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Razón detrás de la formación de superenrollamientos positivos durante la replicación / transcripción del ADN

Razón detrás de la formación de superenrollamientos positivos durante la replicación / transcripción del ADN



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Cuando se desenrolla una torsión sin cortar las hebras de ADN o se elimina cortando la (s) hebra (s) y volviendo a sellar, se introducen superenrollamientos negativos en el ADN.

De Biología Celular y Molecular -Karp

Pero, curiosamente, el desenrollamiento del ADN por la helicasa hace que el ADN por delante del primosoma forme superenrollamientos positivos. ¿Por que es esto entonces?

De: Biología celular molecular -Lodish

Mis especulaciones: El subbobinado hace que el ADN adyacente se sobreenrolle y, a medida que el ADN se sobreenrolla, el estrés asociado desarrollado hace que el ADN forme superenrollamientos positivos (lo que habría sucedido de forma natural si se hubieran introducido nuevos giros en el ADN). (Tiempo: 1:54) ).

Creo que la eliminación de la torsión crea inicialmente superenrollamientos negativos, pero cuando el desenrollado provoca demasiado sobreenrollamiento del ADN adyacente, la cepa desarrollada hace que el ADN ya superenrollado negativamente forme superenrollamientos positivos.


Es difícil de explicar en texto, así que aquí tienes un video:

https://www.youtube.com/watch?v=J4YlcD59-yw

Imagina que los cordones de los zapatos son dos hebras de ADN en una doble hélice. Están topológicamente restringidos en cada extremo. A medida que la pluma (helicasa) se mueve a través de la hélice, crea ADN sobreenrollado frente a ella y ADN subbobinado detrás.


Burbuja de transcripción

Una vez que la subunidad sigma se ha unido a un promotor, la enzima del núcleo de la ARN polimerasa abre la doble hélice del ADN localmente para formar la burbuja de transcripción . Tenga en cuenta que la secuencia -10, TATAAT, consta de pares de bases AT. Debido a que estos son más débiles que los pares de bases GC, esto ayuda a que el ADN se derrita en hebras simples. Una vez que se ha abierto la hélice de ADN, se genera una sola hebra de ARN utilizando una de las hebras de ADN como plantilla para hacer coincidir las bases. Una vez que la ARN polimerasa se ha unido al ADN e iniciado una nueva hebra de ARN, la subunidad sigma ya no es necesaria y, a menudo (aunque no siempre) se desprende del ADN, dejando atrás la enzima central. En realidad, la ARN polimerasa permanece en el promotor hasta que la nueva hebra tiene ocho o nueve bases de largo (fig. 11.06). En este punto, la subunidad sigma se va y la enzima central viaja a lo largo del ADN, alargando el ARNm (véase el cuadro 11.01).

Figura 11.06. Alargamiento del ARNm

Se muestra el comienzo de la síntesis de ARN. Las hebras de ADN se han separado en la burbuja de transcripción. La síntesis de seis bases de ARN complementarias a las de la hebra de la plantilla de ADN (antisentido) se produce mientras la ARN polimerasa permanece en el sitio del promotor.

Como se señaló anteriormente, la ARN polimerasa bacteriana consta de cinco subunidades permanentes que forman la enzima central, que se ensambla en el orden que se muestra en la figura 11.07. A veces están presentes otras dos subunidades: la subunidad sigma (necesaria para el reconocimiento del promotor) y la subunidad rho (necesaria para algunos terminadores). La ARN polimerasa pasa por varios pasos al transcribir un gen. En cada etapa, la enzima cambia de conformación y, por supuesto, también lo hace el ADN molde y la transcripción del ARN emergente. Los complejos "cerrados" y "abiertos" se refieren al estado del ADN en el promotor, que se abre cuando se une la ARN polimerasa.

La ARN polimerasa abre el ADN para formar la burbuja de transcripción.

La primera base transcrita del ARNm es normalmente una A. Esta A especial suele estar flanqueada por dos pirimidinas, que suelen dar la secuencia CAT. A veces, la primera base transcrita es una G, pero casi nunca una pirimidina. La síntesis de ARNm es de 5 'a 3' y avanza a aproximadamente 40 nucleótidos por segundo. Esto es mucho más lento que la replicación del ADN (

1000 bp / seg), pero aproximadamente equivalente a la velocidad de síntesis de polipéptidos (15 aminoácidos por segundo).

La enzima central avanza, fabricando ARN y dejando sigma en el promotor.

La enzima central de la ARN polimerasa bacteriana consta de cinco subunidades, dos α más β y β ′ y ω (fig. 11.08). Las subunidades β y β'comprenden el sitio catalítico de la enzima. La subunidad α se requiere en parte para el ensamblaje y en parte para reconocer los promotores. La subunidad ω- (omega) se une a la subunidad β′, la estabiliza y ayuda a su ensamblaje en el complejo enzimático central. La ARN polimerasa tiene un surco profundo en el medio que puede acomodar aproximadamente 16 pb de ADN en el caso de bacterias y aproximadamente 25 pb en el caso de eucariotas, como la levadura, cuya ARN polimerasa es más grande. Un surco más delgado, aproximadamente en ángulo recto con el primero, puede contener la hebra de ARN recién construida.

Figura 11.08. Estructura de la ARN polimerasa

(A) La ARN polimerasa bacteriana tiene cinco tipos de subunidades con cuatro especificidades funcionales. Aquí se comparan esquemáticamente las subunidades de Bacteria, Archaea y eucariotas. Cada color especifica unidades funcionalmente similares de un dominio a otro. (B) Estructura tridimensional de T. aquaticus ARN polimerasa y S. cerevisiae La ARN polimerasa II se muestra en la misma orientación y codificación de color que en (A). El sitio activo contiene un ion magnesio (mostrado como una esfera rosa). Los iones de zinc se muestran como esferas de color azul pálido.

(Crédito: Cramer, P., 2002. Curr. Opin. Struct. Biol. 12, 89-97.)

La ARN polimerasa procariota es inhibida por el conocido antibiótico rifampicina. Este se une al canal de ADN y ARN dentro de la subunidad β de la enzima. Aunque la rifampicina no se une realmente al sitio activo, bloquea físicamente el alargamiento de la cadena de ARN en crecimiento. La mayoría de las mutaciones resistentes a la rifampicina son el resultado de cambios únicos en la secuencia de aminoácidos de la subunidad β que disminuyen la unión de la rifampicina. Clínicamente, la rifampicina se usa para tratar la tuberculosis y la lepra, en combinación con otros antibióticos.

El superenrollamiento negativo del cromosoma bacteriano promueve la apertura del ADN durante la transcripción. A medida que la ARN polimerasa se mueve a lo largo del ADN, enrolla el ADN con más fuerza delante de sí mismo, creando superenrollamientos positivos. También deja ADN parcialmente desenrollado, lo que genera superenrollamientos negativos. Para restaurar los niveles normales de superenrollamiento, la ADN girasa inserta superenrollamientos negativos delante de la ARN polimerasa y la topoisomerasa I elimina los superenrollamientos negativos detrás de la ARN polimerasa (consulte el Capítulo 4: Genes, genomas y ADN).


Materiales y métodos

Proteínas Purificadas.

E. coli La ARN polimerasa se purificó mediante el método de Hager. et al. (14). La ARN polimerasa de T7 se purificó como se describe (15) a partir de un E. coli cepa, BL21 & # x0002fpAR1219 (generosamente proporcionada por F. W. Studier, Brookhaven National Laboratory, Upton, NY), que sobreexpresa esta enzima. Bacteriófago & # x003bb O proteína y E. coli La ADN girasa y la proteína HU se purificaron como se describe (16, 17). Preparaciones de purificado E. coli ADN Topo I y E. coli RNase H fueron obsequios de R. DiGate (Univ. De Maryland, Baltimore) y R. Crouch (Institutos Nacionales de Salud), respectivamente. & # x003bb CEl represor fue un regalo de C. Pabo (Instituto Tecnológico de Massachusetts, Cambridge). E. coli gal represor (GalR) y laca represor (LacI) fue proporcionado amablemente por S. Adhya (Institutos Nacionales de Salud). EcoLa endonucleasa de restricción RI-Gln-111 fue un generoso obsequio de P. Modrich (Universidad de Duke, Durham, NC). Todas las enzimas de restricción, ADN ligasa de T4, ADN polimerasa de T4 y fosfatasa alcalina intestinal de ternera se adquirieron en New England Biolabs.

Plantillas de ADN plasmídico.

Todos los plásmidos se derivaron del plásmido pUC18 (18), excepto el plásmido pRLM409, que se derivó del plásmido pUC8 (19) por medio de un intermedio, el plásmido pRLM156 (20). Los detalles de construcción de todos los plásmidos, así como los mapas de los plásmidos pRLM389, pRLM411 y pRLM419, se publican como información complementaria en el sitio web de PNAS, www.pnas.org.

In vitro Ensayo de transcripción y superenrollamiento (T-S).

El estandar in vitro La mezcla de reacción TS (300 & # x003bcl) contenía Hepes & # x0002fKOH 40 mM (pH 7,6), acetato de magnesio 11 mM, glutamato de potasio 100 mM, DTT 1 mM, ATP 4 mM, 0,5 mM de cada uno de GTP, CTP y UTP, 2,5 & # x003bcg de ADN plasmídico superenrollado, E. coli ADN girasa (80 nM) y ARN polimerasa de T7 (20 nM) o E. coli ARN polimerasa (33 nM). Cuando se especificó, se añadieron proteínas adicionales a la mezcla de reacción estándar T-S. Todos los componentes se ensamblaron en hielo y se incubaron, a menos que se especifique lo contrario, durante 10 min a 30 ° C. Las reacciones T-S se terminaron mediante extracción con un volumen igual de fenol. Las muestras de ADN se precipitaron con etanol y se disolvieron en 60 & # x003bcl de tampón Tris & # x022c5HCl 10 mM (pH 8,0). Cada muestra se complementó con 5 & # x003bcg de RNasa A y 1 unidad de RNasa H y se incubó durante 30 min a 37 & # x000b0C. Cada muestra de ADN se extrajo una vez con fenol y una porción de un cuarto se analizó mediante electroforesis a 1 V & # x0002fcm durante 16 h en un gel de agarosa 1 & # x00025 en tampón TAE, pH 7,8, (21) que contenía 5 & # x003bcg & # x0002fml cloroquina. Algunas muestras de ADN también se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa bidimensional en las condiciones descritas anteriormente, excepto que el tampón de ejecución TAE contenía 10 & # x003bcg & # x0002fml de cloroquina en la primera dimensión y 50 & # x003bcg & # x0002fml de cloroquina en la segunda. dimensión. Los geles de agarosa se tiñeron con bromuro de etidio y se fotografiaron.


Examen final, cuestionarios y preguntas de la prueba de Genética Molecular

el proceso de reconocimiento desencadena un cambio conformacional tanto en la enzima como en el ADN.

Respuesta correcta
el primer contacto con el ADN es específico.

en el primer contacto, la enzima interactúa únicamente con el esqueleto del ADN azúcar-fosfato.

Una endonucleasa de restricción particular puede escindir el ADN en varios sitios diferentes.

Las endonucleasas de restricción reconocen la estructura de azúcar-fosfato del ADN.

Las endonucleasas de restricción deben escindir el ADN en un proceso de varios pasos.

Une dos piezas de ADN formando enlaces fosfodiéster.

Solo puede ligar fragmentos de ADN con extremos pegajosos (complementarios).

son bacterias no transformadas

contienen ADN plasmídico no recombinante

han hidrolizado ampicilina para formar un compuesto coloreado

ADN del vector YAC no recombinante.

ADN del vector YAC recombinante.

Fragmentos de ADN que representan la secuencia completa de genes expresados ​​de un tejido, tipo de célula o etapa de desarrollo específicos.

Fragmentos de ARN que representan las regiones codificantes de genes expresados ​​de un tejido, tipo celular o etapa de desarrollo específicos.

Fragmentos de ADN que representan el conjunto completo de genes del genoma de un organismo.

Los cebadores se hibridan con el ADN que se va a amplificar.

La ADN polimerasa está extendiendo nuevo ADN a partir de los cebadores.

Se están desnaturalizando los cebadores.

La secuencia de ADN del marcador genético y la secuencia de ADN del gen de la enfermedad son casi idénticas.

El marcador genético y el gen de la enfermedad están en estrecha proximidad física en el mismo cromosoma y tienden a heredarse juntos.

El marcador genético se encuentra dentro de la región codificante del gen de la enfermedad.

No se puede obtener información de este análisis porque los investigadores deberían haber realizado una transferencia Northern, no una transferencia Southern.

Un polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) está vinculado a este rasgo autosómico dominante.

Un polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) está vinculado a este rasgo autosómico recesivo.

El ADN se introduce en una célula eucariota y permanece extracromosómico.

El ADN se introduce en las células bacterianas para su amplificación.

El ADN se introduce en una célula eucariota y se integra de forma estable en un cromosoma.

Respuesta correcta (4)
Evita que se transcriba el ARNm.

Respuesta correcta __2__
Examina la estructura de las proteínas.

Respuesta correcta __5__
Examine si una proteína se traduce o no.

Respuesta correcta __1__
Mide los niveles de ARN.

Respuesta correcta __6__
Mide las interacciones proteína-proteína.

3.
Ensayo de cambio de movilidad electroforética

5.
Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

Una repetición palindrómica intercalada de ADN

no hay diferencia de que la transcripción y la traducción estén acopladas tanto en bacterias como en eucariotas.

Aquí hay muchos niveles adicionales de control de la expresión génica en bacterias.

la transcripción y la traducción están desacopladas en las bacterias.

ninguno de los 5 ′ y 3 ′ anteriores son solo importantes para la replicación del ADN

A)
se refiere a la rapidez con la que se produce el alargamiento de la transcripción.

B)
se refiere a la frecuencia relativa de inicio de la transcripción.

C)
depende de la afinidad de la ARN polimerasa por la región promotora.

Es parte de una secuencia de consenso del promotor.

Está tanto transcrito como traducido.

Es corriente arriba de la mayoría de los genes.

la secuencia repetida está seguida por 7 a 8 nucleótidos que contienen uracilo

la secuencia de consenso es una repetición invertida

La unión del factor sigma al terminador desencadena la liberación de la transcripción.

genera superenrollamientos positivos (sobreenrollamiento) detrás de sí mismo.

previene el superenrollamiento al rastrear alrededor de la hélice de ADN.

previene el superenrollamiento al generar mellas en la hélice del ADN.

los niveles de lactosa son altos y los niveles de glucosa son bajos

los niveles de lactosa son bajos y los niveles de glucosa son bajos

los niveles de lactosa son bajos y los niveles de glucosa son altos

A)
condujo al descubrimiento de ARNm.

B)
propuso la existencia de una proteína represora.

un compuesto químicamente similar a la glucosa

un compuesto químicamente similar a la lactosa

un compuesto químicamente similar a la galactosa

Cuando la vitamina E se une al represor, el represor no puede unirse a la ARN polimerasa

Cuando la vitamina E se une al represor, el represor puede unirse a la ARN polimerasa.

Cuando la vitamina E se une al represor, el represor no puede unirse al operador.

La ADN polimerasa puede iniciar la síntesis de novo.

La ADN polimerasa cataliza la formación de un enlace fosfodiéster entre el primer grupo 3'hidroxilo del nuevo dNTP y el 5'-fosfato del último nucleótido en la hebra recién sintetizada.


MATERIALES Y MÉTODOS

Enzimas y materiales

[γ- 32 P] ATP (7000 Ci / mmol) era de ICN, los oligonucleótidos se adquirieron de tecnología de ADN y Me 2 SO y CPT eran de Sigma-Aldrich. El CPT se disolvió en 99,9% de Me 2 SO a 20 mM y almacenado a –20 ° C. Todos los demás productos químicos utilizados fueron de grado reactivo analítico.

La topo I humana de tipo salvaje (HT) así como las cuatro enzimas topo I humanas mutantes, HT (Trp205Gly), HT▵ (191-206), HT (207-765) y HT (Tyr723Phe) se expresaron en el Saccharaomyces cerevisiae top1 cepa nula RS190 (un amable obsequio de R. Sternglanz, Universidad Estatal de Nueva York, Stony Brook, NY, EE. UU.) y purificada como se describió anteriormente (17). Se preparó pBR322 superenrollado positivamente incubando plásmido superenrollado negativamente con Archaeoglobus fulgidus girasa inversa como se describe (18, 19). El número medio de giros superhelicales presentes en los plásmidos de ADN se determinó mediante el recuento de bandas electroforéticas en relación con las moléculas completamente relajadas. Los plásmidos superenrollados positivamente contenían entre 15 y 17 giros superhélicos positivos por molécula ( σ +0,035 a +0,039) y las moléculas de plásmido superenrolladas negativamente contenían cada una ∼15-17 giros superhélicos negativos (σ ∼ −0,035 a –0,039) (18, 19).

Ensayo de relajación del ADN plasmídico mediada por topo I humana

Las reacciones de relajación del ADN en condiciones de procesamiento se llevaron a cabo en volúmenes de reacción de 20 μl en presencia de Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM, MgCl 5 mM 2 y CaCl 5 mM 2. El tampón de almacenamiento de la enzima proporcionó además NaCl 15 mM, glicerol al 2,5%, Tris-HCl 0,25 mM (pH 7,5) y EDTA 0,025 mM a la reacción. La actividad de relajación del ADN en condiciones distributivas se ensayó como se describe para las condiciones de procesamiento, excepto que se suministró NaCl adicional al tampón de reacción, proporcionando una concentración de NaCl correspondiente a la sal óptima de las enzimas individuales como se informó anteriormente [150 mM para HT, 100 mM para HT (Trp205Gly) y HT▵ (191–206), y 75 mM para HT (207–765) (17, 26)]. Cuando se indique, una concentración final de 60 μM CPT disuelta en Me 2 Se añadió SO [concentración final al 10% (v / v)] a las reacciones de relajación del ADN en condiciones de procesamiento. Las reacciones de control sin adición de CPT se suministraron con Me 2 SO [concentración final al 10% (v / v)].

Se incubó un total de 100 fmol de pBR322 con enzima recombinante purificada a 37ºC durante los intervalos de tiempo indicados. Las reacciones se terminaron mediante la adición de SDS hasta una concentración final del 0,2% (p / v). Las muestras se sometieron a digestión proteolítica con 0,5 μg / ml de proteinasa K a 37 ° C durante 30 min antes de la separación de los productos de reacción en un gel de agarosa al 1%. El ADN se visualizó teñiendo el gel con 0,5 µg / ml de bromuro de etidio y los productos de relajación se analizaron utilizando el sistema Bio-Rad Gel Doc-2000.

Dado que los plásmidos superenrollados positivamente se unen al bromuro de etidio de forma menos eficaz que los plásmidos superenrollados negativamente, las concentraciones de ADN se determinaron mediante análisis espectrofotométrico y se confirmaron mediante tinción con bromuro de etidio de plásmidos linealizados con HindIII.

Ensayo de escisión del ADN plasmídico mediada por topo I humana

Las reacciones de escisión del ADN se realizaron incubando 100 fmol de pBR322 superenrollado positiva o negativamente con cada una de las cuatro enzimas en un tampón de reacción que contenía Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM, MgCl 5 mM 2 y CaCl 5 mM 2 . Además, el tampón de almacenamiento enzimático suministró NaCl 15 mM, glicerol al 2,5%, Tris-HCl 0,25 mM (pH 7,5) y EDTA 0,025 mM. Se incubaron reacciones de veinte microlitros a 37ºC durante 2 min y se inactivaron mediante la adición de SDS al 0,2% (p / v). Las muestras se trataron con proteinasa K como se describió anteriormente y se analizaron por separación en un gel de agarosa al 1% que contenía 0,35 µg / ml de bromuro de etidio.

Ensayo de unión a ADN mediada por topo I humana

La unión de ADN no covalente por HT (Tyr723Phe) a ADN plasmídico superenrollado positiva y negativamente se evaluó usando un ensayo de unión por filtro de nitrocelulosa competitivo. La enzima se incubó con 2,5 nM de un sustrato dúplex de ADN sintético 100 mer marcado con 5′ en un volumen de reacción de 20 μl que contenía Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM, MgCl 5 mM 2 y CaCl 5 mM 2 y [NaCl 15 mM, glicerol al 2,5%, Tris-HCl 0,25 mM (pH 7,5) y EDTA 0,025 mM] suministrados por el tampón de almacenamiento de enzima. Las reacciones de unión se llevaron a cabo a 37ºC durante 15 min en ausencia o presencia de cantidades indicadas de plásmido competidor superenrollado positivo o negativo pBR322 que varían de 0 a 20 nM.Se preparó una membrana de nitrocelulosa (Protran, Scleicher & amp Schuell Bioscience) mediante tratamiento con 0,1 μg / ml de ADN de testículo de salmón durante 1 ha temperatura ambiente. Las muestras se aplicaron a la membrana y se filtraron. al vacío . Posteriormente, la membrana se lavó cuatro veces con un tampón que contenía NaCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM MgCl 5 mM 2 y CaCl 5 mM 2 .

La secuencia del sustrato de ADN sintético 100-mer es: Cadena superior: 5′CGA ATT CGC TAT AAT GCC TGC AGG TCG ACT CTA GAG GAT CTA AAA GAC TTA GAA AAA TTT TTG GCT TAA GCA ACA TAT GGT ATC GTC GGA ATT CAA TGA G-3 ′ y hebra inferior: 5′-CTC ATT GAA TTC CGA CGA TAC CAT ATG TTG CTT AAG CCA AAA ATT TTT CTA AGT CTT TTA GAT CCT CTA GAG TCG ACC TGC AGG CAT TAT AGC GAA TTC G-3 ′. La hebra superior del sustrato se marcó radiactivamente en 5 'antes de la hibridación con la hebra inferior aplicando la reacción de polinucleótido quinasa de T4 utilizando [γ-32P] ATP como donante de fosforilo. El ATP sin reaccionar se eliminó mediante diálisis en una columna G-50. Para la hibridación, se mezclaron 10 pmol de la hebra superior y 15 pmol de la hebra inferior, se calentaron a 85ºC y se enfriaron lentamente a temperatura ambiente.

La cantidad relativa de sustrato de ADN radiactivo unido por la enzima se determinó como la cantidad de radiactividad retenida en la membrana usando un modelo SF Molecular Dynamics Phosphorimager y se cuantificó usando el software QuantityOne (BioRad).


Agradecemos al Prof. Vincent Dion por sus comentarios sobre nuestro manuscrito. Agradecemos el apoyo de NVIDIA Corporation en forma de la donación de dos GPU Tesla K40 que se utilizaron para esta investigación. También reconocemos el uso de gnuplot http://www.gnuplot.info/ y POVRay http://www.povray.org/ para la preparación de figuras.

Fundación Nacional Suiza de Ciencias [31003A_166684] Leverhulme Trust [RP2013-K-017]. Oxford University Press ha renunciado al cargo de publicación de acceso abierto para este artículo. NAR Los miembros del Comité Editorial tienen derecho a un artículo gratuito por año en reconocimiento a su trabajo en nombre de la revista.


RESUMEN Y PERSPECTIVAS

Una certeza en el campo de la inestabilidad de repetición de tripletes es la importancia central de la capacidad de los tractos repetidos para formar estructuras secundarias aberrantes como horquillas y dúplex de hebra deslizada. Se cree que estas estructuras secundarias surgen cuando las hebras de ADN se separan, lo que permite que se formen estructuras intracatenarias. Evidentemente, estas estructuras dificultan que la maquinaria de reparación del ADN normal de la célula devuelva la secuencia a su longitud inicial, lo que provoca una inestabilidad sesgada por la expansión en la línea germinal y los tejidos somáticos de los seres humanos. Para los pacientes humanos, las identidades de los procesos críticos que exponen hebras simples para permitir la formación de estructuras aberrantes y de aquellos que manejan mal el problema de la eliminación de estructuras no se conocen con certeza. Ni siquiera está claro si la inestabilidad repetida es el resultado de una vía principal o de múltiples vías distintas o superpuestas.

En esta revisión, nos hemos centrado en la vía inducida por la transcripción para la inestabilidad repetida. Existe amplia evidencia de estudios en sistemas modelo de que la transcripción desestabiliza las repeticiones, y en células humanas, los datos genéticos indican que las funciones normales de MMR y TC-NER estimulan la inestabilidad de las repeticiones. En este punto, sin embargo, no está clara la relevancia de la transcripción para la inestabilidad de repetición triplete observada en la línea germinal humana y los tejidos somáticos. Lo único seguro es que los genes de la enfermedad se transcriben ampliamente, un requisito previo para tal vía. Esta vía también es atractiva porque podría explicar naturalmente la acumulación dependiente de la edad de cambios de longitud de repetición en células diferenciadas terminalmente, como las neuronas, que ya no replican su ADN. Lo que se necesita es un sistema en ratones en el que se pueda inducir la transcripción en la línea germinal o en tejidos específicos. Un sistema inducible de este tipo permitiría evaluar la influencia de la transcripción y probarla en combinación con alteraciones genéticas en genes de reparación probable del ADN.


Razón detrás de la formación de superenrollamientos positivos durante la replicación / transcripción del ADN - Biología

Conferencia 5 20 de septiembre Cromatina y topología cromosómica

Cohesión y condensación cromosómicas

Tanto los complejos de cohesina como de condensina constan de dos proteínas SMC más 3 proteínas adicionales. Las proteínas SMC tienen un dominio ATPasa & quotsplit & quot separado por una espiral larga con bisagras. En la disposición de la cabeza a la cola, forman heterodímeros con dos sitios de ATPasa & quot; compartidos & quot; conectados por una larga bobina en espiral doble con bisagras.

Cohesinas ensamblar en el ADN durante la fase S. Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) Los experimentos muestran que se unen preferentemente a regiones de ADN ricas en AT, como se encuentran en los centrómeros (ver asignación de lectura: artículo de Magee et al.).

Las cohesinas unen a las cromátidas hermanas hasta que se cumplen todas las condiciones previas de la mitosis. Luego, la proteína securina es degradada por el complejo promotor de anafase (APC) de modo que la "separasa" puede degradar una de las proteínas asociadas a SMC (Scc1 en levadura en gemación) y permitir que las hermanas se separen.

Condensina facilita el superenrollamiento del ADN en bucles compactos. El laboratorio de Hirano demostró que las condensinas envuelven el ADN de tal manera que, cuando se agrega la topoisomerasa II, convertirá el ADN circular cerrado en nudos con una topología particular (ver más abajo). La acción de la condensación requiere la acción previa de las cohesinas.

Superenrollamiento y topoisomerasas

El ADN se envuelve y se retuerce. Necesitamos una forma de hablar de esto. El superenrollamiento del ADN ocurre cuando se abren cadenas de ADN o cuando el ADN se envuelve alrededor de un nucleosoma. El anudamiento del ADN por la topoisomerasa es un ejemplo de un cambio en Número de enlace (Lk) que se puede utilizar para describir la topología del ADN.

Giro (Tw) = el número de vueltas / pb x el número total de pb en el ADN cuyos extremos están conectados o atados. Si tiene una molécula de 10400 pb con 10,4 pb / vuelta, LK = 100.

Retorcerse (Wr) = el número de veces que las hebras dobles se cruzan entre sí en el estado cerrado o amarrado. Si el ADN está & quot; enrollado por arriba & quot; habrá superenrollamientos positivos; si el ADN está & quot; enrollado por debajo & quot; habrá superenrollamientos negativos.

Los dos parámetros son "intercambiables": el aumento de la torsión en el ADN se puede transferir para retorcerse. El ADN también puede absorber el estrés al promover la formación de cruciformes entre secuencias repetidas invertidas.

El superenrollamiento se produce delante de la ARN polimerasa (positiva) y detrás (negativa) a medida que desciende por el ADN. Topo I puede encargarse de las superenrollamientos negativos detrás de Topo II o un Topo I que puede manejar superenrollamientos positivos manejará el estrés en el frente.

El número de enlace cambiará en pasos de +1 o -1 por la acción de las topoisomerasas de Tipo I

El número de enlace cambiará en pasos de +2 o -2 por la acción de las topoisomerasas de Tipo II.

La mayoría de las enzimas de tipo I actúan sin energía añadida para "relajar" el superenrollamiento. La enzima bacteriana Topo I solo puede relajar el ADN superenrollado negativamente. El tipo eucariota I relajará el ADN superenrollado tanto positiva como negativamente.

Todas las enzimas de tipo II dependen de ATP. algunos solo pueden crear moléculas superenrolladas más negativamente, otros solo pueden desvincular moléculas de ADN pero no pueden catalizar el superenrollamiento negativo.

Una demostración de que la envoltura proteica del ADN provoca cambios en el superenrollamiento. Unir la proteína al ADN circular. Agregue topo bacteriano I para relajar solo superenrollamientos negativos. Quite la proteína y descubra que la molécula circular ahora está positivamente superenrollada. Este es, en esencia, el ensayo que hizo el laboratorio de Hirano para demostrar que el complejo de condensina envolverá el ADN.

Los nucleosomas ensayados de esta manera muestran aproximadamente 1 superenrollamiento negativo por nucleosoma. Pero esperamos alrededor de 1,5-1,8 en función de la cantidad de ADN envuelto alrededor de cada nucleosoma. La diferencia es que el ADN está ligeramente enrollado en el nucleosoma (es decir, su Twist es más bajo).

146 pb envuelven un octamero de histiones. La disposición de & quot; cuentas en una cuerda & quot es bastante general, como puede verse por digestión de la cromatina total con nucleasa microcócica . La escisión ocurre en las regiones enlazadoras entre nucleosomas.

La regulación del cromain está mediada por acetilación, metilación, fosforilación de las colas N terminales de las histonas H3 y H4 y ubiquitinación de H2B. Más sobre estas modificaciones más adelante.

La histona H1 se une en regiones enlazadoras y juega un papel en la organización de estructuras de cromatina de orden superior.

Disposición de los nucleosomas en el ADN.

La cromatina a granel tiene una disposición de "perlas en una cuerda" como se ve por la digestión con nucleasa microcócica (MNasa). Algunas secuencias de ADN aparentemente "colocan" nucleosomas sobre ciertas regiones (por ejemplo, para más adelante, ADN de Xenopus 5S). Pero en muchas regiones de genes, los nucleosomas no están en posiciones fijas. Por lo tanto, si uno digiere `` ligeramente '' ADN con MNasa o con DNasaI y luego examina un fragmento de restricción específico (¿Cómo harías esto? ), se puede ver que todo el ADN es susceptible a la digestión (aunque hay algunos sitios en el ADN "desnudos" que tienen más probabilidades de ser digeridos que otros. En este caso, hay nucleosomas pero están en posiciones casi aleatorias en una colección de En otros casos, los nucleosomas se `` colocan '' de modo que ocupen la misma posición en casi todas las moléculas. Un ejemplo de este posicionamiento de nucleosomas sobre un gen completo se muestra en el gen de apareamiento silencioso HML por Weiss y Simpson.

Cuando los genes se activan para la transcripción, se producen cambios en la estructura de la cromatina. Un ejemplo es la región promotora de la levadura en ciernes. PHO5 gen, donde las proteínas activadoras de la transcripción y los factores de remodelación de la cromatina fuerzan un cambio en la estructura de la cromatina de modo que los nucleosomas bien posicionados se reorganizan y la región promotora exhibe un conjunto de Sitios hipersensibles a MNase .

Modificaciones de histonas

Histona H4. El extremo N de la histona H4 tiene 4 lisinas (K5, K8, K12, K16) que pueden acetilarse (tenga en cuenta que la acetilación cambia la carga de la cola). La acetilación de algunas posiciones se correlaciona con roles particulares en la replicación y transcripción. De manera similar, hay varios sitios en las colas (y en el "cuerpo" de la histona H3 que se pueden modificar.

Hay anticuerpos específicos que reconocen cada uno de los residuos modificados en H3 y H4, de modo que el estado de la cromatina puede evaluarse mediante inmunofluorescencia indirecta o mediante inmunoprecipitación de cromatina.

Replicación . ¿Cómo se ensamblan las histonas en el ADN recién sintetizado? Esto demuestra ser una pregunta difícil de responder in vivo, pero los experimentos in vitro sugieren que los nucleosomas completos se dividen al azar, con nuevos octámeros de histonas añadidos según sea necesario. Hay al menos dos factores de ensamblaje de cromatina asociados a la replicación: CAF-1 y RCAF. El RCAF en particular parece unirse selectivamente a histonas en las que H4 está acetilado en K5 y K12. CAF-1 se une a PCNA (la proteína de "pinza" de la replicación del ADN.

Hay dos variantes de histona H3 (sin contar Cse4 / Cid / CENP-A): H3 y H3.3 que se diferencian entre sí en solo cuatro aminoácidos. Un trabajo reciente del laboratorio de Hennikof sugiere que tanto H3 como H3.3 se utilizan en el ensamblaje de histonas acopladas a la replicación, pero solo la histona H3.3 se encuentra en el ensamblaje de cromatina independiente de la replicación. H3.3 está especialmente asociado con regiones de ADN que se transcriben. Nota: la levadura en gemación solo tiene un tipo de histona H3 y es similar a H3.3.

Transcripción . Se encuentra que las regiones que se transcriben contienen histona H4-K16-Ac. La cromatina transcripcionalmente inactiva está hipoacetilada. , especialmente en K16, pero en todos los sitios. Regresaremos a este punto más tarde. También hay modificaciones en las histonas H3 y H2. Prácticamente todos los sitios (analizados por ChIP con anticuerpos específicos de acetilación) muestran una pérdida de acetilación cuando los genes están silenciados y son heterocromáticos. Un gen de la histona H4 en la levadura en ciernes en el que las cuatro lisinas se cambian a genes de glutamina o arginina `` silenciosos '' en la levadura en ciernes..

Activación de genes para transcripción implica la regulación de un gran conjunto de histona acetil transferasas (HAT) y histonas desacetilasas (HDAC) que se acoplan a complejos remodeladores de cromatina como ADA, SAGA, SWI / SNF, ISWI y otros. Los conocerá más adelante en las discusiones sobre la regulación transcripcional.

Un ejemplo in vitro. La proteína Swi2 / Snf2 dependiente de ATP en levadura puede remodelar nucleosomas in vitro. Las histonas se unen en una matriz ordenada en el ADN del gen 5S de 208 pb de Xenopus. Una de estas secuencias se ha modificado para tener un sitio de restricción protegido por un nucleosoma. Swi2 / Snf2 + ATP expondrá el sitio de restricción.

Un ejemplo in vivo. Las proteínas de remodelación de la cromatina junto con los activadores de la transcripción de genes específicos causarán la remodelación de la cromatina como se observa en los cambios en la digestión de la cromatina por nucleasa microcócica (MNasa).

Mitosis . La histona H3 se fosforila antes de la mitosis por una quinasa conocida como Aurora o IPL.

Reparación de ADN . La histona H2B es un objetivo de la mono-ubiquitinación que no parece desencadenar la proteólisis, pero definitivamente afecta los procesos de reparación del ADN. Mutaciones como rad6 que se interrumpen en el proceso de ubiquitinación de histonas son sensibles a los rayos UV

La histona H2A también viene en varios "sabores": los principales son H2A y (10% del total) H2AX. La levadura en ciernes tiene solo uno de estos tipos y es similar al H2AX. La levadura en ciernes también tiene H2AZ. Cuando el ADN sufre daños en el ADN, como roturas de doble cadena (DSB), H2AX se fosforila (y se conoce como g -H2AX). Grandes regiones, de un Mb de ancho, se modifican en células de mamíferos (por IF). El por qué aún no está claro porque hasta la fecha solo se han realizado mutaciones knock-out que eliminan por completo el gen H2AX, y lo que se necesita es una modificación que evite que una serina C-terminal sea fosforilada. En la levadura en gemación, la creación de un DSB provoca la formación de g -H2AX en una región de 50 kb de ancho (por ChIP). las mutaciones específicas que cambian la serina diana por alanina tienen sorprendentemente poco efecto sobre la reparación del ADN.

Aparentemente, CAF-1 también es necesario para restaurar las histonas en el ADN después de los eventos de reparación del ADN fuera de la fase S. Esto se infiere de un experimento in vitro muy importante realizado por Gaillard et al. Nuevamente, no es obligatorio.

Junvein y Allis han resumido todos estos cambios en un código de & quothistone & quot Esta no es una lectura estable, pero es una buena información general.

Lectura obligatoria Asignación : Volpe TA, Kidner C, Hall IM, Teng G, Grewal SI, Martienssen RA. Regulación del silenciamiento heterocromático y metilación de lisina-9 de histona H3 por RNAi. Ciencias. 2002297: 1833-7.


Información del autor

Stefano G. Manzo y Stella R. Hartono contribuyeron igualmente a este trabajo.

Afiliaciones

Departamento de Farmacia y Biotecnología, Universidad de Bolonia, Bolonia, Italia

Stefano G. Manzo, Jessica Marinello y Giovanni Capranico

Departamento de Biología Celular y Molecular y Centro del Genoma, Universidad de California, Davis, EE. UU.

Stella R. Hartono, Lionel A. Sanz y Frederic Chedin

Departamento de Ciencias Médicas y Quirúrgicas para Niños y Adultos, Universidad de Modena y Reggio Emilia, Modena, Italia

Sara De Biasi y Andrea Cossarizza

Dirección actual: División de Regulación Genética, Instituto del Cáncer de los Países Bajos, Plesmanlaan 121, 1066 CX, Ámsterdam, Países Bajos


Razón detrás de la formación de superenrollamientos positivos durante la replicación / transcripción del ADN - Biología

Los ácidos nucleicos son necesarios para el almacenamiento y la expresión de información genética. Hay dos tipos de ácidos nucleicos químicamente distintos: ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico ([ARN], ver Capítulo 30). El ADN, el depósito de información genética, está presente no solo en los cromosomas del núcleo de los organismos eucariotas, sino también en las mitocondrias y los cloroplastos de las plantas. Las células procariotas, que carecen de núcleo, tienen un solo cromosoma, pero también pueden contener ADN no cromosómico en forma de plásmidos. La información genética que se encuentra en el ADN se copia y se transmite a las células hijas a través de la replicación del ADN. El ADN contenido en un óvulo fertilizado codifica la información que dirige el desarrollo de un organismo. Este desarrollo puede implicar la producción de miles de millones de células. Cada célula está especializada y expresa solo aquellas funciones que se requieren para que desempeñe su papel en el mantenimiento del organismo. Por lo tanto, el ADN debe ser capaz no solo de replicarse con precisión cada vez que una célula se divide, sino también de que la información que contiene se exprese de forma selectiva. La transcripción (síntesis de ARN) es la primera etapa en la expresión de información genética (ver Capítulo 30). A continuación, se traduce el código contenido en la secuencia de nucleótidos de las moléculas de ARN mensajero (síntesis de proteínas, véase Capítulo 31), completando así la expresión génica. La regulación de la expresión génica se analiza en Capítulo 32.

Figura 29.1 El "dogma central" de la biología molecular.

El flujo de información del ADN al ARN y a la proteína se denomina el "dogma central" de la biología molecular (Figura 29.1) y es descriptivo de todos los organismos, con la excepción de algunos virus que tienen ARN como depósito de su información genética.

Figura 29.2 A. Cadena de ADN con la secuencia de nucleótidos que se muestra escrita en la dirección 5ʹ & rarr3ʹ. Un enlace 3ʹ & rarr5ʹ-fosfodiéster se muestra resaltado en el cuadro azul, y la cadena principal de desoxirribosa-fosfato está sombreada en amarillo. B. La cadena de ADN escrita en una forma más estilizada, enfatizando el esqueleto de desoxirribosa-fosfato. C. Una representación más simple de la secuencia de nucleótidos. D. La representación más simple (y más común), con las abreviaturas de las bases escritas en la dirección convencional 5ʹ & rarr3ʹ.

II. ESTRUCTURA DEL ADN

El ADN es un polímero de desoxirribonucleósidos monofosfatos (dNMP) unidos covalentemente por enlaces 3 & rarr5-fosfodiéster. Con la excepción de unos pocos virus que contienen ADN de una sola hebra (ss), el ADN existe como una molécula de doble hebra (ds), en la que las dos hebras se enrollan entre sí, formando una doble hélice. [Nota: la secuencia de los dNMP enlazados es la estructura primaria, mientras que la doble hélice es la estructura secundaria]. En las células eucariotas, el ADN se encuentra asociado con varios tipos de proteínas (conocidas colectivamente como nucleoproteína) presentes en el núcleo, mientras que en las procariotas, el complejo proteína-ADN está presente en una región no unida a la membrana conocida como nucleoide.

A. Enlaces 3ʹ y rarr5ʹ-fosfodiéster

Los enlaces fosfodiéster unen el grupo 3-hidroxilo de la desoxipentosa de un nucleótido al grupo 5-hidroxilo de la desoxipentosa de un nucleótido adyacente a través de un grupo fosforilo (Figura 29.2). La cadena larga no ramificada resultante tiene polaridad, con un extremo 5 (el extremo con el fosfato libre) y un extremo 3 (el extremo con el hidroxilo libre) que no están unidos a otros nucleótidos. Las bases ubicadas a lo largo de la cadena principal de desoxirribosa-fosfato resultante, por convención, siempre se escriben en secuencia desde el extremo 5 de la cadena hasta el extremo 3. Por ejemplo, la secuencia de bases en el ADN que se muestra en Figura 29.2D (5ʹ-TACG-3ʹ) se lee "timina, adenina, citosina, guanina". Los enlaces fosfodiéster entre nucleótidos pueden hidrolizarse enzimáticamente mediante una familia de nucleasas: desoxirribonucleasas para ADN y ribonucleasas para el ARN, o escindido hidrolíticamente por productos químicos. [Nota: solo el ARN es escindido por álcali.]

Figura 29.3 Doble hélice de ADN, que ilustra algunas de sus principales características estructurales.

B. Doble hélice

En la doble hélice, las dos cadenas se enrollan alrededor de un eje común llamado eje helicoidal. Las cadenas están emparejadas de manera antiparalela (es decir, el extremo 5ʹ de una hebra se empareja con el extremo 3ʹ de la otra hebra) como se muestra en Figura 29.3. En la hélice de ADN, el esqueleto hidrófilo de desoxirribosa-fosfato de cada cadena está en el exterior de la molécula, mientras que las bases hidrófobas se apilan en el interior. La estructura general se asemeja a una escalera retorcida. La relación espacial entre las dos hebras de la hélice crea un surco mayor (ancho) y un surco menor (estrecho). Estos surcos proporcionan acceso para la unión de proteínas reguladoras a sus secuencias de reconocimiento específicas a lo largo de la cadena de ADN. [Nota: Ciertos medicamentos contra el cáncer, como la dactinomicina (actinomicina D), ejercen su efecto citotóxico intercalando en el estrecho surco de la doble hélice del ADN, lo que interfiere con la síntesis de ADN (y ARN).]

1. Maridaje de bases: Las bases de una hebra de ADN se emparejan con las bases de la segunda hebra, de modo que una adenina (A) siempre se empareja con una timina (T) y una citosina (C) siempre se empareja con una guanina (G). [Nota: los pares de bases son perpendiculares al eje helicoidal (ver Figura 29.3).] Por lo tanto, una cadena de polinucleótidos de la doble hélice de ADN es siempre el complemento de la otra. Dada la secuencia de bases en una cadena, se puede determinar la secuencia de bases en la cadena complementaria (Figura 29.4). [Nota: El emparejamiento de bases específico en el ADN conduce a la regla de Chargaff, que establece que en cualquier muestra de dsDNA, la cantidad de A es igual a la cantidad de T, la cantidad de G es igual a la cantidad de C y la cantidad total de purinas es igual a la cantidad total de pirimidinas.] Los pares de bases se mantienen unidos por enlaces de hidrógeno: dos entre A y T y tres entre G y C (Figura 29.5). Estos enlaces de hidrógeno, más las interacciones hidrófobas entre las bases apiladas, estabilizan la estructura de la doble hélice.

2. Separación de las dos hebras de ADN en la doble hélice: Las dos hebras de la doble hélice se separan cuando se rompen los enlaces de hidrógeno entre las bases emparejadas. La alteración puede ocurrir en el laboratorio si se altera el pH de la solución de ADN de modo que las bases de nucleótidos se ionicen, o si la solución se calienta. [Nota: los enlaces fosfodiéster no se rompen con dicho tratamiento]. Cuando se calienta el ADN, la temperatura a la que se pierde la mitad de la estructura helicoidal se define como la temperatura de fusión (Tmetro). La pérdida de estructura helicoidal en el ADN, denominada desnaturalización, se puede controlar midiendo su absorbancia a 260 nm. [Nota: el ssDNA tiene una absorbancia relativa más alta en esta longitud de onda que el dsDNA.] Debido a que hay tres enlaces de hidrógeno entre G y C pero solo dos entre A y T, el ADN que contiene altas concentraciones de A y T se desnaturaliza a una temperatura más baja que ADN rico en G y C (Figura 29.6). En condiciones apropiadas, las hebras de ADN complementarias pueden reformar la doble hélice mediante el proceso llamado renaturalización (o reasociación). [Nota: la separación de las dos cadenas en regiones cortas se produce durante la síntesis de ADN y ARN].

Figura 29.4 Dos secuencias de ADN complementarias. T = timina A = adenina C = citosina G = guanina.

3. Formas estructurales de la doble hélice: Hay tres formas estructurales principales de ADN: la forma B (descrita por Watson y Crick en 1953), la forma A y la forma Z. La forma B es una hélice a la derecha con 10 pares de bases por giro de 360 ​​° (o giro) de la hélice, y con los planos de las bases perpendiculares al eje helicoidal. Se cree que el ADN cromosómico está formado principalmente por ADN-B (Figura 29.7 muestra un modelo de relleno de espacio de B-DNA). La forma A se produce deshidratando moderadamente la forma B. También es una hélice a la derecha, pero hay 11 pares de bases por vuelta, y los planos de los pares de bases están inclinados 20 ° desde la perpendicular al eje helicoidal. La conformación que se encuentra en los híbridos de ADN-ARN o en las regiones bicatenarias de ARN-ARN es probablemente muy cercana a la forma A. Z-DNA es una hélice para zurdos que contiene 12 pares de bases por turno (ver Figura 29.7). [Nota: La cadena principal de desoxirribosa-fosfato "zigzag", de ahí el nombre "Z" -DNA.] Los tramos de Z-DNA pueden ocurrir naturalmente en regiones de ADN que tienen una secuencia de purinas y pirimidinas alternas (por ejemplo, poli GC ). Las transiciones entre las formas helicoidales B y Z de ADN pueden desempeñar un papel en la regulación de la expresión génica.

Figura 29.5 Enlaces de hidrógeno entre bases complementarias.

C. Moléculas de ADN lineales y circulares

Cada cromosoma en el núcleo de un eucariota contiene una molécula lineal larga de dsDNA, que está unida a una mezcla compleja de proteínas (histona y no histona, ver pág. 409) para formar cromatina. Los eucariotas tienen moléculas de dsDNA circulares y cerradas en sus mitocondrias, al igual que los cloroplastos de plantas. Un organismo procariota contiene típicamente una única molécula circular de ADN bicatenario. [Nota: el ADN circular está "superenrollado", es decir, la doble hélice se cruza sobre sí misma una o más veces. El superenrollamiento puede provocar un sobreenrollamiento (superenrollamiento positivo) o un subenrollamiento (superenrollamiento negativo) del ADN. El superenrollamiento, un tipo de estructura terciaria, compacta el ADN.] Cada cromosoma procariota está asociado con proteínas no histonas que ayudan a compactar el ADN para formar un nucleoide. Además, la mayoría de las especies de bacterias también contienen pequeñas moléculas de ADN extracromosómico circulares llamadas plásmidos. El ADN plasmídico transporta información genética y experimenta una replicación que puede estar sincronizada o no con la división cromosómica. [Nota: El uso de plásmidos como vectores en la tecnología de ADN recombinante se describe en Capítulo 33.]

Los plásmidos pueden portar genes que transmiten resistencia a los antibióticos a la bacteria huésped y pueden facilitar la transferencia de información genética de una bacteria a otra.

Figura 29.6 Temperaturas de fusión (Tmetro) de moléculas de ADN con diferentes composiciones de nucleótidos.

III. PASOS EN LA SÍNTESIS DEL ADN PROKARIÓTICO

Cuando las dos hebras de la doble hélice de ADN se separan, cada una puede servir como plantilla para la replicación de una nueva hebra complementaria. Esto produce dos moléculas hijas, cada una de las cuales contiene dos cadenas de ADN con una orientación antiparalela (ver Figura 29.3). Este proceso se denomina replicación semiconservadora porque, aunque el dúplex parental se separa en dos mitades (y, por lo tanto, no se "conserva" como entidad), cada uno de los hilos parentales individuales permanece intacto en uno de los dos nuevos dúplex (Figura 29.8). Las enzimas involucradas en el proceso de replicación del ADN están dirigidas por plantillas. polimerasas que puede sintetizar la secuencia complementaria de cada hebra con extraordinaria fidelidad. Las reacciones descritas en esta sección se conocieron por primera vez a partir de estudios de la bacteria. Escherichia coli (mi. coli), y la descripción que se da a continuación se refiere al proceso en procariotas. La síntesis de ADN en organismos superiores es más compleja pero involucra los mismos tipos de mecanismos. En cualquier caso, el inicio de la replicación del ADN obliga a la célula a continuar el proceso hasta que se haya replicado todo el genoma.

Figura 29.7 Estructuras de B-DNA y Z-DNA.

A. Separación de las dos hebras de ADN complementarias

Para que las dos hebras del dsDNA parental se repliquen, primero deben separarse (o "fundirse") en una región pequeña, porque la polimerasas utilice solo ssDNA como plantilla. En los organismos procariotas, la replicación del ADN comienza en una única secuencia de nucleótidos, un sitio llamado origen de replicación u ori (Figura 29.9A). [Nota: Esta secuencia se conoce como secuencia consenso, porque el orden de los nucleótidos es esencialmente el mismo en cada sitio.] El ori incluye segmentos cortos ricos en AT que facilitan la fusión. En eucariotas, la replicación comienza en múltiples sitios a lo largo de la hélice del ADN (Figura 29.9B). Tener múltiples orígenes de replicación proporciona un mecanismo para replicar rápidamente la gran longitud de las moléculas de ADN eucariotas.

B. Formación de la horquilla de replicación

A medida que las dos hebras se desenrollan y se separan, la síntesis se produce en dos horquillas de replicación que se alejan del origen en direcciones opuestas (bidireccionalmente), generando una burbuja de replicación (ver Figura 29.9). [Nota: El término "horquilla de replicación" se deriva de la estructura en forma de Y en la que los dientes de la horquilla representan las hebras separadas (Figura 29.10).]

1. Proteínas necesarias para la separación de las cadenas de ADN: El inicio de la replicación del ADN requiere el reconocimiento del origen por un grupo de proteínas que forman el complejo de cebado previo. Estas proteínas son responsables de mantener la separación de las hebras parentales y de desenrollar la doble hélice antes del avance de la horquilla de replicación. Estas proteínas incluyen las siguientes.

Figura 29.8 Replicación semiconservativa del ADN. T = timina A = adenina C = citosina G = guanina.

Figura 29.9 Replicación del ADN: orígenes y horquillas de replicación. A. ADN circular procariota pequeño. B. ADN eucariota muy largo.

una. Proteína DnaA: Adn La proteína se une a secuencias de nucleótidos específicas (Adn cajas) dentro del origen de la replicación, haciendo que las regiones ricas en AT cortas, dispuestas en tándem (una tras otra) en el origen se fundan. La fusión depende del trifosfato de adenosina (ATP) y da como resultado la separación de las cadenas con la formación de regiones localizadas de ssDNA.

B. Helicasas de ADN: Estas enzimas se unen al ssDNA cerca de la bifurcación de replicación y luego se mueven hacia la región bicatenaria vecina, obligando a las hebras a separarse (en efecto, desenrollando la doble hélice). Helicases requieren energía proporcionada por ATP (ver Figura 29.10). Desenrollarse en la horquilla de replicación provoca el superenrollamiento en otras regiones de la molécula de ADN. [Nota: DnaB es el principal helicasa de replicación en E. coli. Su unión al ADN requiere DnaC.]

C. Proteína de unión a ADN monocatenario: Esta proteína se une al ssDNA generado por helicasas (ver Figura 29.10). La unión es cooperativa (es decir, la unión de una molécula de proteína de unión monocatenaria [SSB] facilita que moléculas adicionales de proteína SSB se unan estrechamente a la cadena de ADN). Las proteínas SSB no son enzimas, sino que sirven para cambiar el equilibrio entre dsDNA y ssDNA en la dirección de las formas monocatenarias. Estas proteínas no solo mantienen las dos cadenas de ADN separadas en el área del origen de la replicación, proporcionando así la plantilla monocatenaria requerida por polimerasas, pero también protege el ADN de nucleasas que degradan el ssDNA.

Figura 29.10 Proteínas responsables de mantener la separación de las hebras parentales y desenrollar la doble hélice delante de la horquilla de replicación que avanza (). ADP = difosfato de adenosina PI = fosfato inorgánico.

2. Resolviendo el problema de las superenrollamientos: A medida que se separan las dos hebras de la doble hélice, se encuentra un problema, a saber, la aparición de superenrollamientos positivos en la región del ADN delante de la horquilla de replicación como resultado del sobreenrollamiento (Figura 29.11) y superenrollamientos negativos en la región detrás de la horquilla. La acumulación de superenrollamientos positivos interfiere con el desenrollamiento adicional de la doble hélice. [Nota: El superenrollamiento se puede demostrar sujetando firmemente un extremo de un cable telefónico helicoidal mientras se retuerce el otro extremo. Si el cable se retuerce en la dirección de apretar las bobinas, el cable se enrollará alrededor de sí mismo en el espacio para formar superenrollamientos positivos. Si el cable se retuerce en la dirección de aflojar las bobinas, el cable se enrollará a sí mismo en la dirección opuesta para formar superenrollamientos negativos.] Para resolver este problema, existe un grupo de enzimas llamadas Topoisomerasas de ADN, que son responsables de eliminar superenrollamientos en la hélice al escindir transitoriamente una o ambas hebras de ADN.

Figura 29.11 Superenrollamiento positivo resultante de la separación de la cadena de ADN.

una. Topoisomerasas de ADN de tipo I: Estas enzimas escinden reversiblemente una hebra de la doble hélice. Tienen actividades tanto de corte de hebras como de resellado de hebras. No requieren ATP, sino que parecen almacenar la energía del enlace fosfodiéster que escinden, reutilizando la energía para volver a sellar la hebra (Figura 29.12). Cada vez que se crea una "mella" transitoria en una hebra de ADN, la hebra de ADN intacta pasa a través de la rotura antes de volverse a sellar, aliviando ("relajando") los superenrollamientos acumulados. Topoisomerasas tipo I relajar superenrollamientos negativos (es decir, aquellos que contienen menos vueltas de la hélice que el ADN relajado) en E. coli, y superenrollamientos negativos y positivos (es decir, aquellos que contienen menos o más vueltas de la hélice que el ADN relajado) en muchos células procariotas (pero no E. coli) y en células eucariotas.

Figura 29.12 Acción de topoisomerasas de ADN de tipo I.

B. Topoisomerasas de ADN de tipo II: Estas enzimas se unen fuertemente a la doble hélice del ADN y hacen rupturas transitorias en ambas cadenas. Luego, la enzima hace que un segundo tramo de la doble hélice de ADN pase a través de la rotura y, finalmente, vuelva a sellar la rotura (Figura 29.13). Como resultado, tanto los superenrollamientos negativos como los positivos pueden aliviarse mediante este proceso que requiere ATP. ADN girasa, a topoisomerasa tipo II que se encuentra en bacterias y plantas, tiene la propiedad inusual de poder introducir superenrollamientos negativos en el ADN circular utilizando energía de la hidrólisis de ATP. Esto facilita la replicación del ADN porque los superenrollamientos negativos neutralizan los superenrollamientos positivos introducidos durante la apertura de la doble hélice. También ayuda en la separación transitoria de la hebra requerida durante la transcripción (ver pág. 420).

Los agentes anticancerígenos, como las camptotecinas, se dirigen topoisomerasas tipo I, mientras que el etopósido se dirige a humanos topoisomerasas tipo II. Bacteriano ADN girasa es un objetivo único de un grupo de agentes antimicrobianos llamados fluoroquinolonas (por ejemplo, ciprofloxacina).

Figura 29.13 Acción de ADN topoisomerasa tipo II.

Figura 29.14 Síntesis discontinua de ADN.

C. Dirección de la replicación del ADN

los Polimerasas de ADN responsables de copiar las plantillas de ADN sólo son capaces de "leer" las secuencias de nucleótidos parentales en la dirección 3ʹ & rarr5ʹ, y sintetizan las nuevas hebras de ADN sólo en la dirección 5ʹ & rarr3ʹ (antiparalela). Por lo tanto, comenzando con una doble hélice parental, los dos tramos recién sintetizados de cadenas de nucleótidos deben crecer en direcciones opuestas, una en la dirección 5ʹ & rarr3ʹ hacia la horquilla de replicación y otra en la dirección 5ʹ & rarr3ʹ lejos de la horquilla de replicación (Figura 29.14). Esta hazaña se logra mediante un mecanismo ligeramente diferente en cada hebra.

1. Línea principal: La hebra que se copia en la dirección de la horquilla de replicación que avanza se denomina hebra principal y se sintetiza continuamente.

2. Hebra rezagada: La hebra que se copia en la dirección que se aleja de la horquilla de replicación se sintetiza de forma discontinua, con pequeños fragmentos de ADN que se copian cerca de la horquilla de replicación. Estos tramos cortos de ADN discontinuo, denominados fragmentos de Okazaki, finalmente se unen (ligan) para convertirse en una sola hebra continua. La nueva hebra de ADN producida por este mecanismo se denomina hebra rezagada.

Figura 29.15 Uso de un cebador de ARN para iniciar la síntesis de ADN. P = fosfato.

D. cebador de ARN

Polimerasas de ADN no puede iniciar la síntesis de una hebra complementaria de ADN en una plantilla totalmente monocatenaria. Más bien, requieren un cebador de ARN, que es una región corta de doble hebra que consta de bases de ARN emparejadas con la plantilla de ADN, con un grupo hidroxilo libre en el extremo 3ʹ de la hebra de ARN (Figura 29.15). Este grupo hidroxilo sirve como primer aceptor de un desoxinucleótido por acción de un ADN polimerasa. [Nota: recuerde que glucógeno sintasa también requiere una cartilla (ver pág. 126).]

1. Primase: Especifico Polimerasa de ARN, llamado primase (DnaG), sintetiza los tramos cortos de ARN (aproximadamente diez nucleótidos de largo) que son complementarios y antiparalelos a la plantilla de ADN. En el dúplex híbrido resultante, la U (uracilo) en el ARN se empareja con la A en el ADN. Como se muestra en Figura 29.16, estas secuencias cortas de ARN se sintetizan constantemente en la horquilla de replicación de la hebra rezagada, pero solo se requiere una secuencia de ARN en el origen de la replicación en la hebra principal. Los sustratos para este proceso son trifosfatos de ribonucleósido 5ʹ, y el pirofosfato se libera a medida que se añade cada monofosfato de ribonucleósido mediante la formación de un enlace fosfodiéster 3ʹ & rarr5ʹ. [Nota: El cebador de ARN se elimina posteriormente como se describe en la p. 405.]

Figura 29.16 Alargamiento de las hebras anteriores y posteriores. [Nota: no se muestra la abrazadera deslizante de ADN].

2. Primosoma: La suma de primase convierte el complejo de proteínas de cebado previo necesario para la separación de las cadenas de ADN (consulte la pág. 399) en un primosoma. El primosoma produce el cebador de ARN necesario para la síntesis de la cadena principal e inicia la formación del fragmento de Okazaki en la síntesis de la cadena rezagada. Al igual que con la síntesis de ADN, la dirección de síntesis del cebador es 5ʹ & rarr3ʹ.

E. Alargamiento de cadena

Procariota (y eucariota) Polimerasas de ADN (Pols de ADN) alargar una nueva cadena de ADN mediante la adición de desoxirribonucleótidos, uno a la vez, al extremo 3ʹ de la cadena en crecimiento (ver Figura 29.16). La secuencia de nucleótidos que se añaden viene dictada por la secuencia de bases de la hebra molde con la que se emparejan los nucleótidos entrantes.

1. ADN polimerasa III: El alargamiento de la cadena de ADN es catalizado por la enzima multisubunidad, ADN polimerasa III (ADN pol III). Usando el grupo 3ʹ-hidroxilo del cebador de ARN como aceptor del primer desoxirribonucleótido, ADN pol III comienza a agregar nucleótidos a lo largo de la plantilla monocatenaria que especifica la secuencia de bases en la cadena recién sintetizada. ADN pol III es una enzima altamente "procesiva" (es decir, permanece unida a la hebra plantilla a medida que avanza y no se difunde y luego se vuelve a unir antes de agregar cada nuevo nucleótido). La procesividad de ADN pol III es el resultado de que su subunidad & beta forma un anillo que rodea y se mueve a lo largo de la hebra molde del ADN, sirviendo así como una abrazadera deslizante de ADN. [Nota: la formación de la pinza se ve facilitada por un complejo de proteínas, el cargador de pinza y la hidrólisis de ATP.] La nueva hebra crece en la dirección 5ʹ & rarr3ʹ, antiparalela a la hebra parental (ver Figura 29.16). Los sustratos de nucleótidos son trifosfatos de 5ʹ-desoxirribonucleósido. Pirofosfato (PPI) se libera cuando se agrega cada nuevo monofosfato de desoxinucleósido a la cadena en crecimiento (ver Figura 29.15). Hidrólisis de PPI a 2PI significa que se utilizan un total de dos enlaces de alta energía para impulsar la adición de cada desoxinucleótido.

Figura 29.17 La actividad exonucleasa 3ʹ y rarr5ʹ permite que la ADN polimerasa III “Corregir” la cadena de ADN recién sintetizada.

La producción de PPI con posterior hidrólisis a 2PI, como se ve en la replicación del ADN, es un tema común en bioquímica. Retirada del PPI El producto impulsa una reacción en la dirección de avance, haciéndola esencialmente irreversible.

Los cuatro sustratos (trifosfato de desoxiadenosina [dATP], trifosfato de desoxitimidina [dTTP], trifosfato de desoxicitidina [dCTP] y trifosfato de desoxiguanosina [dGTP]) deben estar presentes para que se produzca la elongación del ADN. Si uno de los cuatro escasea, la síntesis de ADN se detiene cuando ese nucleótido se agota.

2. Revisión de ADN recién sintetizado: Es muy importante para la supervivencia de un organismo que la secuencia de nucleótidos del ADN se replique con el menor número de errores posible. La lectura incorrecta de la secuencia de la plantilla podría resultar en mutaciones deletéreas, quizás letales. Para garantizar la fidelidad de la replicación, ADN pol III tiene una actividad de "corrección de pruebas" (& rarr5ʹ exonucleasa, Figura 29.17) además de su & rarr3ʹ polimerasa actividad. A medida que se agrega cada nucleótido a la cadena, ADN pol III verificaciones para asegurarse de que el nucleótido agregado, de hecho, coincida correctamente con su base complementaria en la plantilla. Si no lo es, el & rarr5ʹ exonucleasa actividad elimina el error. [Nota: La enzima requiere un extremo 3ʹ-hidroxi mal emparejado y, por lo tanto, no degrada las secuencias de nucleótidos emparejadas correctamente.] Por ejemplo, si la base de la plantilla es C y la enzima inserta por error una A en lugar de una G en el nueva cadena, la & rarr5ʹ exonucleasa actividad hidrolíticamente elimina el nucleótido fuera de lugar. los & rarr3ʹ polimerasa actividad luego lo reemplaza con el nucleótido correcto que contiene G (ver Figura 29.17). [Nota: la revisión exonucleasa La actividad requiere movimiento en la dirección 3ʹ & rarr5ʹ, no 5ʹ & rarr3ʹ como el polimerasa actividad. Esto se debe a que la escisión debe realizarse en la dirección contraria a la de síntesis.]

F. Escisión de cebadores de ARN y su reemplazo por ADN

ADN pol III continúa sintetizando ADN en la hebra rezagada hasta que se bloquea por la proximidad a un cebador de ARN. Cuando esto ocurre, se escinde el ARN y se llena el espacio con ADN pol I.

15& rarr3ʹ Actividad exonucleasa: Además de tener la & rarr3ʹ polimerasa actividad que sintetiza el ADN y la & rarr5ʹ exonucleasa actividad que corrige la cadena de ADN recién sintetizada como ADN pol III, ADN pol I también tiene un & rarr3ʹ exonucleasa actividad que es capaz de eliminar hidrolíticamente el cebador de ARN. [Nota: estas actividades son exonucleasas porque eliminan nucleótidos del final de la cadena de ADN, en lugar de escindir la cadena internamente como lo hacen los endonucleasas (Figura 29.18).] Primero, ADN pol I localiza el espacio (mella) entre el extremo 3ʹ del ADN recién sintetizado por ADN pol III y el extremo 5ʹ del cebador de ARN adyacente. Próximo, ADN pol Ielimina hidrolíticamente los nucleótidos de ARN "delante" de sí mismo, moviéndose en la dirección 5ʹ y rarr3ʹ (& rarr3ʹ exonucleasa actividad). A medida que elimina el ARN, ADN pol I lo reemplaza con desoxirribonucleótidos, sintetizando ADN en la dirección 5ʹ y rarr3ʹ (& rarr3ʹ polimerasa actividad). A medida que sintetiza el ADN, también "corrige" la nueva cadena utilizando su & rarr5ʹ exonucleasa actividad para eliminar errores. Esta eliminación / síntesis / corrección de pruebas continúa, un nucleótido a la vez, hasta que el cebador de ARN se degrada totalmente y el espacio se llena con ADN (Figura 29.19). [Nota: ADN pol I usa su & rarr3ʹ polimerasa actividad para llenar los huecos generados durante la reparación del ADN (consulte la página 410).]

Figura 29.18 Endonucleasa versus exonucleasa actividad. [Nota: Endonucleasas de restricción (ver pág. 465) escindir ambas hebras.] T = timina A = adenina C = citosina G = guanina.

2. Comparación de 5ʹ& rarr3ʹ y 3ʹ& rarr5ʹ exonucleasas: los & rarr3ʹ exonucleasa actividad de ADN pol I permite el polimerasa, moviendo 5ʹ & rarr3ʹ, para eliminar hidrolíticamente uno o más nucleótidos a la vez del extremo 5ʹ del cebador de ARN de 20 a 30 nucleótidos de longitud. En contraste, el & rarr5ʹ exonucleasa actividad de ADN pol I, al igual que ADN pol II y III, permite estos polimerasas, moviendo 3ʹ y rarr5ʹ, para eliminar hidrolíticamente un nucleótido fuera de lugar a la vez del extremo 3ʹ de una cadena de ADN en crecimiento, aumentando la fidelidad de replicación de manera que el ADN recién replicado tenga un error por 107 nucleótidos.

Figura 29.19 Eliminación del cebador de ARN y llenado de los "huecos" resultantes mediante ADN polimerasa I.

G. ADN ligasa

El enlace fosfodiéster final entre el grupo 5ʹ-fosfato en la cadena de ADN sintetizada por ADN pol III y el grupo 3ʹ-hidroxilo en la cadena formada por ADN pol I es catalizado por ADN ligasa (Figura 29.20). La unión de estos dos tramos de ADN requiere energía, que en la mayoría de los organismos es proporcionada por la escisión de ATP a AMP + PP.I.

H. Terminación

La terminación de la replicación en E. coli está mediada por la unión específica de secuencia de la proteína Tus (sustancia de utilización terminal) a los sitios de terminación de la replicación (sitios ter) en el ADN, deteniendo el movimiento de ADN polimerasa.

Figura 29.20 Formación de un enlace fosfodiéster por ADN ligasa. [Nota: AMP se vincula primero a ligasa, luego al 5ʹ de fosfato, y luego se libera.]

IV. REPLICACIÓN DEL ADN EUCARIÓTICO

El proceso de replicación del ADN eucariótico sigue de cerca al de la síntesis de ADN procariótico. Ya se han observado algunas diferencias, como los orígenes múltiples de replicación en células eucariotas frente a los orígenes únicos de replicación en procariotas. Proteínas de unión a ADN monocatenarias eucariotas y dependientes de ATP Helicasas de ADN Se han identificado, cuyas funciones son análogas a las de las enzimas procarióticas discutidas anteriormente. Por el contrario, los cebadores de ARN se eliminan mediante ARNasa H y colgajo endonucleasa-1 (FEN1) en lugar de por un ADN polimerasa (Figura 29.21).

A. Ciclo celular eucariota

Los eventos que rodean la replicación del ADN eucariota y la división celular (mitosis) se coordinan para producir el ciclo celular (Figura 29.22). El período que precede a la replicación se llama G1 fase (Gap 1). La replicación del ADN ocurre durante la fase S (síntesis). Después de la síntesis de ADN, hay otro período (G2 fase, o Gap 2) antes de la mitosis (M). Se dice que las células que han dejado de dividirse, como los linfocitos T maduros, han salido del ciclo celular hacia el G0 fase. Estas células inactivas pueden estimularse para volver a entrar en el G1 fase para reanudar la división. [Nota: El ciclo celular se controla en una serie de "puntos de control" que impiden la entrada a la siguiente fase del ciclo hasta que se complete la fase anterior. Dos clases clave de proteínas que controlan el progreso de una célula a través del ciclo celular son las ciclinas y quinasas dependientes de ciclina (Cdks).]

Figura 29.21 Proteínas y su función en la replicación eucariota. ORC = complejo de reconocimiento de origen, MCM = mantenimiento de minicromosomas (complejo), RPA = proteína de replicación A, PCNA = antígeno nuclear de células en proliferación.

B. ADN polimerasas eucariotas

Al menos cinco eucariotas de alta fidelidad Polimerasas de ADN (pol) se han identificado y categorizado sobre la base del peso molecular, la ubicación celular, la sensibilidad a los inhibidores y las plantillas o sustratos sobre los que actúan. Se designan con letras griegas en lugar de números romanos (Figura 29.23).

1. Pol &alfa: Pol & alpha es una enzima multisubunidad. Una subunidad tiene primase actividad, que inicia la síntesis de la hebra en la hebra principal y al comienzo de cada fragmento de Okazaki en la hebra rezagada. los primase subunidad sintetiza un cebador de ARN corto que se extiende por el & rarr3ʹ polimerasa actividad de pol & alpha, generando una pequeña porción de ADN. [Nota: Pol & alpha también se conoce como pol &alfa/ primase.]

2. Pol y épsilon y pol D: Pol y épsilon se recluta para completar la síntesis de ADN en la cadena principal, mientras que pol d alarga los fragmentos de Okazaki de la hebra rezagada, cada uno usando & rarr5ʹ exonucleasa actividad para corregir el ADN recién sintetizado. [Nota: Pol de ADN & epsilon se asocia con el antígeno nuclear celular proliferante (PCNA), una proteína que sirve como una abrazadera deslizante de ADN de la misma manera que la subunidad & beta de ADN pol III hace en E. coli, lo que garantiza una alta procesividad.]

3. Pol &beta y pol &gama: Pol &beta participa en el "llenado de huecos" en la reparación del ADN (ver más abajo). Pol & gamma replica el ADN mitocondrial.

Figura 29.22 El ciclo celular eucariota. [Nota: las células pueden salir del ciclo celular y entrar en un estado de reposo reversible llamado G0.]

Figura 29.23 Actividades del ADN eucariota polimerasa (pol) *3ʹ y rarr5ʹ exonucleasa actividad.

C. Telómeros

Los telómeros son complejos de ADN no codificante más proteínas (conocidas colectivamente como refugio) ubicados en los extremos de los cromosomas lineales. Mantienen la integridad estructural del cromosoma, evitando el ataque de nucleasasy permitir que los sistemas de reparación distingan un final verdadero de una ruptura en el ADN bicatenario. En los seres humanos, el ADN telomérico consta de varios miles de repeticiones en tándem de una secuencia hexamérica no codificante, AGGGTT, con pares de bases en una región complementaria de Cs y As. La hebra rica en GT es más larga que su complemento CA, dejando ssDNA de unos pocos cientos de nucleótidos de longitud en el extremo 3ʹ. Se cree que la región monocatenaria se pliega sobre sí misma, formando una estructura de bucle que es estabilizada por proteínas.

1. Acortamiento de telómeros: Las células eucariotas se enfrentan a un problema especial al replicar los extremos de sus moléculas de ADN lineales. Después de la eliminación del cebador de ARN del extremo 5ʹ de la hebra rezagada, no hay forma de llenar el espacio restante con ADN. En consecuencia, en la mayoría de las células somáticas humanas normales, los telómeros se acortan con cada división celular sucesiva. Una vez que los telómeros se acortan más allá de una longitud crítica, la célula ya no puede dividirse y se dice que es senescente. En las células germinales y otras células madre, así como en las células cancerosas, los telómeros no se acortan y las células no envejecen. Este es el resultado de la presencia de una ribonucleoproteína, telomerasa, que mantiene la longitud telomérica en estas células.

2. Telomerasa: Este complejo contiene una proteína (Tert) que actúa como la transcriptasa inversa y una pequeña pieza de ARN (Terc) que actúa como plantilla. Los pares de bases de la plantilla de ARN rico en CA con el extremo 3ʹ monocatenario rico en GT del ADN telomérico (Figura 29.24). los la transcriptasa inversa utiliza la plantilla de ARN para sintetizar ADN en la dirección habitual 5ʹ & rarr3ʹ, extendiendo el ya más largo extremo 3ʹ. Telomerasa luego se traslada al extremo recién sintetizado y el proceso se repite. Una vez que se ha alargado la hebra rica en GT, primase actividad de Pol de ADN & alpha puede usarlo como plantilla para sintetizar un cebador de ARN. El cebador de ARN se extiende por Pol de ADN & alpha, y luego eliminado.

Los telómeros pueden verse como relojes mitóticos en el sentido de que su longitud en la mayoría de las células está inversamente relacionada con el número de veces que las células se han dividido. El estudio de los telómeros proporciona información sobre la biología del envejecimiento y el cáncer.

Figura 29.24 Mecanismo de acción de telomerasa. T = timina A = adenina C = citosina G = guanina pol = polimerasa.

D. Transcriptasas inversas

Como se ve con telomerasa, transcriptasas inversas están dirigidos por ARN Polimerasas de ADN. A la transcriptasa inversa participa en la replicación de retrovirus, como el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Estos virus llevan su genoma en forma de moléculas de ssRNA. Después de la infección de una célula huésped, la enzima viral la transcriptasa inversa utiliza el ARN viral como plantilla para la síntesis 5ʹ & rarr3ʹ del ADN viral, que luego se integra en los cromosomas del hospedador. La transcriptasa inversa También se observa actividad con los transposones, elementos del ADN que pueden moverse por el genoma (ver pág. 461). En eucariotas, tales elementos se transcriben a ARN, el ARN se utiliza como plantilla para la síntesis de ADN por un la transcriptasa inversa codificado por el transposón, y el ADN se inserta aleatoriamente en el genoma. [Nota: los transposones que involucran un intermedio de ARN se denominan retrotransposones o retroposones].

E. Inhibición de la síntesis de ADN por análogos de nucleósidos

El crecimiento de la cadena de ADN puede bloquearse mediante la incorporación de ciertos análogos de nucleósidos que se han modificado en la porción de azúcar (Figura 29.25). Por ejemplo, la eliminación del grupo hidroxilo del carbono 3ʹ del anillo de desoxirribosa como en 2ʹ, 3ʹ-didesoxiinosina ([ddI] también conocida como didanosina), o la conversión de la desoxirribosa en otro azúcar, como arabinosa, previene la cadena adicional alargamiento. Al bloquear la replicación del ADN, estos compuestos ralentizan la división de células y virus de rápido crecimiento. El arabinósido de citosina (citarabina o araC) se ha utilizado en la quimioterapia contra el cáncer, mientras que el arabinósido de adenina (vidarabina o araA) es un agente antivírico. La sustitución del resto de azúcar, como se observa en la zidovudina (AZT, ZDV), también termina el alargamiento de la cadena de ADN. [Nota: estos medicamentos generalmente se suministran como nucleósidos, que luego se convierten en nucleótidos activos por quinasas.

Figura 29.25 Ejemplos de análogos de nucleósidos que carecen de un grupo 3ʹ-hidroxilo. [Nota: ddI se convierte a su forma activa (ddATP).]

V. ORGANIZACIÓN DEL ADN EUCARIÓTICO

Una célula humana típica (diploide) contiene 46 cromosomas, ¡cuyo ADN total mide aproximadamente 2 m de largo! Es difícil imaginar cómo una cantidad tan grande de material genético puede empaquetarse de manera efectiva en un volumen del tamaño de un núcleo celular para que pueda replicarse de manera eficiente y expresar su información genética. Para hacerlo, se requiere la interacción del ADN con una gran cantidad de proteínas, cada una de las cuales realiza una función específica en el empaquetado ordenado de estas largas moléculas de ADN. El ADN eucariota está asociado con proteínas básicas fuertemente unidas, llamadas histonas. Estos sirven para ordenar el ADN en unidades estructurales fundamentales, llamadas nucleosomas, que se asemejan a cuentas en una cuerda. Los nucleosomas se organizan además en estructuras cada vez más complejas que organizan y condensan las moléculas de ADN largas en cromosomas que pueden segregarse durante la división celular. [Nota: el complejo de ADN y proteína que se encuentra dentro de los núcleos de las células eucariotas se llama cromatina].

A. Histonas y formación de nucleosomas

Hay cinco clases de histonas, denominadas H1, H2A, H2B, H3 y H4. Estas pequeñas proteínas conservadas evolutivamente están cargadas positivamente a pH fisiológico como resultado de su alto contenido de lisina y arginina. Debido a su carga positiva, forman enlaces iónicos con ADN cargado negativamente. Las histonas, junto con iones como Mg 2+, ayudan a neutralizar los grupos fosfato de ADN cargados negativamente.

1. Nucleosomas: Dos moléculas de H2A, H2B, H3 y H4 forman el núcleo octamérico de las “perlas” de nucleosoma individuales. Alrededor de este núcleo estructural, un segmento de dsDNA se enrolla casi dos veces, lo que provoca el superenrollamiento (Figura 29.26). [Nota: Los extremos N-terminales de estas histonas pueden acetilarse, metilarse o fosforilarse. Estas modificaciones covalentes reversibles influyen en la fuerza con la que las histonas se unen al ADN, lo que afecta la expresión de genes específicos (ver pág. 422). La modificación de histonas es un ejemplo de "epigenética" o cambios hereditarios en la expresión génica sin alteración de la secuencia de nucleótidos.] Los nucleosomas vecinos están unidos por un "enlazador" de ADN de aproximadamente 50 pares de bases de largo. H1, de la cual hay varias especies relacionadas, no se encuentra en el núcleo del nucleosoma, sino que se une a la cadena de ADN enlazadora entre las perlas del nucleosoma. H1 es la histona más específica de tejido y de especie. Facilita el empaquetado de nucleosomas en estructuras más compactas.

Figura 29.26 Organización del ADN humano, que ilustra la estructura de los nucleosomas. H = histona.

Figura 29.27 Organización estructural del ADN eucariota. [Nota: una compactación de 10 4 se ve desde para .] H = histona.

2. Niveles superiores de organización: Los nucleosomas se pueden empaquetar de manera más compacta para formar un polinucleosoma (también llamado nucleofilamento).Esta estructura adopta la forma de una bobina, a menudo denominada fibra de 30 nm. La fibra está organizada en bucles que están anclados por un andamio nuclear que contiene varias proteínas. Niveles adicionales de organización conducen a la estructura cromosómica final (Figura 29.27).

B. Destino de los nucleosomas durante la replicación del ADN

Los nucleosomas parentales se desmontan para permitir el acceso al ADN durante la replicación. Una vez que se sintetiza el ADN, los nucleosomas se forman rápidamente. Sus proteínas histonas provienen tanto de una nueva síntesis como de la transferencia de octámeros de histonas parentales intactos.

VI. REPARACION DE ADN

A pesar del elaborado sistema de corrección de pruebas empleado durante la síntesis de ADN, pueden producirse errores (incluido el emparejamiento incorrecto de bases o la inserción de uno a unos pocos nucleótidos adicionales). Además, el ADN está constantemente sometido a agresiones ambientales que provocan la alteración o eliminación de bases de nucleótidos. Los agentes dañinos pueden ser productos químicos (por ejemplo, ácido nitroso, que puede desaminar bases) o radiación (por ejemplo, luz ultravioleta no ionizante, que puede fusionar dos pirimidinas adyacentes entre sí en el ADN, y radiación ionizante de alta energía). radiación, que puede causar roturas de doble hebra). Las bases también se alteran o se pierden espontáneamente del ADN de los mamíferos a una velocidad de muchos miles por célula por día. Si el daño no se repara, se introduce un cambio permanente (mutación) que puede resultar en una serie de efectos deletéreos, incluida la pérdida de control sobre la proliferación de la célula mutada, que conduce al cáncer. Afortunadamente, las células son muy eficientes para reparar el daño causado a su ADN. La mayoría de los sistemas de reparación implican el reconocimiento del daño (lesión) en el ADN, la eliminación o escisión del daño, el reemplazo o el llenado del espacio dejado por la escisión utilizando la hebra hermana como plantilla para la síntesis de ADN y la ligadura. Estos sistemas de reparación por escisión eliminan de uno a decenas de nucleótidos. [Nota: la síntesis de reparación de ADN puede ocurrir fuera de la fase S].

Figura 29.28 Reparación de desajustes dirigida por metilo en mi. coli. [Nota: Las proteínas Mut, S y L, reconocen el desajuste e identifican la hebra parental (metilada), y Mut H escinde la hebra hija.] A = adenina C = citosina G = guanina T = timina.

A. Reparación de bases incompatibles (reparación de incompatibilidades)

A veces, los errores de replicación escapan a la función de corrección de pruebas durante la síntesis de ADN, lo que provoca un desajuste de una a varias bases. En E. coli, la reparación de errores de apareamiento (MMR) está mediada por un grupo de proteínas conocidas como proteínas Mut (Figura 29.28). Las proteínas homólogas están presentes en los seres humanos. [Nota: MMR reduce la tasa de error de replicación de uno en diez millones a uno en mil millones].

1. Identificación de la hebra no coincidente: Cuando se produce un desajuste, las proteínas Mut que identifican el nucleótido o los nucleótidos incorrectamente emparejados deben poder discriminar entre la hebra correcta y la hebra con el apareamiento incorrecto. La discriminación se basa en el grado de metilación. Las secuencias de GATC, que se encuentran aproximadamente una vez cada mil nucleótidos, están metiladas en el residuo de adenina (A). Esta metilación no se realiza inmediatamente después de la síntesis, por lo que el ADN recién sintetizado se hemimetila (es decir, la hebra parental está metilada, pero la hebra hija no). Se supone que la hebra parental metilada es correcta y es la hebra hija la que se repara. [Nota: Aún no se conoce el mecanismo exacto por el cual se identifica la hebra hija en eucariotas.]

2. Reparación de ADN dañado: Cuando se identifica la hebra que contiene el desajuste, un endonucleasa corta la hebra, y los nucleótidos no coincidentes son eliminados por un exonucleasa. También se eliminan los nucleótidos adicionales en los extremos 5ʹ y 3ʹ del emparejamiento incorrecto. El espacio dejado por la eliminación de los nucleótidos se llena, utilizando la hebra hermana como plantilla, por un ADN polimerasa, típicamente ADN pol I. El 3ʹ-hidroxilo del ADN recién sintetizado se une al 5ʹ-fosfato del tramo restante de la cadena de ADN original mediante ADN ligasa (ver pág.406).

La mutación de las proteínas implicadas en la reparación de errores de apareamiento en humanos se asocia con el cáncer colorrectal hereditario sin poliposis (HNPCC), también conocido como síndrome de Lynch. Con HNPCC, existe un mayor riesgo de desarrollar cáncer de colon (así como otros cánceres); sin embargo, solo alrededor del 5% de todos los cánceres de colon son el resultado de mutaciones en la reparación de desajustes.

B. Reparación del daño causado por la luz ultravioleta (reparación por escisión de nucleótidos)

La exposición de una célula a la luz ultravioleta (UV) puede resultar en la unión covalente de dos pirimidinas adyacentes (generalmente timinas), produciendo un dímero. Estos dímeros de timina previenen Pol de ADN de replicar la cadena de ADN más allá del sitio de formación del dímero. Los dímeros de timina son escindidos en bacterias por proteínas UvrABC en un proceso conocido como reparación por escisión de nucleótidos (NER) como se ilustra en Figura 29.29. En los seres humanos está presente una vía relacionada (ver más abajo).

1. Reconocimiento y escisión de dímeros por endonucleasa específica de UV: Primero un Endonucleasa específica de UV (llamado excinucleasa de uvrABC) reconoce el dímero y escinde la hebra dañada tanto en el lado 5ʹ como en el lado 3ʹ del dímero. Se libera un oligonucleótido corto que contiene el dímero, dejando un espacio en la cadena de ADN que antes contenía el dímero. Este espacio se llena con un ADN polimerasa y ADN ligasa.

2. Radiación ultravioleta y cáncer: Los dímeros de pirimidina se pueden formar en las células de la piel de los seres humanos expuestos a la luz solar sin filtrar. En la rara enfermedad genética xeroderma pigmentosum (XP), las células no pueden reparar el ADN dañado, lo que da como resultado una gran acumulación de mutaciones y, en consecuencia, numerosos cánceres de piel tempranos (Figura 29.30). La XP puede ser causada por defectos en cualquiera de los varios genes que codifican las proteínas XP necesarias para la reparación por escisión de nucleótidos del daño UV en humanos.

Figura 29.29 Reparación por escisión de nucleótidos de dímeros de pirimidina en mi. coli ADN. UV = ultravioleta.

C. Reparación de alteraciones de la base (reparación por escisión de la base)

Las bases del ADN se pueden alterar, ya sea de forma espontánea, como es el caso de la citosina, que se desamina lentamente (la pérdida de su grupo amino) para formar uracilo, o por la acción de compuestos desaminantes o alquilantes. Por ejemplo, el ácido nitroso, que es formado por la célula a partir de precursores como las nitrosaminas, nitritos y nitratos, es un compuesto potente que desamina la citosina, la adenina (a hipoxantina) y la guanina (a xantina). Las bases también se pueden perder espontáneamente. Por ejemplo, aproximadamente 10,000 bases de purina se pierden de esta manera por célula por día. Las lesiones que involucran alteraciones o pérdida de la base pueden corregirse mediante la reparación por escisión de la base ([BER] Figura 29.31).

1. Eliminación de bases anormales: En la BER, las bases anormales, como el uracilo, que pueden aparecer en el ADN por desaminación de la citosina o por el uso inadecuado de dUTP en lugar de dTTP durante la síntesis de ADN, se reconocen por glicosilasas que los escinden hidrolíticamente de la cadena principal de desoxirribosa-fosfato de la hebra. Esto deja un sitio apirimidínico (o apurínico, si se eliminó una purina), ambos denominados sitios AP.

2. Reconocimiento y reparación de un sitio AP: Específico AP-endonucleasas reconocer que falta una base e iniciar el proceso de escisión y llenado de huecos haciendo un corte endonucleolítico justo en el lado 5ʹ del sitio AP. A desoxirribosa fosfato liasa elimina el residuo de fosfato de azúcar único, libre de bases. ADN polimerasa y ADN ligasa completar el proceso de reparación.

Figura 29.30 Paciente con xeroderma pigmentoso.

D. Reparación de roturas de doble hebra

La radiación ionizante o los radicales libres oxidativos (ver pág. 148) pueden causar roturas de doble hebra en el ADN que son potencialmente letales para la célula. Tales rupturas también ocurren naturalmente durante los reordenamientos de genes. Las roturas del dsDNA no se pueden corregir mediante la estrategia descrita anteriormente de extirpar el daño en una hebra y usar la hebra restante como plantilla para reemplazar el nucleótido o los nucleótidos faltantes. En cambio, son reparados por uno de dos sistemas. La primera es la unión de extremos no homólogos (NHEJ), en la que un grupo de proteínas media en el reconocimiento, procesamiento y ligación de los extremos de dos fragmentos de ADN. Sin embargo, algo de ADN se pierde en el proceso. En consecuencia, este mecanismo de reparación es propenso a errores y mutagénico. Los defectos en este sistema de reparación están asociados con una predisposición al cáncer y a síndromes de inmunodeficiencia. El segundo sistema de reparación, la recombinación homóloga (HR), utiliza las enzimas que normalmente realizan la recombinación genética entre cromosomas homólogos durante la meiosis. Este sistema es mucho menos propenso a errores que el NHEJ porque cualquier ADN que se haya perdido se reemplaza utilizando ADN homólogo como plantilla. [Nota: las mutaciones en las proteínas, BRCA1 o 2 (cáncer de mama 1 o 2), que están involucradas en la HR, aumentan el riesgo de desarrollar cáncer de mama.]

Figura 29.31 Corrección de alteraciones de la base mediante reparación por escisión de la base. T = timina A = adenina C = citosina G = guanina PPI = pirofosfato.

VII. RESUMEN DEL CAPÍTULO

El ADN es un polímero de desoxirribonucleósidos monofosfatos unidos covalentemente por & rarrEnlaces 5ʹ-fosfodiéster (Figura 29.32). La cadena larga y no ramificada resultante ha polaridad, con un extremo de 5ʹ y un extremo de 3ʹ. La secuencia de nucleótidos se lee 5ʹ & rarr3ʹ. El ADN existe como doble cadena molécula, en la que las dos cadenas se emparejan en una antiparalelo manera, y se enrollan uno alrededor del otro, formando un doble hélice. Adenina pares con timina, y citosina pares con guanina. Cada hebra de la doble hélice sirve como plantilla para construir un complementario el hilo de la hijareplicación semiconservativa). La replicación del ADN ocurre en el Fase S del ciclo celular y comienza en el origen de replicación. A medida que las dos hebras se desenrollan y se separan, la síntesis se produce en dos horquillas de replicación que se alejan del origen en direcciones opuestas (bidireccionalmente). Helicasa desenrolla la doble hélice. Como las dos hebras de la doble hélice se separan, superenrollamientos positivos se producen en la región del ADN por delante de la horquilla de replicación y superenrollamientos negativos detrás de la horquilla. ADN topoisomerasas tipos I y IIeliminar superenrollamientos. Polimerasas de ADN (pol) sintetizar nortenuevas hebras de ADN sólo en el & rarr dirección. Por lo tanto, uno de los tramos recién sintetizados de cadenas de nucleótidos debe crecer en la dirección 5ʹ & rarr3ʹ hacia la horquilla de replicación (filamento principal) y uno en la dirección 5ʹ & rarr3ʹ lejos de la horquilla de replicación (hebra rezagada). Pols de ADN requiere un cebador. El cebador para la síntesis de ADN de novo es un tramo corto de ARN sintetizado por primase. La hebra principal solo necesita un cebador de ARN, mientras que la hebra rezagada necesita muchos. En E. coli, el alargamiento de la cadena de ADN es catalizado por ADN pol III, utilizando Trifosfatos de 5ʹ-desoxirribonucleósido como sustratos. La enzima "Correcciones" el ADN recién sintetizado, eliminando los nucleótidos desemparejados terminales con su Exonucleasa 3ʹ y rarr5ʹ actividad. Los cebadores de ARN se eliminan mediante ADN pol I, usando su & rarr3ʹ exonucleasa actividad. Esta enzima llena los vacíos con ADN, corrigiendo pruebas a medida que sintetiza. El enlace fosfodiéster final es catalizado por ADN ligasa. Hay al menos cinco de alta fidelidad eucariota Polimerasas de ADN. Pol &alfa es una enzima multisubunidad, una subunidad de la cual es una primase. Pol y alpha Polimerasa 5ʹ y rarr3ʹ La actividad agrega una pequeña porción de ADN al cebador de ARN. Pol mi completa la síntesis de ADN en la cadena principal, mientras que pol d alarga cada fragmento de hebra rezagada. Pol y betaestá involucrado con la reparación del ADN, y pol &gama replica el ADN mitocondrial. Pols mi, D, y gramo usar Exonucleasa 3ʹ y rarr5ʹ actividad para corregir. Análogos de nucleósidos que contienen azúcares modificados se pueden utilizar para bloquear el crecimiento de la cadena de ADN. Son útiles en quimioterapia anticancerosa y antiviral. Telómeros son tramos de ADN altamente repetitivo complejado con proteínas que protegen el termina de cromosomas lineales. A medida que la mayoría de las células se dividen y envejecen, estas secuencias se acortan, lo que contribuye a la senescencia. En células que no envejecen (por ejemplo, células de línea germinal y cancerosas), telomerasa emplea su componente enzimático la transcriptasa inversa para extender los telómeros, usando su ARN como un plantilla. Hay cinco clases de histona cargada positivamente (H) proteinas. Dos de cada una de las histonas H2A, H2B, H3 y H4 forman un núcleo estructural octamérico alrededor del cual se envuelve el ADN creando un nucleosoma. El ADN que conecta los nucleosomas, llamado ADN enlazador, está vinculado a H1. Los nucleosomas se pueden empaquetar de manera más compacta para formar un nucleofilamento. Los niveles adicionales de organización crean un cromosoma. La mayoría de los daños en el ADN se pueden corregir mediante reparación de escisión que implica el reconocimiento y la eliminación del daño mediante proteínas de reparación, seguido de la sustitución en E. coli por Pol de ADN y unirse por ligasa. Luz ultravioleta puede causar dímeros de timina que son reconocidos y eliminados por Proteínas uvrABC de reparación por escisión de nucleótidos. Defectos en el Proteínas XP necesarios para la reparación del dímero de timina en humanos dan como resultado xeroderma pigmentoso. No coincidente Las bases son reparadas por un proceso similar de reconocimiento y remoción por Mut proteínas en E. coli. La extensión de metilación se utiliza para la identificación de cadenas en procariotas. La reparación de desajustes defectuosos por proteínas homólogas en humanos se asocia con cáncer colorrectal hereditario sin poliposis. Las bases anormales (como el uracilo) se eliminan mediante glicosilasas en reparación de escisión de base, y se corta el fosfato de azúcar en el sitio apirimidínico o apurínico (AP). Las roturas de doble hebra en el ADN se reparan mediante unión final no homóloga (propenso a errores) y recombinación homóloga.

Figura 29.32 Mapa conceptual clave para la estructura, replicación y reparación del ADN. Mapa conceptual clave para la estructura, replicación y reparación del ADN. NHEJ = unión de extremos no homóloga HR = recombinación homóloga NER = reparación por escisión de nucleótidos MMR = reparación de desajustes BER = reparación por escisión de bases UV = luz ultravioleta.

Preguntas de estudio

Elija la mejor respuesta.

29.1 Los padres llevan a una niña de 10 años al dermatólogo. Tiene muchas pecas en la cara, el cuello, los brazos y las manos, y los padres informan que es inusualmente sensible a la luz solar. En su rostro se identifican dos carcinomas de células basales. Según el cuadro clínico, ¿cuál de los siguientes procesos es más probable que sea defectuoso en este paciente?

A. Reparación de roturas de doble hebra por recombinación homóloga propensa a errores

B. Eliminación de bases mal emparejadas del extremo 3ʹ de los fragmentos de Okazaki mediante un proceso dirigido por metilo

C. Eliminación de dímeros de pirimidina del ADN mediante reparación por escisión de nucleótidos

D. Eliminación de uracilo del ADN mediante reparación por escisión de bases

Respuesta correcta = C. La sensibilidad a la luz solar, las pecas extensas en las partes del cuerpo expuestas al sol y la presencia de cáncer de piel a una edad temprana indican que el paciente probablemente sufre de xeroderma pigmentoso (XP). Estos pacientes son deficientes en cualquiera de las proteínas XP necesarias para la reparación por escisión de nucleótidos de los dímeros de pirimidina en el ADN dañado por la luz ultravioleta. Las roturas de doble hebra se reparan mediante unión de extremos no homóloga (propensa a errores) o recombinación homóloga (libre de errores). La metilación no se usa para la discriminación de cadenas en la reparación de errores de apareamiento eucariotas. El uracilo se elimina de las moléculas de ADN mediante una glicosilasa específica en la reparación por escisión de bases, pero un defecto aquí no causa XP.

29.2 Los telómeros son complejos de ADN y proteínas que protegen los extremos de los cromosomas lineales. En la mayoría de las células somáticas humanas normales, los telómeros se acortan con cada división. En las células madre y en las células cancerosas, sin embargo, se mantiene la longitud telomérica. En la síntesis de telómeros:

A. telomerasa, una ribonucleoproteína, proporciona tanto el ARN como la proteína necesarios para la síntesis.

B. el ARN de la telomerasa sirve como cebador.

C. el ARN de la telomerasa es una ribozima.

D. la proteína de la telomerasa es una ADN polimerasa dirigida por ADN.

E. se extiende la hebra más corta de 3ʹ & rarr5ʹ.

F. la dirección de síntesis es 3ʹ & rarr5ʹ.

Respuesta correcta = A. La telomerasa es una partícula de ribonucleoproteína necesaria para el mantenimiento de los telómeros. La telomerasa contiene un ARN que sirve como molde, no como cebador, para la síntesis de ADN telomérico por la transcriptasa inversa de la telomerasa. El ARN telomérico no tiene actividad catalítica. Como transcriptasa inversa, la telomerasa sintetiza ADN utilizando su plantilla de ARN y, por lo tanto, lo es una ADN polimerasa dirigida por ARN. La dirección de síntesis, como con toda la síntesis de ADN, es 5ʹ & rarr3ʹ, y es el extremo 3ʹ de la ya más larga cadena 5ʹ & rarr3ʹ el que se extiende.

29.3 Al estudiar la estructura de un pequeño gen que se secuenció durante el Proyecto Genoma Humano, un investigador observa que una hebra de la molécula de ADN contiene 20 As, 25 G, 30 C y 22 Ts. ¿Cuántas de cada base se encuentran en la molécula de doble hebra completa?

A. A = 40, G = 50, C = 60, T = 44

B. A = 44, G = 60, C = 50, T = 40

C. A = 45, G = 45, C = 52, T = 52

D. A = 50, G = 47, C = 50, T = 47

E. A = 42, G = 55, C = 55, T = 42

Respuesta correcta = E. Las dos cadenas de ADN son complementarias entre sí, con la base A emparejada con T y la base G emparejada con C. Entonces, por ejemplo, las 20 As en la primera cadena se emparejarían con 20 Ts en la En la segunda hebra, las 25 G de la primera hebra se emparejarían con las 25 C de la segunda hebra, y así sucesivamente. Cuando se suman todos, los números correctos de cada base se indican en la opción E. Observe que, en la respuesta correcta, A = T y G = C.

29.4 Enumere el orden en el que las siguientes enzimas participan en la replicación procariota.

B. Polimerasa I (actividad exonucleasa 3ʹ y rarr5ʹ)

C. Polimerasa I (actividad exonucleasa 5ʹ y rarr3ʹ)

D. Polimerasa I (actividad polimerasa 5ʹ y rarr3ʹ)

Respuesta correcta: F, E, C, D, B, A.La primasa produce el cebador de ARN La polimerasa III extiende el cebador con ADN (y corrige) la polimerasa I elimina el cebador con su actividad de exonucleasa 5ʹ y rarr3ʹ, llena el espacio con su actividad de polimerasa 5ʹ y rarr3ʹ y elimina los errores con su actividad de exonucleasa 3ʹ y rarr5ʹ y la ligasa produce la actividad de exonucleasa 5ʹ y rarr3ʹ Enlace fosfodiéster que une el ADN formado por la polimerasa I y la polimerasa III.

29.5 Los didesoxinucleótidos carecen de un grupo 3ʹ-hidroxilo. ¿Por qué la incorporación de un didesoxinucleótido al ADN detendría la replicación?

La falta del grupo 3ʹ-OH evita la formación del enlace 3ʹ-hidroxilo y rarr 5ʹ-fosfato que une un nucleótido al siguiente en el ADN.

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Ver el vídeo: Replicación, transcripcion y traducción del ADN (Agosto 2022).