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Conversión de densidad óptica a ufc / ml

Conversión de densidad óptica a ufc / ml


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Tengo problemas para comprender la correlación entre las mediciones de DO y UFC / ml. ¿Cuál es el factor de conversión entre las dos unidades? ¿Este factor de conversión compensa de alguna manera las células muertas que podría estar leyendo el OD? (También digamos que el OD se establece en el estándar de 600 nm).


La medición de la densidad óptica es la cantidad de células vivas y no vivas en una muestra. La unidad formadora de colonias mide solo las células viables en una muestra. Una DO de 600 nm equivale aproximadamente a 8 x 10 ^ 8 UFC / ml. Sin embargo, esto es solo una aproximación y no puede tener en cuenta completamente las células muertas que la DO puede estar leyendo, también depende del microorganismo que se esté investigando. Se puede calcular una curva estándar a partir de datos, pero es bastante difícil obtener un resultado exacto. Un artículo muy útil sobre la correlación entre las dos medidas se puede encontrar aquí (de la Revista Brasileña de Microbiología).


OD y ufc / ml - (13 / Feb / 2009)

Siempre tengo el problema de ajustar la DO para obtener ciertas ufc / ml. ¿Hay alguna forma de hacer eso?

¿Cómo se correlaciona el OD con la UFC? Densidad óptica a partículas solo mediante calibración.

Nrelo el 13 de febrero de 2009, 04 & # 5811 AM dijo:

Si mal no recuerdo, la relación entre OD y CFU es que OD mide células vivas y muertas (densidad óptica de la solución que incluye restos celulares) mientras que CFU se relaciona con organismos que pueden crecer en placas de agar (la porción que está viva en tu solución). No estoy seguro de que exista una manera de decir que si tiene una determinada DO, obtendrá una cantidad relacionada de UFC. tal vez cuando tome la medición en la fase logarítmica donde están creciendo felizmente y donde no hay demasiadas células muertas.

MUY aproximadamente, 1 DO es 1e9 células / ml

phage434 el 13 de febrero de 2009, 11 & # 5844 AM dijo:

sí, ese es el valor más frecuente del que escuché

calibre su curva al microorganismo que está estudiando y controle las condiciones de aplicación (incluso a la misma DO, ufc / ml de una suspensión en el frigorífico durante una semana no va a ser lo mismo que un cultivo fresco.

GeorgeWolff el 14 de febrero de 2009, 05 & # 5823 AM dijo:

Cuando hacemos infecciones, colocamos en placa el medio de infección, el inóculo o lo que se usa para infectar.
De esta manera, puede verificar si su DO y el bact / ml (1 DO es aproximadamente 1e9 bact / ml) son bacterias vivas / muertas y sabrá la UFC exacta que ha utilizado para infectar.

exactamente, solíamos hacerlo de esa manera también. y es diferente para cada error, la mayoría de las aproximaciones que ve se basan en E. coli. podría hacer un par de validaciones para su error, para tener una idea, pero aún así es aconsejable colocarlo en placa cada vez e infectar con diluciones para estar seguro.


Tecnología de neuropéptidos

F.M. Laurent-Huck, J.M. Felix, en Métodos en neurociencias, 1991

Uso de la curva de calibración

La DO media se mide sobre cada estándar y se establece en la memoria de la computadora. El área medida no es crítica porque la DO media se calcula por unidad de área. Para compensar las ligeras variaciones en la distribución del material radiomarcado, es mejor medir la DO en el área estándar casi completa.

Debido a las relaciones no lineales entre la radiactividad y la respuesta de la película, se pueden utilizar varias transformaciones matemáticas para la calibración. Con 35 S β radiaciones y β -Max Hyperfilms, la relación entre DO y radiactividad puede considerarse lineal (r ≥ 0,98) entre 0,05 y 0,5 unidades de diámetro exterior (Fig.8). Las transformaciones polinomiales de segundo orden a menudo muestran buenas correlaciones (r ≥ 0,99) entre 0,05 y 0,8 unidades OD (Fig. 8). Una transformación, como log (conc) = F [log (OD)], es otra posibilidad que se puede probar. Cualquiera que sea la curva elegida, para obtener resultados precisos, valores de DO inferiores a 0,01 (sensibilidad umbral de la película vecina y / o límite de detección del analizador de imágenes) y valores de DO superiores a 0,8 unidades (próximos a la saturación de la película,

1 unidad de OD para β -Max Hyperfilms) deben evitarse. La reexposición de las secciones por un tiempo más corto o más largo debería resultar en lecturas de DO más apropiadas. A continuación, la computadora calcula los datos totales o no específicos para las regiones de interés en las secciones experimentales a partir de la curva estándar.

Figura 8. Curvas de calibración, que ilustran una relación polinomial (a) y lineal (b) entre la densidad óptica y la radiactividad.


La ley de Beer-Lambert y OD600

La ley de Lambert-Beer, también conocida como ley de Beer, relaciona empíricamente la absorción de luz con las propiedades de la muestra. Esta ley establece que existe una relación logarítmica entre la transmisión de luz a través de una muestra específica (T = I / Io con I = luz saliente e Io = luz entrante), el coeficiente de extinción molar para un compuesto específico (ε), la concentración de las especies absorbentes en el material (c) y la distancia que viaja la luz (d).

Las estimaciones de DO han obtenido sinónimos con estimaciones de concentración bacteriana (C) o número (N), según la ley de Beer-Lambert. Sin embargo, las mediciones de DO son en realidad mediciones de turbidez, por lo tanto, podemos aplicar la ley de Beer-Lambert, con ciertas contemplaciones, solo para colonias microbianas de baja densidad.


Estimación robusta del recuento de células bacterianas a partir de la densidad óptica

La densidad óptica (DO) es una medida rápida, barata y de alto rendimiento que se usa ampliamente para estimar la densidad de células en cultivo líquido. Sin embargo, estas mediciones no se pueden comparar entre instrumentos sin un protocolo de calibración estandarizado y son difíciles de relacionar con el recuento de células real. Abordamos estas deficiencias con un estudio interlaboratorio que compara tres protocolos de calibración de DO, aplicados a ocho cepas de E. coli diseñado para expresar constitutivamente niveles variables de GFP. Estos tres protocolos (comparación con sílice coloidal (LUDOX), dilución en serie de microesferas de sílice y un ensayo de unidad formadora de colonias de referencia (UFC)) son todos simples, de bajo costo y muy accesibles. Con base en los resultados producidos por los 244 equipos que completaron este estudio entre laboratorios, recomendamos calibrar la DO utilizando una dilución en serie de microesferas de sílice, que produce fácilmente una calibración muy precisa (el 95,5% de los equipos que tienen residuos de menos de 1,2 veces), se evalúa fácilmente en cuanto a calidad. control, y como efecto secundario también evalúa el rango lineal efectivo de un instrumento. Además, las estimaciones del recuento de células de microesferas de sílice se pueden combinar con la calibración de fluorescencia contra fluoresceína para obtener unidades de moléculas de fluoresceína equivalente (MEFL), lo que permite la comparación directa y la fusión de datos con mediciones de citometría de flujo calibradas de forma equivalente: en nuestro estudio, mediciones de fluorescencia por célula mostró solo una diferencia media de 1,07 veces entre el lector de placas y los datos de citometría de flujo.


Mediciones OD600: consejos para la implementación

La medición de la densidad óptica a 600 nm es un método simple y ampliamente utilizado para monitorear el crecimiento de microorganismos en cultivo líquido y determinar su número de células.

Fuente de la imagen: Shutterstock: 1094575550

Si bien es simple, esta tecnología no debe subestimarse. Un cultivo de microorganismos constituye una suspensión, de modo que la luz se dispersa principalmente en lugar de absorberse durante el proceso de medición fotométrica. La dispersión de la luz está influenciada principalmente por la forma y el tamaño del organismo, así como por el diseño del fotómetro [1, 2]. Esto significa que un número de células, o biomasa, no se puede calcular directamente a partir de los valores de DO (densidad óptica) medidos. Dicha conversión requiere una calibración previa del fotómetro con la cepa cultivada, lo que implica la generación de una curva estándar [2].

La curva estándar puede basarse en diferentes parámetros, dependiendo de qué factor sea relevante para el experimento en cuestión. Si, por ejemplo, el aumento de la biomasa de un cultivo es de interés, las densidades ópticas obtenidas a partir de diferentes diluciones de un cultivo se pueden representar frente al peso seco determinado para estas muestras. Este método es igualmente adecuado para la determinación del rango lineal de la muestra dentro de este fotómetro específico. La relación lineal entre OD600 y la concentración es muy limitada en el caso de las mediciones de luz dispersa en comparación con las mediciones de absorbancia, ya que las densidades más altas conducen a una dispersión múltiple entre las partículas. Este efecto aumentará la probabilidad de que finalmente llegue más luz al detector. La curva estándar resultante mostrará hasta qué densidad óptica los valores siguen una progresión lineal.

Si es crucial determinar el número de células vivas dentro de un cultivo, OD600 pueden representarse frente al número de células vivas (las células muertas y los restos celulares también contribuyen a la dispersión de la luz). Con este fin, se extraen muestras del cultivo líquido en múltiples momentos. Una parte se mide a 600 nm usando un fotómetro, mientras que la otra parte de la muestra se somete a una dilución en serie. A continuación, se esparce un volumen definido de cada dilución en una placa de agar separada y se incuba. Se cuenta el número de colonias que crecen en las placas y, en consecuencia, se pueden calcular las unidades formadoras de colonias (ufc) / ml o el recuento de células del cultivo original (figura 1). Si los valores se grafican frente a la concentración, se obtendrá una curva de calibración que servirá de base para las mediciones posteriores de la misma cepa utilizando el mismo instrumento.

Los siguientes puntos deben tenerse en cuenta al medir el OD600: Dado que un cultivo constituye una suspensión, la homogeneidad de la muestra es fundamental. Por esta razón, el cultivo debe mezclarse bien antes de la extracción de muestras y, si corresponde, debe repetirse la mezcla justo antes de la medición. El mismo medio de cultivo fresco que se utiliza para el cultivo debe servir como blanco. Sin embargo, si se requiere una mayor precisión y si el medio cambia de color durante el transcurso de la incubación, puede ser ventajoso utilizar el sobrenadante del cultivo como blanco. Si la densidad óptica medida excede el rango lineal, la muestra debe diluirse en consecuencia utilizando medio de cultivo. En el Libro blanco 27 ​​[3] se enumeran otras posibles causas de la variación de los valores medidos.


Archivo S1.

Fig. A. Resultados del análisis de macrorrestricción de 17 B. bronquiseptica aisla usando Salmonela Marcador Typhimurium LT2 y endonucleasa de restricción XbaI. Fig. B. Medición de densidad óptica (OD) de B. bronquiseptica cepa de referencia DSM 10303 en cuatro medios, media de tres experimentos independientes. Figura C. Densidad óptica (OD) de B. bronquiseptica tipo cepa DSM 13414 en cuatro medios, media de tres experimentos independientes. Fig. D. Densidad óptica (OD) de B. bronquiseptica campo aislado Bb5 / 12 en cuatro medios, media de tres experimentos independientes. Fig. E. Densidad óptica (OD) de B. bronquiseptica campo aislado Bb24 / 12 en cuatro medios, media de tres experimentos independientes. Fig. F. Número (log ufc / ml) de bacterias (B. bronquiseptica cepa de referencia DSM 10303) en cuatro medios de tres experimentos independientes. Figura G. Número (log ufc / ml) de bacterias (B. bronquiseptica tipo cepa DSM 13414) en cuatro medios de tres experimentos independientes. Fig. H. Número (log ufc / ml) de bacterias (B. bronquiseptica campo aislado Bb5 / 12) en cuatro medios de tres experimentos independientes. Fig. I. Número (log ufc / ml) de bacterias (B. bronchiseptica campo aislado Bb24 / 12) en cuatro medios de tres experimentos independientes.

Archivo S2.

Cuadro A. Valores de MIC de 10 B. bronquiseptica aislamientos, 20 agentes antimicrobianos y dos tiempos de incubación en cinco repeticiones.


Transmitancia a la tabla de absorbancia

La absorbancia y la transmitancia son medidas que se utilizan en espectrofotometría. La espectrofotometría mide cuánta energía radiante absorbe una sustancia en diferentes longitudes de onda de luz. La técnica es útil para determinar la identidad de una sustancia desconocida y, con el uso de un conjunto de estándares, determinar la concentración de una sustancia en una muestra.

Una tabla de transmitancia a absorbancia permite una conversión rápida de valores de transmitancia a absorbancia en el laboratorio o en el campo.


Abstracto

Este estudio tuvo como objetivo investigar el efecto de diferentes temperaturas de crecimiento sobre la resistencia de Escherichia coli O157: H7 y Salmonela Typhimurium a la irradiación de rayos X de baja energía. La irradiación de solución salina tamponada con fosfato contaminada con rayos X de 0,6 kGy disminuyó los recuentos de E. coli O157: H7 cultivado a 37 ° C por debajo del límite de detección (& lt1.0 unidad formadora de colonias (UFC) / mL) y los de E. coli O157: H7 cultivado a 25 y 15 ° C en 4,82 y 4,45 log UFC / ml, respectivamente. Los recuentos viables de S. Typhimurium cultivado a 37, 25 y 15 ° C en solución salina tamponada con fosfato disminuyó en 3,56, 3,08 y 2,75 log UFC / ml, respectivamente, después de la irradiación con rayos X de 0,6 kGy. La irradiación de lechugas contaminadas con 0,4 kGy disminuyó el recuento de E. coli O157: H7 cultivado a 37, 25 y 15 ° C por 3,97, 3,45 y 3,10 log UFC / cm 2, respectivamente, y los de S. Typhimurium en 4,41, 3,84 y 3,40 log UFC / cm 2, respectivamente. La temperatura de crecimiento influyó en la resistencia de los patógenos a la irradiación de rayos X al modular la membrana celular y la integridad del ADN, la actividad de las enzimas intracelulares y la función de la bomba de eflujo. Los resultados de este estudio sugieren que el estado de resistencia al estrés de las bacterias patógenas cultivadas a diferentes temperaturas de crecimiento debe considerarse para la aplicación de irradiación de rayos X para la esterilización de productos frescos.


Conversión de densidad óptica a ufc / ml - Biología

Sin embargo, medir la absorbancia no nos dice cuántas células hay realmente vivas en el cultivo.

Una forma sencilla de contar el número de células vivas es aprovechar su capacidad para reproducirse. En una placa de Petri recubierta de agar, cada célula viable se dividirá repetidamente, pero su progenie permanecerá en gran parte inmovilizada: formará una colonia.

Las células de esta colonia son un clon de la célula original que aterrizó en la superficie del agar.

Al contar las colonias, obtenemos una estimación directa de la concentración de bacterias viables o, más exactamente, el número de unidades formadoras de colonias - UFC por ml en el cultivo original.

Para determinar el número de UFC por ml (UFC / ml) en un cultivo, una pequeña muestra o alícuota de volumen conocido se retira del cultivo y diluido en un volumen conocido de medios estériles.

Una vez diluido en una cantidad conocida, podemos medir el número de UFC en un volumen conocido de la solución diluida.

Para hacer esto, esparcimos una alícuota del cultivo diluido, generalmente entre 10 a 200 & microL, uniformemente sobre la superficie de una placa petri de agar LB.

Cuando se incuban a 37 ° C, las bacterias individuales crecerán para formar colonias fácilmente visibles en 18-24 horas.

¡Hacer diluciones es uno de los problemas conceptuales más difíciles que tienen los estudiantes!
¡Piense detenidamente en lo que está haciendo! ¿Necesitas un repaso? Lee esto

¿Conoce la diferencia entre un ml y & microL?
¿Qué significa una dilución 10 -3? ¿Cómo configurarías uno?

Si se colocan demasiadas bacterias en un plato, las colonias crecen juntas para formar un césped .

Las concentraciones bacterianas pueden ser muy altas, por lo que generalmente es necesario serie de dilución .

Para hacer esto, tome una alícuota de su primera dilución y diluya nuevamente, luego repita el proceso.

Esto nos permite abarcar una amplia gama de concentraciones.

Este proceso se ilustra aquí

Es difícil, tedioso e inexacto contar más de

300 colonias por plato, puedes demostrártelo a ti mismo si quieres.

Al mismo tiempo, contar muy pocas colonias da como resultado un aumento de las inexactitudes debido a errores de muestreo.

Debe determinar las UFC / ml en el cultivo original, en gran medida para demostrar que comprende cómo hacer diluciones.

Si distribuye demasiadas o muy pocas células, puede repetir el proceso de aplicación, sin tener que configurar una nueva serie de diluciones.

¿Sabes cómo pasar de UFC por placa a UFC por ml en el cultivo original?

¿Cuál fue el título de tu cultura?
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Ver el vídeo: McFarland turbidity Standard preparation. McFarland Std (Julio 2022).


Comentarios:

  1. Carlson

    excelente tema

  2. Vick

    Lo acepto con gusto. En mi opinión, esto es relevante, participaré en la discusión.

  3. Eward

    Estoy de acuerdo, este brillante pensamiento cae por cierto

  4. Voodoolabar

    Verá, el punto aquí es qué se considera correcto y qué no;) Y entonces, el tema es bueno, por supuesto, respeto al autor.



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