main form of DNA damage in hydrogen peroxide- and acetic acid-treated cells consists of single-stranded DNA breaks.

N.BbvCIA Nicking Endonuclease and Hydrogen Peroxide Treatment Yield Similar DNA Damage

It is evident from the images showing DNA damage (Figure 5A) that although the chromosomes are broken down to the point of not being visible, the resulting fragments are still several hundreds of kilobases and do not seem to break down into smaller fragments. We treated isolated DNA with DNaseI and N.BbvCIA nicking endonuclease (Figure 5E). Isolated DNA treated with DNaseI broke down into fragments too small to be visible on the gel (Figure 5E, lane 2), whereas DNA treated with N.BbvCIA (Figure 5E, lane 1) revealed DNA fragmentation with the same visual appearance on the gel as cells treated with hydrogen peroxide for 200 min (Figure 5A, lane 200 min). This observation is consistent with the conclusion that DNA damage in hydrogen peroxide-treated cells are primarily a consequence of accumulation of SSBs.


Boy Is Clue to What Causes Aging

One of Niederhofer's colleagues on the study was Jan Hoeijmakers, PhD, of Erasmus Medical Center in Rotterdam, Netherlands.

Hoeijmakers had heard from doctors in Germany about a 15-year-old Afghan boy with an extreme form of premature aging, a condition called progeria.

Continuado

The boy was extremely sensitive to sunlight and had had an old, wizened appearance since age 10.

He was gaunt, had hearing loss and vision problems, and had had hepatitis A and tuberculosis as a young child.

The boy died when he was 16 after getting severe pneumonia and having organ failure. Genetic tests showed the boy had a severe mutation in his XPF gene, a gene involved in DNA repair.


Notas al pie

Descargo de responsabilidad del editor: Este es un archivo PDF de un manuscrito sin editar que ha sido aceptado para publicación. Como servicio a nuestros clientes, proporcionamos esta primera versión del manuscrito. El manuscrito se someterá a corrección de estilo, composición tipográfica y revisión de la prueba resultante antes de que se publique en su forma citable final. Tenga en cuenta que durante el proceso de producción se pueden descubrir errores que podrían afectar el contenido, y todas las renuncias legales que se aplican a la revista pertenecen.


Deleting 'Anti-Aging' Gene From Yeast Greatly Lengthens Life Span

A counterintuitive experiment has resulted in one of the longest recorded life-span extensions in any organism and opened a new door for anti-aging research in humans.

Scientists have known for several years that an extra copy of the SIR2 gene can promote longevity in yeast, worms and fruit flies.

That finding was covered widely and incorporated into anti-aging drug development programs at several biotechnology companies.

Now, molecular geneticists at the University of Southern California suggest that SIR2 instead promotes aging.

Their study, "Sir2 Blocks Extreme Life-Span Extension," appears in the Nov. 18 edition of the biology journal Cell. The lead author is Valter Longo, assistant professor in the Leonard Davis School of Gerontology and the USC College of Letters, Arts and Sciences.

Rather than adding copies of SIR2 to yeast, Longo's research group deleted the gene altogether.

The result was a dramatically extended life span - up to six times longer than normal - when the SIR2 deletion was combined with caloric restriction and/or a mutation in one or two genes, RAS2 and SCH9, that control the storage of nutrients and resistance to cell damage.

Human cells with reduced SIR2 activity also appear to confirm that SIR2 has a pro-aging effect, Longo said, although those results are not included in the Cell paper.

Since all mammals share key aging-related genes, the paper points to a new direction for human anti-aging research.

Longo proposes that SIR2 and possibly its counterpart in mammals, SIRT1, may block the organism from entering an extreme survival mode characterized by the absence of reproduction, improved DNA repair and increased protection against cell damage. Organisms usually enter this mode in response to starvation.

The long-lived organisms in Longo's experiment showed extraordinary resilience under stress.

"We hit them with oxidants, we hit them with heat," Longo said. "They are highly resistant to everything. What they're doing is basically saying, 'I cannot afford to age. I still have to generate offspring, but I don't have enough food to do it now."

Longo predicted that as molecular geneticists master the levers of aging, they will be able to design drugs that coax the body into entering chosen aspects of a starvation-response mode, such as stress resistance, even when food is plentiful.

If enough food is available, an organism might be programmed both to reproduce normally and to maximize its survival systems.

Longo urged caution in extrapolating the result to humans.

"We have been very successful with simple organisms," he said. "Naturally, mammals are complex, and it will be a great challenge to get major life-span extension."

A "really exciting" implication, Longo said, is that cells may be able to speed up their DNA repair efforts. All organisms have the ability to repair harmful mutations in their DNA, whether caused by age, radiation, diet or other environmental factors. Cancer often begins when DNA mutations outstrip a cell's ability to remain differentiated.

Many researchers believe DNA repair systems are already running flat out. The organisms in Longo's experiment say otherwise.

"In our paper, we show that age-dependent mutations increase at a much slower pace in organisms lacking RAS2 or SCH9 and at a remarkably low pace in organisms lacking both SCH9 and SIR2, raising the possibility that the mutations that cause human cancers can be delayed or prevented," Longo said.

"Notably, mutations that increase the activity of human homologs of the yeast SCH9 and RAS2 genes play central roles in many human cancers." Homologs are genes descended from a common ancestral DNA sequence.

Joining with researchers at the USC Norris Comprehensive Cancer Center, Longo is studying the feasibility of reducing or preventing the age-dependent DNA mutations that cause cancer.

Longo and his collaborators began studying SIR2 in 2000, soon after a well-known set of experiments by Leonard Guarente at the Massachusetts Institute of Technology. Guarente was the first to show that over-expression of the SIR2 gene could extend life span beyond its natural limit.

However, Longo said, "We were convinced that SIR2 had the potential to be a more potent pro-aging than an anti-aging gene. And the reason was in part because of the similarity with this other gene, called HST1, which negatively regulated so-called protective genes. So we set out to test whether SIR2 could do the opposite of what everybody said it does."

The researchers do not quarrel with Guarente's finding of a moderate increase in life span when SIR2 is over-expressed. But their work shows that much greater potential gains lie in the opposite direction.

Longo's co-author was USC research scientist Paola Fabrizio. The other USC authors were Cristina Gattazzo, Luisa Battistella, Min Wei, Chao Cheng and Kristen McGrew.

Funding for this research came from the American Federation for Aging Research and from the National Institute of Aging of the National Institutes of Health.


The type of vacuole found in yeast cells is somewhat analogous to the lysosome that we animals possess in that it is involved in breaking down waste products and recycling broken cellular components (via the process of autophagy) that would otherwise harm the cell. It is an agent of cellular housekeeping, in other words. There the similarities end, however, as the vacuole performs many other vital tasks that the more specialized lysosome does not.

So here, researchers show that they can extend life in yeast by reversing a change that occurs in the vacuole. Because the vacuole has many more tasks than the lysosome, it's not immediately clear that this has any application to our biology of aging, however. It is still worth keeping an eye on this research as we know that decline in lysosomal function (and thus of cellular housekeeping) is important in animal aging. You might recall, for example, that researchers managed to reverse the age-related loss of liver function in mice by finding a way to keep lysosomal function running at youthful rates. Similarly, reversing the root causes of lysosomal decline is on the SENS agenda - to be achieved by breaking down the build up of metabolic waste products that accumulate in lysosomes and cause them to malfunction.

Normally, mitochondria [in yeast] are beautiful, long tubes, but as cells get older, the mitochondria become fragmented and chunky. The changes in shape seen in aging yeast cells are also observed in certain human cells, such as neurons and pancreatic cells, and those changes have been associated with a number of age-related diseases in humans.

The vacuole - and its counterpart in humans and other organisms, the lysosome - has two main jobs: degrading proteins and storing molecular building blocks for the cell. To perform those jobs, the interior of the vacuole must be highly acidic. [Researchers] found that the vacuole becomes less acidic relatively early in the yeast cell's lifespan and, critically, that the drop in acidity hinders the vacuole's ability to store certain nutrients. This, in turn, disrupts the mitochondria's energy source, causing them to break down. Conversely, when [researchers] prevented the drop in vacuolar acidity, the mitochondria's function and shape were preserved and the yeast cells lived longer.

Until now, the vacuole's role in breaking down proteins was thought to be of primary importance. We were surprised to learn it was the storage function, not protein degradation, that appears to cause mitochondrial dysfunction in aging yeast cells. . The unexpected discovery prompted [the researchers] to investigate the effects of calorie restriction, which is known to extend the lifespan of yeast, worms, flies and mammals, on vacuolar acidity. They found that calorie restriction - that is, limiting the raw material cells need - delays aging at least in part by boosting the acidity of the vacuole.


Variations

  • Use the procedure above to make plates with diluted yeast cultures and expose the yeast to sunlight at various times of day for example, at 10:00 AM, noon, and 2:00 PM. Use the same duration of exposure.
  • Expose the yeast for various durations at the same time of day, for example 0, 0.5, 1, 2, 4, and 8 minutes at noon.
  • Compare wild-type and DNA-repair-deficient yeast strains for UV sensitivity. Obtain wild-type S. cerevisiae from a science supply company for example, Carolina Biological, item # 898900. Culture this strain and plate out dilutions, as described in the procedure. Compare the sensitivity of the wild-type and DNA-repair-deficient strains to ultraviolet light from the sun.



Comentarios:

  1. Daiktilar

    En mi opinión ya se ha comentado, aprovecha la búsqueda.

  2. Terrys

    Wacker, que una frase necesaria ..., un pensamiento brillante

  3. Owin

    Es una pena que no pueda hablar ahora, tengo prisa por llegar al trabajo. Volveré, definitivamente expresaré mi opinión.

  4. Niewheall

    Que tema tan divertido

  5. Woudman

    Estas equivocado. Puedo probarlo. Escríbeme en PM.



Escribe un mensaje