Información

Optimización de la PCR con transcripción inversa

Optimización de la PCR con transcripción inversa



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

¿Cuál es la cantidad ideal de ARN para usar en la RT? ¿y cuánto cDNA usar entonces para la PCR?

Hice RT con una solución de ARN de 0,36 ug / ul. Luego, para mi PCR, usé 1 ul del ADNc obtenido y usé 25 ciclos porque esperaba ver una diferencia entre un nivel endógeno y una sobreexpresión. Sin embargo, no detecté ninguna banda a la altura esperada de 500 pb, sino una banda difusa a 100 pb. ¿Qué pueden representar estos 100 pb? dímero de imprimación? Cambié a 35 ciclos y usé la misma cantidad de ADNc o agregué 3 veces más ADNc. En ambos casos obtuve bandas a la altura esperada (pero más fuertes cuando puse más ADNc) y aún grandes bandas a 100 pb.


También veo grandes bandas difusas alrededor de 100 pb. Son mas probables Contaminación por ARN. Para deshacerse de ellos, digiera sus productos de RT-PCR con ARNasa-H. Pero si solo necesita visualizar su banda de interés y las bandas difusas no se interponen en el camino, no debería ser un problema.

Por lo general, ingreso entre 1 y 2 ug de ARN en mi reacción de RT-PCR usando el kit Invitrogen Superscript III para un volumen total de 20 ul. Después de la reacción, utilizo 1/10 del volumen de ese (2 ul) para aplicaciones posteriores (PCR). Esto generalmente me da buenos resultados.

Para optimizar la RT-PCR para la detección de un objetivo específico, considere usar cebadores específicos de genes (asegúrese de usar solo cebadores antisentido) en su RT-PCR en lugar de oligo-dT o hexámeros aleatorios. Esto enriquece su objetivo cuando los usa para aplicaciones posteriores. Sin embargo, cuando use GSP, asegúrese de ejecutar una reacción paralela con cebadores de control (es decir, beta actina) para demostrar que su reacción de RT-PCR está funcionando.


No existe una "cantidad ideal" única de ARN. Le sugiero que haga una curva de titulación para determinar la mejor cantidad para su ensayo específico. La banda a 100 pb podría ser una amplificación no específica. Puede intentar aumentar ligeramente la temperatura de recocido para ver si eso elimina (o reduce) la banda inferior. Alternativamente, puede considerar un conjunto de cebadores diferente o incluso una PCR anidada. Además, es posible que busque una alternativa de empalme en esa banda. ¿Sus cebadores abarcan más de un exón?


Diseño y optimización de una nueva PCR lineal después de la exponencial con transcripción inversa para la detección del virus de la fiebre aftosa

Objetivos: Se desarrolló un ensayo molecular novedoso para la detección del virus de la fiebre aftosa (FMDV) utilizando la reacción en cadena de la polimerasa lineal después de la exponencial (LATE-PCR).

Métodos y resultados: Los experimentos piloto que utilizaron dianas de ADN sintético demostraron la capacidad de LATE-PCR para cuantificar la concentración inicial de la diana mediante la detección del punto final. A continuación, se utilizó un protocolo de dos pasos que incluía transcripción inversa (RT) seguida de LATE-PCR para confirmar la capacidad del ensayo para detectar ARN del virus de la fiebre aftosa. Finalmente, RT y LATE-PCR se combinaron en un ensayo dúplex de un solo paso para la coamplificación de un segmento de ARN del virus de la fiebre aftosa y un control interno compuesto por un ARN blindado. De esa forma, cada uno de los cebadores en exceso en la mezcla de reacción se hibrida con sus respectivos objetivos de ARN durante una breve preincubación, luego genera cadenas de ADNc durante un paso de RT de 3 minutos a 60 ° C, y el ADNc resultante es amplificado por LATE. -PCR sin intervención de procesamiento de muestras.

Conclusiones: El ensayo RT-LATE-PCR genera señales fluorescentes en el punto final que son proporcionales al número inicial de objetivos de ARN y puede detectar una variedad de variantes de secuencia utilizando una única sonda tolerante a errores de emparejamiento.

Importancia e impacto del estudio: Además de ofrecer mejoras con respecto a los ensayos de diagnóstico molecular actuales basados ​​en laboratorio para el virus de la fiebre aftosa, este nuevo ensayo es compatible con un nuevo dispositivo portátil ('punto de atención'), el BioSeeq II, diseñado para el diagnóstico rápido de la fiebre aftosa en el campo. .

© 2009 Los Autores. Recopilación de revistas © 2009 The Society for Applied Microbiology.


Contenido

La técnica combinada de RT-PCR y qPCR se ha descrito como RT-PCR cuantitativa [3] o RT-PCR en tiempo real [4] (a veces incluso llamada RT-PCR cuantitativa en tiempo real [5]), y se ha abreviado de diversas formas como qRT-PCR, [6] RT-qPCR, [7] RRT-PCR, [8] y rRT-PCR. [9] Para evitar confusiones, las siguientes abreviaturas se utilizarán de forma coherente a lo largo de este artículo:

Técnica Abreviatura
Reacción en cadena de la polimerasa PCR
Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa RT-PCR
Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real qPCR
Técnica combinada RT-PCR / qPCR qRT-PCR

No todos los autores, especialmente los anteriores, utilizan esta convención y el lector debe tener cuidado al seguir los enlaces. La RT-PCR se ha utilizado para indicar tanto la PCR en tiempo real (qPCR) como la PCR de transcripción inversa (RT-PCR).

Desde su introducción en 1977, Northern blot se ha utilizado ampliamente para la cuantificación de ARN a pesar de sus deficiencias: (a) técnica que requiere mucho tiempo, (b) requiere una gran cantidad de ARN para la detección, y (c) cuantitativamente inexacta en la baja abundancia de Contenido de ARN. [10] [11] Sin embargo, desde su invención por Kary Mullis en 1983, la RT PCR ha desplazado a la transferencia Northern como el método de elección para la detección y cuantificación de ARN. [12]

La RT-PCR se ha convertido en la tecnología de referencia para la detección y / o comparación de los niveles de ARN por varias razones: (a) no requiere procesamiento posterior a la PCR, (b) una amplia gama (& gt10 7 veces) de abundancia de ARN puede medirse, y (c) proporciona información sobre datos tanto cualitativos como cuantitativos. [5] Debido a su simplicidad, especificidad y sensibilidad, la RT-PCR se utiliza en una amplia gama de aplicaciones, desde experimentos tan simples como la cuantificación de células de levadura en el vino hasta usos más complejos como herramientas de diagnóstico para detectar agentes infecciosos como la gripe aviar. virus y SARS-CoV-2. [13] [14] [15]

En RT-PCR, la plantilla de ARN se convierte primero en un ADN complementario (ADNc) utilizando una transcriptasa inversa (RT). El ADNc se usa luego como molde para la amplificación exponencial usando PCR. El uso de RT-PCR para la detección de la transcripción de ARN ha revolucionado el estudio de la expresión génica de las siguientes formas importantes:

  • Teóricamente hizo posible detectar las transcripciones de prácticamente cualquier gen [16]
  • Permitió la amplificación de la muestra y eliminó la necesidad de abundante material de partida requerido cuando se usa el análisis de transferencia Northern [17] [18]
  • Proporcionó tolerancia a la degradación del ARN siempre que el ARN que abarca el cebador esté intacto [17]

RT-PCR de un paso frente a RT-PCR de dos pasos Editar

La cuantificación de ARNm mediante RT-PCR se puede lograr como una reacción de un paso o de dos pasos. La diferencia entre los dos enfoques radica en la cantidad de tubos utilizados al realizar el procedimiento. La reacción de dos pasos requiere que la reacción de transcriptasa inversa y la amplificación por PCR se realicen en tubos separados. La desventaja del enfoque de dos pasos es la susceptibilidad a la contaminación debido a una manipulación de muestras más frecuente. [19] Por otro lado, la reacción completa desde la síntesis de ADNc hasta la amplificación por PCR ocurre en un solo tubo en el enfoque de un solo paso. Se cree que el enfoque de un solo paso minimiza la variación experimental al contener todas las reacciones enzimáticas en un solo entorno. Elimina los pasos de pipetear el producto de ADNc, que requiere mucha mano de obra y es propenso a la contaminación, a la reacción de PCR. El uso adicional de polimerasas tolerantes a inhibidores, potenciadores de la polimerasa con una condición de RT-PCR optimizada en un solo paso, respalda la transcripción inversa del ARN de muestras crudas o no purificadas, como sangre total y suero. [20] [21] Sin embargo, las plantillas de ARN iniciales son propensas a degradarse en el enfoque de un solo paso, y no se recomienda el uso de este enfoque cuando se requieren ensayos repetidos de la misma muestra. Además, se informa que el enfoque de un paso es menos preciso en comparación con el enfoque de dos pasos. También es el método de análisis preferido cuando se utilizan tintes de unión al ADN como SYBR Green, ya que la eliminación de los dímeros de los cebadores se puede lograr mediante un simple cambio en la temperatura de fusión. Sin embargo, el enfoque de un solo paso es una solución relativamente conveniente para la detección rápida de ARN diana directamente en la biodetección. [ cita necesaria ]

RT-PCR de punto final frente a RT-PCR en tiempo real Editar

La cuantificación de los productos de RT-PCR se puede dividir en gran medida en dos categorías: punto final y tiempo real. [22] Se prefiere el uso de la RT-PCR de punto final para medir los cambios en la expresión génica en una pequeña cantidad de muestras, pero la RT-PCR en tiempo real se ha convertido en el método estándar de oro para validar los resultados cuantitativos obtenidos de los análisis de matriz o la expresión génica cambios a escala global. [23]

Edición de RT-PCR de punto final

Los métodos de medición de la RT-PCR de punto final requieren la detección de los niveles de expresión génica mediante el uso de tintes fluorescentes como el bromuro de etidio, [24] [25] etiquetado P32 de los productos de la PCR utilizando phosphorimager, [26] o mediante recuento de centelleo. [18] La RT-PCR de punto final se logra comúnmente utilizando tres métodos diferentes: relativo, competitivo y comparativo. [27] [28]

RT-PCR relativa Las cuantificaciones relativas de RT-PCR implican la coamplificación de un control interno simultáneamente con el gen de interés. El control interno se utiliza para normalizar las muestras. Una vez normalizado, se puede realizar una comparación directa de las abundancias relativas de transcripción en múltiples muestras de ARNm. Una precaución a tener en cuenta es que el control interno debe elegirse de manera que no se vea afectado por el tratamiento experimental. El nivel de expresión debe ser constante en todas las muestras y con el ARNm de interés para que los resultados sean precisos y significativos. Debido a que la cuantificación de los resultados se analiza comparando el rango lineal de la amplificación del objetivo y del control, es crucial tener en cuenta la concentración inicial de las moléculas objetivo y su tasa de amplificación antes de comenzar el análisis. Los resultados del análisis se expresan como las proporciones de la señal del gen a la señal de control interno, cuyos valores pueden usarse luego para la comparación entre las muestras en la estimación de la expresión relativa del ARN diana. [25] [28] [29] RT-PCR competitiva La técnica de RT-PCR competitiva se utiliza para la cuantificación absoluta. Implica el uso de un ARN "competidor" sintético que se puede distinguir del ARN diana por una pequeña diferencia de tamaño o secuencia. Es importante que el diseño del ARN sintético sea idéntico en secuencia pero ligeramente más corto que el ARN objetivo para obtener resultados precisos. Una vez diseñado y sintetizado, se agrega una cantidad conocida del ARN competidor a las muestras experimentales y se coamplifica con la diana mediante RT-PCR. Luego, se produce una curva de concentración del ARN competidor y se usa para comparar las señales de RT-PCR producidas a partir de las transcripciones endógenas para determinar la cantidad de diana presente en la muestra. [28] [30] RT-PCR comparativa La RT-PCR comparativa es similar a la RT-PCR competitiva en que el ARN diana compite por los reactivos de amplificación en una sola reacción con un patrón interno de secuencia no relacionada. Una vez que se completa la reacción, los resultados se comparan con una curva estándar externa para determinar la concentración de ARN objetivo. En comparación con los métodos de cuantificación relativa y competitiva, se considera que la RT-PCR comparativa es el método más conveniente de usar, ya que no requiere que el investigador realice un experimento piloto en RT-PCR relativa, el rango de amplificación exponencial del ARNm debe estar predeterminado y en RT-PCR competitiva, se debe sintetizar un ARN competidor sintético. [28] [31] [32] [33] [34]

Edición de RT-PCR en tiempo real

La aparición de nuevas técnicas de etiquetado de ADN fluorescente en los últimos años ha permitido el análisis y la detección de productos de PCR en tiempo real y, en consecuencia, ha llevado a la adopción generalizada de RT-PCR en tiempo real para el análisis de la expresión génica. La RT-PCR en tiempo real no solo es ahora el método de elección para la cuantificación de la expresión génica, sino que también es el método preferido para obtener resultados de análisis de matrices y expresiones génicas a escala global. Actualmente, hay cuatro sondas de ADN fluorescentes diferentes disponibles para la detección RT-PCR en tiempo real de productos de PCR: SYBR Green, TaqMan, balizas moleculares y sondas de escorpión. Todas estas sondas permiten la detección de productos de PCR al generar una señal fluorescente. Mientras que el tinte SYBR Green emite su señal fluorescente simplemente uniéndose al ADN de doble hebra en solución, la generación de fluorescencia de las sondas TaqMan, las balizas moleculares y los escorpiones depende del acoplamiento de la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) de la molécula del tinte y un resto extintor de los sustratos de oligonucleótidos. [35]

SYBR Green Cuando SYBR Green se une al ADN de doble hebra de los productos de PCR, emitirá luz al ser excitado. La intensidad de la fluorescencia aumenta a medida que se acumulan los productos de la PCR. Esta técnica es fácil de usar ya que el diseño de sondas no es necesario dada la falta de especificidad de su unión. Sin embargo, dado que el tinte no discrimina el ADN de doble hebra de los productos de la PCR y los de los dímeros de los cebadores, la sobreestimación de la concentración diana es un problema común. Cuando la cuantificación precisa sea una necesidad absoluta, se deben realizar más ensayos para la validación de los resultados. Sin embargo, entre los métodos de detección de productos RT-PCR en tiempo real, SYBR Green es el más económico y fácil de usar. [22] [23]

Se emplean comúnmente dos estrategias para cuantificar los resultados obtenidos por RT-PCR en tiempo real, el método de curva estándar y el método de umbral comparativo. [40]

La amplificación exponencial mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa proporciona una técnica muy sensible en la que se puede detectar un número muy bajo de copias de moléculas de ARN. La RT-PCR se usa ampliamente en el diagnóstico de enfermedades genéticas y, semicuantitativamente, en la determinación de la abundancia de diferentes moléculas de ARN específicas dentro de una célula o tejido como medida de expresión génica.

Métodos de investigación Editar

La RT-PCR se usa comúnmente en métodos de investigación para medir la expresión génica. Por ejemplo, Lin et al. utilizaron qRT-PCR para medir la expresión de genes Gal en células de levadura. Primero, Lin et al. diseñó una mutación de una proteína que se sospecha participa en la regulación de los genes Gal. Se planteó la hipótesis de que esta mutación abolía selectivamente la expresión de Gal. Para confirmar esto, los niveles de expresión génica de las células de levadura que contienen esta mutación se analizaron usando qRT-PCR. Los investigadores pudieron determinar de manera concluyente que la mutación de esta proteína reguladora reducía la expresión de Gal. [41] El análisis de transferencia Northern se utiliza para estudiar más a fondo la expresión génica del ARN.

Inserción genética Editar

La RT-PCR también puede ser muy útil en la inserción de genes eucariotas en procariotas. Debido a que la mayoría de los genes eucariotas contienen intrones, que están presentes en el genoma pero no en el ARNm maduro, el ADNc generado a partir de una reacción de RT-PCR es la secuencia de ADN exacta (sin tener en cuenta la naturaleza propensa a errores de las transcriptasas inversas) que sería traducido directamente en proteína después de la transcripción. Cuando estos genes se expresan en células procarióticas con el fin de la producción o purificación de proteínas, el ARN producido directamente a partir de la transcripción no necesita someterse a un corte y empalme, ya que la transcripción solo contiene exones. (Los procariotas, como E. coli, carecen del mecanismo de empalme de ARNm de los eucariotas).

Diagnóstico de enfermedades genéticas Editar

La RT-PCR se puede utilizar para diagnosticar enfermedades genéticas como el síndrome de Lesch-Nyhan. Esta enfermedad genética es causada por un mal funcionamiento en el gen HPRT1, que clínicamente conduce a la piedra urinaria de ácido úrico fatal y síntomas similares a la gota. [6] [ aclaración necesaria ] El análisis de los niveles de expresión de ARNm de HPRT1 en una madre embarazada y un feto revelará si la madre es portadora y si es probable que el feto desarrolle el síndrome de Lesch-Nyhan. [42]

Detección de cáncer Editar

Los científicos están trabajando en formas de utilizar RT-PCR en la detección del cáncer para ayudar a mejorar el pronóstico y monitorear la respuesta a la terapia. Las células tumorales circulantes producen transcripciones de ARNm únicas según el tipo de cáncer. El objetivo es determinar qué transcripciones de ARNm sirven como los mejores biomarcadores para un tipo de célula cancerosa en particular y luego analizar sus niveles de expresión con RT-PCR. [43]

La RT-PCR se usa comúnmente para estudiar los genomas de virus cuyos genomas están compuestos de ARN, como el Influenzavirus A, retrovirus como el VIH y el SARS-CoV-2. [44]

A pesar de sus principales ventajas, la RT-PCR no está exenta de inconvenientes. El crecimiento exponencial del ADN complementario de transcripción inversa (ADNc) durante los múltiples ciclos de PCR produce una cuantificación del punto final inexacta debido a la dificultad de mantener la linealidad. [45] Con el fin de proporcionar una detección y cuantificación precisas del contenido de ARN en una muestra, se desarrolló qRT-PCR utilizando una modificación basada en fluorescencia para monitorear los productos de amplificación durante cada ciclo de PCR. La extrema sensibilidad de la técnica puede ser un arma de doble filo, ya que incluso la más mínima contaminación de ADN puede dar lugar a resultados no deseados. [46] Un método simple para eliminar los resultados falsos positivos es incluir anclajes, o etiquetas, en la región 5 'de un cebador específico de un gen. [47] Además, la planificación y el diseño de estudios de cuantificación pueden resultar técnicamente desafiantes debido a la existencia de numerosas fuentes de variación, incluida la concentración de la plantilla y la eficiencia de amplificación. [31] Agregar una cantidad conocida de ARN en una muestra, agregar una serie de diluciones de ARN generando una curva estándar y agregar una muestra sin copia de plantilla (sin ADNc) puede usarse como controles.

La RT-PCR se puede llevar a cabo mediante el protocolo RT-PCR de un paso o el protocolo RT-PCR de dos pasos.

Edición de RT-PCR en un solo paso

La RT-PCR de un solo paso somete a los objetivos de ARNm (hasta 6 kb) a la transcripción inversa seguida de la amplificación por PCR en un solo tubo de ensayo. Es importante tener en cuenta que el uso de ARN intacto de alta calidad y un cebador específico de secuencia producirá los mejores resultados.

Una vez que se selecciona un kit de RT-PCR de un solo paso con una mezcla de transcriptasa inversa, ADN polimerasa Taq y una polimerasa de corrección de pruebas y se obtienen todos los materiales y equipos necesarios, se debe preparar una mezcla de reacción. La mezcla de reacción incluye dNTP, cebadores, plantilla de ARN, enzimas necesarias y una solución tampón. La mezcla de reacción se agrega a un tubo de PCR para cada reacción, seguida de la plantilla de ARN. Luego, los tubos de PCR se colocan en un termociclador para comenzar a ciclar. En el primer ciclo, se produce la síntesis de ADNc. El segundo ciclo es la desnaturalización inicial en la que se inactiva la transcriptasa inversa. Los 40-50 ciclos restantes son la amplificación, que incluye desnaturalización, hibridación y alargamiento. Cuando se completa la amplificación, los productos de RT-PCR se pueden analizar con electroforesis en gel. [48] ​​[49]

(Manual de aplicaciones de PCR y Biotools)

Edición de RT-PCR de dos pasos

La RT-PCR de dos pasos, como su nombre lo indica, se produce en dos pasos. Primero la transcripción inversa y luego la PCR. Este método es más sensible que el método de un solo paso. Los kits también son útiles para RT-PCR de dos pasos. Al igual que para la PCR en un solo paso, utilice solo ARN intacto de alta calidad para obtener los mejores resultados. El cebador para la PCR de dos pasos no tiene que ser específico de secuencia.

Paso uno Editar

Primero combine el ARN de plantilla, el cebador, la mezcla de dNTP y el agua libre de nucleasas en un tubo de PCR. Luego, agregue un inhibidor de RNasa y transcriptasa inversa al tubo de PCR. A continuación, coloque el tubo de PCR en un termociclador durante un ciclo en el que

se produce el recocido, la extensión y la inactivación de la transcriptasa inversa. Finalmente, proceda directamente al paso dos que es PCR o almacene el producto en hielo hasta que se pueda realizar la PCR.

Paso dos Editar

Agregue la mezcla maestra que contiene tampón, mezcla de dNTP, MgCl2, Taq polimerasa y agua libre de nucleasas a cada tubo de PCR. Luego agregue la imprimación necesaria a los tubos. A continuación, coloque los tubos de PCR en un termociclador durante 30 ciclos del programa de amplificación. Esto incluye: desnaturalización, recocido y alargamiento. Los productos de RT-PCR se pueden analizar con electroforesis en gel. [50]

Se considera que el ensayo de RT-PCR cuantitativa es el estándar de oro para medir el número de copias de dianas de ADNc específicas en una muestra, pero está mal estandarizado. [51] Como resultado, aunque existen numerosas publicaciones que utilizan la técnica, muchas proporcionan detalles experimentales inadecuados y utilizan análisis de datos inadecuados para sacar conclusiones inapropiadas. Debido a la variabilidad inherente en la calidad de cualquier dato cuantitativo de PCR, los revisores no solo tienen dificultades para evaluar estos manuscritos, sino que los estudios también se vuelven imposibles de replicar. [52] Reconociendo la necesidad de estandarizar la notificación de condiciones experimentales, un consorcio internacional de científicos académicos ha publicado las directrices de Información mínima para la publicación de experimentos cuantitativos en tiempo real de PCR (MIQE, pronunciado mykee). Las pautas de MIQE describen la información mínima necesaria para evaluar los experimentos de PCR cuantitativos que se deben solicitar para su publicación para fomentar una mejor práctica experimental y garantizar la relevancia, precisión, interpretación correcta y repetibilidad de los datos de PCR cuantitativos. [53]

Además de las directrices para la presentación de informes, el MIQE destaca la necesidad de estandarizar la nomenclatura asociada con la PCR cuantitativa para evitar confusiones, por ejemplo, la abreviatura qPCR debe usarse para PCR cuantitativa en tiempo real y RT-qPCR debe usarse para transcripción inversa-qPCR, y los genes utilizados para la normalización deben denominarse genes de referencia en lugar de genes de mantenimiento. También propone que no se deben utilizar términos derivados comercialmente como sondas TaqMan, sino que se denominan sondas de hidrólisis. Además, se propone que el ciclo de cuantificación (Cq) se utilice para describir el ciclo de PCR utilizado para la cuantificación en lugar del ciclo de umbral (Ct), el punto de cruce (Cp) y el punto de despegue (TOP), que se refieren al mismo valor pero fueron acuñado por diferentes fabricantes de instrumentos en tiempo real. [51]

La guía consta de los siguientes elementos: 1) diseño experimental, 2) muestra, 3) extracción de ácido nucleico, 4) transcripción inversa, 5) información del objetivo de qPCR, 6) oligonucleótidos, 7) protocolo, 8) validación y 9) datos análisis. Los artículos específicos dentro de cada elemento llevan una etiqueta de E (esencial) o D (deseable). Los etiquetados con E se consideran críticos e indispensables, mientras que los etiquetados con D se consideran periféricos pero importantes para las mejores prácticas. [53]


La optimización de la PCR cuantitativa de transcripción inversa para la verificación de datos de microarrays de ADNc

El análisis de microarrays de ADNc es muy útil para monitorear cambios en todo el genoma en la expresión génica que ocurren en procesos biológicos. Los estándares actuales requieren que las observaciones de microarrays se verifiquen mediante (Q) -PCR cuantitativo u otras técnicas. Pocos estudios han optimizado la Q-PCR para la verificación de los resultados de los microarrays. El estudio actual evaluó varias variables que afectan la fidelidad de Q-PCR, incluidos los métodos de extracción de ARN, el enriquecimiento de ARNm, los cebadores para la transcripción inversa y los métodos de detección de amplificación de ADNc. También se evaluó la elección del gen de referencia en el que se basan otros cambios de expresión génica. Se encontró que el ARN de la proteína ribosómica S28 era ideal para este propósito, con una variación mínima en la expresión entre las líneas celulares isogénicas resistentes a los fármacos. También encontramos que los cebadores oligo (dT) eran superiores a los hexámeros aleatorios y que el ARN extraído por el método RNeasy proporcionaba una amplificación del gen S28 consistente sin necesidad de enriquecimiento de ARNm, particularmente cuando se usaban sondas TaqMan. Sin embargo, la sensibilidad fue lo suficientemente alta con SYBR Green I como para ser el método preferido y menos costoso para la detección de productos de amplificación, incluso para transcripciones de baja abundancia. Utilizando el método óptimo, el 91-95% de las diferencias en la expresión génica identificadas entre las líneas celulares mediante el análisis de microarrays de ADNc podrían confirmarse mediante Q-PCR, significativamente superior a los métodos descritos anteriormente.


Optimización de su PCR

La PCR a veces puede requerir la optimización de las condiciones de reacción para obtener un resultado exitoso. Aprenda a optimizar las condiciones de PCR para sus experimentos utilizando las preguntas frecuentes a continuación.

Al optimizar las condiciones de la PCR, ¿qué condiciones son particularmente importantes?

Paso de desnaturalización inicial

A veces se requiere precalentamiento para desnaturalizar las plantillas complejas (por ejemplo, ADN genómico) 94 ° C durante 1 min es suficiente para la desnaturalización. El tratamiento térmico excesivo puede provocar la inactivación de las enzimas.

  • Para Terra PCR Direct Polymerase Mix, que se utiliza para la amplificación por PCR directa de tejido sin extracción y purificación de ADN, es necesario precalentar a 98 ° C durante 2 min.
  • Para Takara LA Taq ADN polimerasas y ADN polimerasas Advantage GC2, se requiere un paso de desnaturalización inicial.
  • Las enzimas PrimeSTAR no requieren precalentamiento para la activación enzimática.

Condiciones desnaturalizantes

Las condiciones de desnaturalización deben seleccionarse considerando el modelo de termociclador que se utilizará. Una pauta general es 94 & ndash95 & degC durante 30 segundos o 98 & degC durante 10 segundos.

Si usa una enzima resistente al calor, como una de las polimerasas PrimeSTAR, recomendamos un paso de desnaturalización de corta duración y alta temperatura (es decir, 5 & ndash10 segundos a 98 & degC).

La desnaturalización a una temperatura excesivamente alta o durante demasiado tiempo puede resultar en la pérdida de actividad enzimática y / o daño en plantillas largas.

Condiciones de recocido

El paso de recocido debe ajustarse para cada conjunto de cebadores; la temperatura de recocido depende directamente de la Tmetro de imprimaciones. El uso de temperaturas de recocido demasiado bajas puede dar como resultado un cebado incorrecto y una amplificación inespecífica, lo que conduce a bajos rendimientos del producto deseado.

La eficiencia y la especificidad de la amplificación se pueden mejorar ajustando la temperatura de hibridación de acuerdo con la T del cebador.metro o realizando una PCR de dos pasos.

  • Para Taq enzimas, el tiempo de recocido recomendado es de 30 segundos.
  • Las enzimas de la serie PrimeSTAR tienen una excelente eficacia de cebado. Por lo tanto, es importante utilizar un tiempo de recocido corto de 5 & ndash15 segundos. Los tiempos de recocido excesivamente largos pueden conducir a una amplificación inespecífica inducida por un cebado incorrecto.
  • Al amplificar secuencias cortas de menos de 1 kb, se recomienda un protocolo de PCR de tres pasos. Para dianas ricas en GC o amplificaciones de secuencias largas (& gt10 kb), se recomienda un protocolo de PCR de dos pasos.

Paso de extensión

En general, se recomienda un tiempo de extensión de 1 min / kb. Cuando utilice las enzimas de alta velocidad SpeedSTAR HS DNA Polymerase o SapphireAmp Fast PCR Master Mix, utilice una velocidad de reacción de 10 seg / kb de producto amplificado (es decir, 10 seg para un producto de 1 kb, 20 seg para un producto de 2 kb , etc.).

PrimeSTAR Max DNA Polymerase y PrimeSTAR GXL DNA Polymerase contienen un factor de alargamiento patentado y permiten reacciones de alta velocidad a 5 & ndash20 seg / kb. Si se utilizan estas enzimas con muestras que contienen un exceso de plantilla, se debe utilizar un tiempo de alargamiento de 1 min / kb.

¿Debería utilizar un protocolo de PCR de tres o dos pasos?

La PCR de tres pasos incluye pasos de desnaturalización, recocido y extensión. Este tipo de protocolo debe usarse cuando el Tmetro de los cebadores es inferior a la temperatura de extensión o es inferior a 68 ° C.

Si la temperatura de fusión de la imprimación (Tmetro) está cerca de la temperatura de extensión (72 ° C) o unos pocos grados más baja, considere usar un protocolo de PCR de dos pasos que incluya un paso de desnaturalización y un paso combinado de recocido / extensión. Con este protocolo, la temperatura de recocido no debe exceder la temperatura de extensión.

¿Qué temperatura de extensión debo utilizar, 68 ° C o 72 ° C?

Se prefiere una temperatura de extensión de 68 ° C para la PCR de dos pasos y cuando se amplifican moldes más largos (& gt4 kb). Esta temperatura de extensión más baja mejora drásticamente los rendimientos de productos de amplificación más largos al reducir la tasa de depurificación que influye en la amplificación.

Se deben usar 72 ° C como temperatura de extensión cuando se realiza una PCR estándar de tres pasos y para la amplificación de fragmentos cortos (& lt4 kb).

¿Cuál es la cantidad óptima de plantilla de ADN que se debe utilizar para la PCR?

La cantidad óptima de plantilla requerida depende de la complejidad de la plantilla y el número de copias de la secuencia objetivo. Se requieren aproximadamente 104 copias de la secuencia de ADN diana para detectar el producto de amplificación en ciclos de PCR de 25 & ndash30.

  • Normalmente, 1 & microg de ADN genómico humano contiene 3,04 x 105 moléculas de ADN. Para la mayoría de las aplicaciones de PCR, son suficientes 30 & ndash100 ng de ADN genómico humano. Los objetivos de alto número de copias, como los genes de mantenimiento, requieren solo 10 ng de plantilla. Las cantidades de plantilla para plantillas de mayor complejidad oscilan entre 10 ng y 500 ng.
  • Normalmente, 1 & microg de E. coli El ADN genómico contiene 2 x 108 moléculas de ADN, por lo tanto, la cantidad recomendada de molde es entre 100 pg y 1 ng.
  • Normalmente, 1 & microg de ADN lambda contiene 1,9 x 10 10 moléculas de ADN, por lo tanto, la entrada de la plantilla puede ser tan pequeña como 100 pg.
  • La cantidad de plantilla de ADNc depende del número de copias del objetivo. La entrada de ADNc se describe típicamente en términos de entrada de ARN equivalente. La cantidad de ADNc en una reacción de PCR puede ser tan pequeña como 10 pg (equivalente de ARN).

Es importante señalar que no todas las polimerasas pueden tolerar cantidades excesivas de molde. Para muestras que contienen exceso de plantilla (hasta 1 & microg), recomendamos PrimeSTAR GXL DNA Polymerase.

¿Cuáles son los factores críticos para la amplificación de dianas genómicas largas?

Calidad de la plantilla

La integridad del ADN es fundamental para la amplificación de objetivos largos. El daño y mdash del ADN, como la rotura del ADN durante el aislamiento del ADN o la depurinación del ADN a temperaturas elevadas y pH bajo, da como resultado una mayor cantidad de productos parciales y una disminución del rendimiento general. El daño del ADN también puede ocurrir en condiciones ácidas, por lo tanto, evite usar agua para resuspender las plantillas de ADN. El ADN es más estable a pH 7 y ndash8 o en soluciones tamponadas.

Condiciones de PCR

  • El tiempo de desnaturalización debe mantenerse al mínimo para disminuir los eventos de depurinación.
  • Use el inicio de PCR de contacto a una temperatura de recocido más alta y reduzca en dos grados por ciclo durante varios ciclos.
  • Diseño de imprimaciones con temperaturas de fusión (Tmetro) por encima de 68 ° C.

Polimerasas de PCR

Ofrecemos varias polimerasas de PCR optimizadas para PCR de largo alcance. Takara LA Taq ADN polimerasa, TaKaRa LA Taq Se recomiendan la polimerasa con tampón GC y la ADN polimerasa PrimeSTAR GXL según el contenido de GC y el tamaño de los objetivos.

¿Cómo puedo determinar si una plantilla es rica en GC?

La proporción de GC varía a lo largo del genoma. Las plantillas con & gt65% de contenido de GC se consideran ricas en GC. Las regiones ricas en GC del genoma se concentran principalmente en regiones reguladoras, incluidos promotores, potenciadores y elementos reguladores cis. Los tractos ricos en GC tienden a formar repeticiones invertidas, o estructuras en horquilla, que pueden no fundirse durante el paso de hibridación de la PCR. Por lo tanto, la amplificación de las plantillas ricas en GC se ve obstaculizada por la separación ineficaz de las dos cadenas de ADN. Esto da como resultado amplicones truncados debido a la terminación prematura de la extensión de la polimerasa.

¿Cuáles son los factores críticos para la amplificación de plantillas ricas en GC?

Condiciones de PCR

  • Utilice temperaturas de desnaturalización más altas (por ejemplo, 98 ° C en lugar de 94 ° C o 95 ° C) para permitir la desnaturalización completa de la plantilla.
  • Mantenga los tiempos de recocido para las plantillas ricas en GC lo más cortos posible.
  • Use primers with a higher Tmetro (>68°C), because annealing can occur at a higher temperature.

PCR polymerases

Use a polymerase optimized for amplification of GC-rich sequences. To find an enzyme, visit our selection guide.

Can DMSO be added to improve amplification of GC-rich templates?

We have heard from customers that improved amplification of GC-rich templates was obtained by adding DMSO to reactions using PrimeSTAR MAX DNA Polymerase or CloneAmp HiFi PCR Premix. The recommended concentration of DMSO is between 2.5% and 5%.

How can I optimize PCR conditions for AT-rich templates?

Some templates may have long AT-rich stretches that are hard to amplify under standard reaction conditions. los Plasmodium falciparum genome is about 80% AT, and regions flanking genes are often AT rich.

Polymerases recommended for GC-rich templates, such as EmeraldAmp GT PCR Master Mix, EmeraldAmp Max PCR master mixes, and PrimeSTAR GXL DNA Polymerase, are also suitable for AT-rich templates.

The advantage of having AT-rich templates is that a lower extension temperature can be used. For certain templates with AT content >80&ndash85%, the extension temperature can be lowered from 72°C to 65&ndash60°C. DNA replication at this reduced temperature appears to be reliable (Su et al. 1996).

Referencias

Su, X. Z., et al. Reduced Extension Temperatures Required for PCR Amplification of Extremely A+T-rich DNA. Nucl Acids Res. 24, 1574&ndash1575 (1996).

What is the role of magnesium in PCR, and what is the optimal concentration?

Magnesium is a required cofactor for thermostable DNA polymerases and is important for successful amplification. Without adequate free Mg 2+ , PCR polymerases are not active. In contrast, excess free Mg 2+ reduces enzyme fidelity and may increase nonspecific amplification. A number of factors can affect the amount of free Mg 2+ in a reaction, including DNA template concentration, chelating agents in the sample (e.g., EDTA or citrate), dNTP concentration, and the presence of proteins.

  • Some polymerases (e.g., Takara Ex Taq DNA polymerases and Takara LA Taq DNA polymerases) are supplied with a magnesium-free reaction buffer and a separate tube of 25 mM MgCl2. For these enzymes, you can optimize the Mg 2+ concentration for each reaction. and Advantage 2 DNA polymerases are magnesium-tolerant polymerases that are supplied with buffers containing 3.5 mM of MgCl2.
  • The final concentration of Mg 2+ for PrimeSTAR GXL DNA Polymerase and PrimeSTAR MAX DNA Polymerase reactions is 1 mM this concentration increases fidelity for these enzymes.

What is the role of salt in PCR reactions?

Successful PCR requires that the DNA duplex separates during the denaturation step and that primers anneal to the denatured DNA. Salt neutralizes the negative charges on the phosphate backbone of DNA, stabilizing double-stranded DNA by offsetting negative charges that would otherwise repel one another. Potassium chloride (KCl) is normally used in PCR amplifications at a final concentration of 50 mM. To improve amplification of DNA fragments, especially fragments between 100 and 1,000 bp, a KCl concentration of 70&ndash100 mM is recommended. For amplification of longer products, a lower salt concentration appears to be more effective, whereas amplification of shorter products occurs optimally with higher salt concentrations. This effect is likely because high salt concentration preferentially permits denaturation of short DNA molecules over long DNA molecules.

It is important to note that a salt concentration above 50 mM can inhibit Taq polimerasas.

Takara Bio USA, Inc.
United States/Canada: +1.800.662.2566 &bull Asia Pacific: +1.650.919.7300 &bull Europe: +33.(0)1.3904.6880 &bull Japan: +81.(0)77.565.6999
FOR RESEARCH USE ONLY. NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES. © 2021 Takara Bio Inc. All Rights Reserved. All trademarks are the property of Takara Bio Inc. or its affiliate(s) in the U.S. and/or other countries or their respective owners. Certain trademarks may not be registered in all jurisdictions. Additional product, intellectual property, and restricted use information is available at takarabio.com.

Takara Bio Europe is a member of the Takara Bio Group, a leading life sciences company that is committed to improving the human condition through biotechnology. Through our Takara, Clontech, and Cellartis brands, our mission is to develop high-quality innovative tools and services to accelerate discovery.


Process:

  • Sample preparation
  • Selection of primers
  • Reaction preparation
  • RT-PCR cyclic condition
  • Strand synthesis

Sample preparation:

Instead of DNA, RNA is extracted for the RT-PCR. For extracting the RNA use ready to use RNA extraction kits, it performs better and the yield of the extraction is even good.

We have to extract RNA, not DNA. Care must be taken while extraction as RNase present on every possible surface in a lab. RNase is an enzyme cleaves RNA. Here we are extracting total RNA, not mRNA for gene expression study.

Use ready to use RNA extraction kit to avoid problems in extraction. So use total RNA instead of the only mRNA.

Selection of primers:

1. Random primers:

Random primers are short single-stranded sequences of hexamers or octamers. The random primer binds at the complementary random location on the RNA. It can bind to many types of RNA (tRNA, rRNA or mRNA) and synthesizes the cDNA.

It is used in the RT-PCR particularly for the templates having a huge secondary structure. Random hexamer provides high yield cDNA. However, it can produce truncated cDNA.

The randoms primers work finely for prokaryotic DNA, rRNA, rRNA, and other smaller RNAs. But as it can’t bind to poly-A tail, it is less preferred for eukaryotic RNA amplification.

Smaller fragments of RNA can be easily amplified using randoms primers. 2 to 5 μM concentration of random primers is enough for RT-PCR. Higher concentration can make the reaction ineffective. The hexamer bindings on RNA are shown into the figure below.

2.Oligo (dT) primers:

The oligo (dT) primers are specially designed to amplify the mRNA. As we know that the mRNA has a poly-A tail, the oligo (dT) primers only bind to the poly-A tail of mRNA. Hence it is used to amplify entire mDNA into cDNA. It can even amplify smaller mRNAs as well.

The oligo (dT) primers are 12 to 18 nucleotide long single-stranded DNA which contains one additional nucleotide at the 3′ end to anchor the binding. The anchored (dT) primers prevent the primer slippage and primer denaturation from the poly-A tail.

However, the oligo (dT) primers can not synthesize RNA other than mRNA because the tRNAs, rRNAs, and micro RNA do not have the poly-A tail. 2 to 4 μM concentration of oligo (dT) primers are enough for RT-PCR, usually.

oligo (dT) primer binding on the template mRNA is shown into the figure below,

3.Sequence-specific primers:

The sequence-specific primers are commonly utilized in one-step RT-PCR to amplify a gene of interest. The sequences in the sequence-specific primers are complementary to the sequence of our interest therefore, it can’t amplify other gene regions.

Furthermore, it can only amplify a specific region, a large amount of primary template is need to perform RT-PCR using this type of primers. Due to its high sequence specificity, it is preferred more in gene expression studies.

The sequence-specific primers synthesize only certain regions from the RNA, therefore less amount is recommended to achieve success in the reaction. 0.5 to 1.5 μM concentration is enough for the RT-qPCR.

Nota: If sequence-specific primers and oligo (dT) primers both are used in a single reaction, use the only 1μM each primer.

The figure above shows the specificity of the sequence-specific primers, as it can only bind to the mRNA and cannot binds to gDNA.


Chemical and Synthetic Biology Approaches To Understand Cellular Functions - Part A

Justin M. Thomas , . Jordan L. Meier , in Methods in Enzymology , 2019

2.3.2 Reverse transcription of borohydride-treated RNA

Reverse transcription of sodium borohydride-treated ac4c results in partial incorporation of adenosine in the cDNA strand opposite the reduced ac4C. It should also be noted that reduced ac4C results in partial termination of reverse transcription at or adjacent to its location, often referred to as RT-stops ( Fig. 4 A). Of the reverse transcriptase enzymes screened by our lab TGIRT-III RT (Ingex) produces the highest proportion of full-length to stop product, as well as the most robust C-to-T signature of the RT enzymes screened by our lab ( Fig. 4 B). The following protocol describes the use of TGIRT RT for sequence-defined cDNA generation, which we have used to profile ac4C in model substrates and human 18S rRNA ( Thomas et al., 2018 ).

Dilute RNA from Section 2.2.2 to 100 pg/μL in water for use as template.

Perform TGIRT RT reactions. We typically carry out RT in 20 μL volumes in PCR tubes. Exemplary protocol: combine 4 μL 5 × TGIRT reaction buffer with 200 pg (2 μL) of template, 4 pM DNA primer, 2 μL 50 mM MgCl2 and sufficient ultra-pure water to bring the mixture to 17 μL. Note 1: TGIRT reactions are incubated at 57 °C, higher than many other commercially available reverse transcription enzymes. Therefore, it is essential to design the reverse transcription primer to form a stable duplex with the target sequence at this temperature. Note 2: Fluorophore or radiolabeled primers can be substituted at this step to assess RT stop via primer extension assay ( Fig. 4 )

Heat to 75 °C for 3 min and placed on ice for 1 min to anneal the primer and RNA.

After cooling, add 0.5 μL TGIRT-III, 0.5 μL Rnasin Plus and 100 μL 100 mM DTT. Incubate 20 min at room temperature. Initiate the reverse transcription reaction by adding 1 μL of optimized dNTP mix. In optimization studies we have found that decreasing the dGTP concentration from 500 to 250 μM increases the sensitivity of C-to-T misincorporation. Incubate the reaction for one hour at 57 °C and proceed to PCR amplification step ( Section 2.3.3 ).

Note on additional controls: We recommend performing a reverse transcription reaction in the absence of template to ensure the reagents being used are free from contaminating RNA/DNA. It is also essential to include control reactions that lack RT enzyme for each biological replicate, which allows confirmation that the PCR reaction ( Section 2.3.3 ) is amplifying only cDNA generated through reverse transcription and not contaminating gDNA from other sources.


Materiales y métodos

Coleccion de muestra

The study was approved by the Institutional Human Ethics Committee of All India Institute of Medical Sciences, Bhopal with the waiver of consent as per the “National Ethical Guidelines for Biomedical and Health Research” from Indian Council of Medical Research, a government body which makes and enforces policies of medical research in India. As per the guidelines, a waiver of consent may be granted by institutional ethics committee if the research is done on anonymized biological samples and/or the primary purpose of the research is refinement and improvement of the public health programs. As our study met both these criteria it the waiver of consent was granted. The study was conducted in 2 phases (a) pooled testing of simulated 5-sample pools, and (b) comparative evaluation of individualized and 4-sample pooled testing strategies. Nasopharyngeal and/or oropharyngeal swabs samples from COVID-19 suspects were collected by trained healthcare workers in Viral Transport Medium (VTM) and transported at 2–8°C to the Regional Virology Laboratory, All India Institute of Medical Sciences, Bhopal. All samples used in this study were anonymized before being accessed by the research team. For the first phase of the study archived samples were used as described below, while the second phase was undertaken on freshly collected samples.

Simulated pooling of retrospective samples

In order to find out the relative performance of 5-sample pools comprising of varying proportions of positive and negative samples, we randomly chose 50 anonymized positive and 415 negative samples from our departmental repository collected between first week of April and second week of May 2020. These samples were accessed on May 20–27, 2020 for the experiments. We used a web-based random number generator to create simulated pools of different constitutions with positive and negative samples as depicted in Table 1 by mixing 200 μl of each sample in a microfuge tube.

Prospective consecutive pooling

For this part of the study, aliquots of 1000 consecutive samples were anonymized and processed parallelly for individualized and pooled testing in a blinded manner. To evaluate the sensitivity of pooled analysis in two different prevalence settings, 500 samples were collected in June 2020 (scenario 1) and another 500 in August 2020 (scenario 2) from the same geographical region. A total of 250 pools of 4 anonymized consecutive samples each (125 each in June and August 2020) were thus created by mixing 200 μl of each sample and tested for SARS-CoV-2 along with individual samples as described earlier [15].

RRT-PCR for COVID-19 diagnosis

RNA from the simulated pools and the samples of scenario 1 were extracted using MGI kit (BGI Biotechnology, Wuhan, China) as per the manufacturer’s protocol and subjected to COVID-19 diagnosis using Lab Gun® fluorescent rRT-PCR diagnostic kit (Lab Genomics, Suwon-si, Republic of Korea). RNA from samples collected in scenario 2 were extracted using Hi-Media Viral RNA extraction kit (Hi-Media) and rRT-PCR assays were performed using Meril Diagnostic (Vapi, India) and 3B BlackBio Biotech (Bhopal, India) as per the kit protocol.

Calculation of reduction in cost and turnaround time for COVID-19 rRT-PCR test

For calculating the expenditure of rRT-PCR test, cost of nucleic acid extraction kits RT-PCR kits and other laboratory consumables were taken in the account. In a single 96 well PCR plate 93 samples and three controls were run and total time to taken for one run was 6.5 h which included time for sample aliquoting, RNA extraction and performing the PCR.

Estadísticas

The quantification of agreement and bias between the individual Ct value and pool Ct value was determined by Bland-Altman (BA) plot. X-axis of BA plot represented mean Ct value of individual sample and pool while Y-axis represented difference in individual and pool Ct value. We estimated the agreement interval at 95% confidence interval (CI) and each x-y paired observation was colored as per the number of rRT-PCR positive sample(s) in the pool. The ‘BlandAltmanLeh’ and ‘ggplot2’ package with base R software was used to draw the plot.

In the next step the Kendell’s tau coefficient between individual Ct value and pooled Ct value was determined. The reason for choosing Kendell’s tau over other correlation measure (Pearson or Spearman measure) was influenced by the construct of the study where the estimated probability of agreeability (concordance) between the paired individual and pooled Ct value is a major concern. Kendell’s tau, being a distribution-free (independent) non-parametric quantile base measure, seems more robust in this scenario. We used ‘ggpubr’ in R for this purpose. In order to visualize the effect of number of RT-PCR positive samples in 4- and 5-sample pools on Ct value separately, we created the best fit line for nested subgroup as per number of positive samples in both 4-sample and 5-sample pools.


3. Methods

3.1. Isolation of Total RNA

Obtaining high quality and intact RNA is the first and often the most critical step in performing RT-PCR and real-time PCR. RNA is easily degraded since RNase is very hard to inactivate. Several precautions need to be taken to prevent RNA from degradation. People should always wear a clean lab coat, disposable gloves, and change gloves frequently. The bench should be clean. Any aqueous solutions, tubes, and pipettes used for the procedure should be sterile and RNAse-free. To avoid contaminating your sample with RNases, do not talk while processing RNA extraction.

Currently, there are a number of RNA isolation kits commercially available. Although it is convenient, time-saving, and avoids contact with phenol/chloroform using commercially available kits, those kits using silica-membrane spin columns may not be ideal for studies of insoluble nanoparticle since the nanoparticles may clog the membrane pore of the spin column. Therefore, it is important to choose the right reagents or kits for total RNA isolation according to different experiments and specific characteristics of different nanoparticles. In our laboratory, we use TRI Reagent to isolate total RNA for nanoparticle studies. TRI Reagent is a mixture of guanidine thiocyanate and phenol in a monophase solution, which can effectively dissolve DNA, RNA, and protein after homogenization or lysis of tissue samples. It performs well with large or small amounts of tissue or cells. Here, we describe the procedures for isolating total RNA using TRI Reagent according to the manufacturer's instructions (1).

3.1.1. Sample Preparation

Lyse or homogenize the sample (see Notes 1𠄳).

Tissue (see Note 4): homogenize tissue samples in TRI Reagent (1 ml per 50� mg of tissue) in an appropriate homogenizer (see Notes 5 and 6). The volume of the tissue should not exceed 10% of the volume of the TRI Reagent.

Monolayer cells: lyse cells directly on the culture dish or plate (see Notes 7 and 8). Use 1 ml of the TRI Reagent per 10 cm 2 of glass culture plate surface area. After addition of the reagent, the cell lysate should be passed several times through a pipette to form a homogenous lysate (see Note 9).

Suspension cells: isolate cells by centrifugation at 1,000 rpm for 5 min and then lyse in TRI Reagent by repeated pipetting. One milliliter of the reagent is sufficient to lyse 5� × 10 6 animal, plant, or yeast cells, or 10 7 bacterial cells (see Notes 10 and 11).

In order to minimize the possibility of DNA contamination in the RNA extracted by TRI Reagent, after homogenization, centrifuge the homogenate at 12,000 × gramo for 10 min at 2𠄸ଌ to remove the insoluble material (extracellular membranes, polysaccharides, and high molecular mass DNA). The supernatant contains RNA and protein. If the sample had a high fat content, there will be a layer of fatty material on the surface of the aqueous phase that should be removed. Transfer the clear supernatant to a fresh tube.

To ensure complete dissociation of nucleoprotein complexes, allow samples to stand for 5 min at room temperature.

Add 0.2 ml of chloroform (see Note 12) per ml of TRI Reagent used. Cover the sample tightly, shake vigorously for 15 s, and allow to stand for 2� min at room temperature.

Centrifuge the resulting mixture at 12,000 × gramo for 15 min at 2𠄸ଌ.

3.1.2. RNA Isolation

Transfer the colorless upper aqueous phase to a fresh tube and add 0.5 ml of isopropanol per ml of TRI Reagent used in Subheading 3.1.1, step 1 and mix. Allow the sample to stand for 5� min at room temperature (see Note 13).

Centrifuge at 12,000 × gramo for 10 min at 2𠄸ଌ. The RNA precipitate will form a pellet on the side and bottom of the tube.

Remove the supernatant and wash the RNA pellet by adding a minimum of 1 ml of 75% ethanol per 1 ml of TRI Reagent used in sample preparation (see step 1 of Subheading 3.1.1). Vortex the sample and then centrifuge at 7,500 × gramo for 5 min at 2𠄸ଌ (see Notes 14 and 15).

Briefly dry the RNA pellet for 5� min by air-drying or under a vacuum (see Note 16). Add an appropriate volume of molecular grade water to the RNA pellet. To facilitate dissolution, mix by repeated pipetting with a micropipette at 55�ଌ for 10� min (see Note 17).

Measure the concentration of total RNA: in a sterile and RNase-free tube, add 48 μl of molecular grade and nuclease-free water and 2 μl of total RNA from step 3 to make a total volume of 50 μl. Mix well.

Measure the absorbance at 260 and 280 nm with a Spectrophotometer (DU 730 Spectrophotometer, Beckman Coulter, Fullerton, CA) (see Notes 18�). 1A260 unit/ml = 40 μg/ml.

3.2. Reverse Transcription

Reverse transcription involves the synthesis of DNA from RNA by using an RNA-dependent DNA polymerase, the marcha atrás of normal transcription, which is from RNA to DNA. Although there are many kits commercially available for RT, the reverse transcriptase used in those kits usually is M-MLV reverse transcriptase from the Moloney murine leukemia virus or AMV reverse transcriptase from the avian myeloblastosis virus. M-MLV reverse transcriptase is the preferred reverse transcriptase in cDNA synthesis for long messenger RNA (mRNA) templates (ϥ kb) because the RNase H activity of M-MLV reverse transcriptase is weaker than the commonly used AMV reverse transcriptase (2). Since M-MLV reverse transcriptase is less processive than AMV reverse transcriptase, therefore, more units of the M-MLV enzyme are required to generate the same amount of cDNA as in the AMV reaction (2). The following are the basic procedures for RT using M-MLV reverse transcriptase according to the manufacturer's instruction (2).

Preheat a water bath to 70ଌ.

In a sterile RNase-free 0.2 ml PCR tube, add 2 μl of Oligo (dT)18 primer (0.5 μg/μl) and 2 μg of total RNA in a total volume of 15 μl with molecular grade and nuclease-free water (total volume is 17 μl).

Put the PCR tubes which contain the primer and total RNA in a plastic PCR rack (see Note 22), then put the rack in the 70ଌ water bath for 5 min to melt secondary structures within the template.

Cool the samples immediately by putting the tubes on ice to prevent secondary structures from reforming.

In a new sterile RNase-free 0.5 ml tube, mix the following reagents according to the number of samples. Each reaction should contain: 1 μl M-MLV reverse transcriptase, 1.25 μl of 10 mM dNTP, 0.75 μl Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor, and 5 μl of 5× M-MLV reaction buffer (see Notes 23 and 24). Mix gently by flicking the tube, then spin briefly.

Spin the PCR tubes from step 4 briefly to collect the solution at the bottom of the tube and put the tubes back onto the PCR rack.

Add 8 μl of the above mixture (step 5) into each PCR tube, mix gently by flicking the tube, then spin briefly. The total volume in the PCR tube should now be 25 μl.

Put the PCR tubes on to a thermal cycler and incubate at 42ଌ for 60 min (see Note 25), at 94ଌ for 5 min, then keep at 4ଌ (see Note 26).

When finished, the samples can be stored at �ଌ for later PCR experiments.

3.3. Reacción en cadena de la polimerasa

Almost all PCR applications employ a heat-stable DNA polymerase, such as Taq polymerase. There are many DNA polymerases commercially available. Although their efficiency may be different, they are suitable for regular RT-PCR to determine the expression level of mRNA. Some experiments which will use PCR products for cloning purposes, especially those for cloning of promoter region with high G-C content, need to use high fidelity DNA polymerase. The PCR is commonly carried out in a reaction volume of 10� μl in small reaction tubes (0.2𠄰.5 ml volumes) in a thermal cycler. The following is an example of a PCR performed in our laboratory.

In a sterile nuclease-free microcentrifuge tube, mix the following reagents on ice. Each reaction contains: 1 μl of 5 μM each primer, 0.5 μl of 10 mM dNTP, 5 μl of 5× Green GoTaq Buffer, 0.25 μl GoTaq DNA polymerase (5 U/μl), and 16.25 μl of nuclease-free water (total 24 μl) (see Notes 27�). Mix gently by flicking the tube, then spin briefly.

In each PCR tube, add 24 μl of the above mixture to the bottom of the tube.

Add 1 μl of cDNA sample in each PCR tube. Mix gently by flicking the tube, then spin briefly.

Put the PCR tube onto a thermal cycler.

According to the primers and the length of PCR product, set up parameters for PCR (see Notes 30�), then run.

Separate the PCR products by agarose gel electrophoresis and visualize with ethidium bromide (see Notes 35�).

After separation on an agarose gel, PCR products are visualized by Gel Doc XR ( Fig. 1 ) and analyzed by Quantity One.

mRNA expression level of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) by RT-PCR. Total RNA was extracted from human monocytes U937 by using TRI Reagent and reverse transcripted to cDNA by using M-MLV reverse transcriptase (Promega). PCR was performed on a thermal cycler (Mastercycler, Eppendorf) by using GoTaq DNA polymerase (Promega). The PCR products were separated on 1% agarose gel. Housekeeping gene GAPDH was used as internal control. M, 100 bp DNA Ladder (Fisher) (1) cells without any treatment were used as control (2) cells were treated with 5.0 μg/ml of cobalt nanoparticles for 24 h.

To semi-quantify the expression level of mRNA, intensities of target gene products are normalized to that of housekeeping gene to obtain the relative densities.

3.4. Real-Time PCR

Traditional PCR uses agarose gel for detection of PCR amplification at the final phase or endpoint of the PCR (plateau). However, real-time PCR allows for the detection of PCR amplification in the exponential growth phase of the reaction. Theoretically, there is a quantitative relationship between the amount of starting target sample and the amount of PCR product at any given cycle number. Real-time PCR detects the accumulation of amplicon during the reaction. The data is then measured at the exponential phase of the PCR, which makes quantitation of DNA and RNA easier and more precise than traditional methods. There are two methods, which are often used in the laboratory. One is the 5′ nuclease assay in which an oligonucleotide called a TaqMan® Probe is added to the PCR reagent master mix. This probe is designed to anneal to a specific sequence of template between the forward and reverse primers and is also designed with a high-energy dye termed a Reporter at the 5′ end, and a low-energy molecule termed a Quencher at the 3′ end. When this probe is intact and excited by a light source, the Reporter dye's emission is suppressed by the Quencher dye as a result of the close proximity of the dyes. When the probe is cleaved by the 5′ nuclease activity of the enzyme, the distance between the Reporter and the Quencher increases causing the transfer of energy to stop. The fluorescent emissions of the reporter increase and the quencher decrease. An increase in Reporter fluorescent signal is directly proportional to the number of amplicons generated. Another real-time PCR method is by using SYBR Green Dye, which can bind the minor groove of any double-stranded DNA molecule. When SYBR Green dye binds to double-stranded DNA, the intensity of the fluorescent emissions increases. As more double-stranded amplicons are produced, SYBR Green dye signal will increase. The following is an example of real-time PCR by using iQ™ SYBR Green Supermix and performed on an iQ5 multicolor real-time PCR detection system.

Thaw all components used in step 2 at room temperature. Mix vigorously, and centrifuge to collect contents to the bottom of the tubes, then put the tubes on ice.

In a sterile nuclease-free microcentrifuge tube, mix the following reagents on ice. Each reaction contains: 1 μl of 5 μM of each primer, 10 μl of 2× iQ™ SYBR Green Supermix, and 7 μl of nuclease-free water (total 19 μl) (see Notes 38 and 39). Mix gently by flicking the tube, then spin briefly.

In each well of 96-well PCR plate, add 19 μl of the above mixture to the bottom of the tube.

Add 1 μl of cDNA sample in each well (see Note 40). Cover the plate with Microseal® 𠇋” Film (see Note 41).

Mix gently by flicking the tube, then spin the plate briefly.

Put the PCR plate in an iQ5 multicolor real-time PCR detection system.

According to the primers and the length of PCR product, set up parameters for real-time PCR, then run (see Notes 42�).

Analyze the data. If using SYBR Green, there should be only one peak in the melting curve ( Fig. 2 ) (see Note 45).

Real-time PCR for rabbit IL-1β. Rabbit ear skin wound tissues were used for total RNA isolation by TRI Reagent (Sigma) and reverse transcripted to cDNA by using M-MLV reverse transcriptase (Promega). Real-time PCR was performed on an iQ5 multicolor real-time PCR detection system (Bio-Rad) by using 2× iQ™ SYBR Green Supermix (Bio-Rad). (a) The amplification curves (B) the melting curves. Single peak in the melting curve represents that only the real target gene is amplified (C) the PCR standard curve (Color figure online).

In our laboratory, the relative expression level of each gene is calculated as fold dilution (see Note 46) by using a standard curve for each gene. Standard curves are obtained by real-time PCR using 3, 1, and 1 μl of 10-, 100-, and 1,000-fold dilution, respectively, of cDNA obtained from sample without any treatments (see Note 47). The expression level of each gene is then normalized to the relative expression level of housekeeping gene in the same sample.


Applications and Advantages RT-PCR

Applications: The reverse transcriptase PCR analysis is used in many bio-molecular analyses.

RT-PCR is the Golden Standard test for detecting viral infections, including HIV, HPV, SARS, COVID-19 coronavirus, etc.

Diagnosis and identification of microbial diseases

RT-PCR measures viral load and expression in infections

It determines tissue-specific gene expression and measures tissue-specific mutant alleles.

Applied in cancer therapy to monitor response and prognosis to therapy

Gene therapy and gene insertion studies apply RT-PCR techniques

A simple, rapid, cost-effective, and easy to use analysis

Quantitative and qualitative analysis can be done

Requires a smaller amount of sample

Complex electrophoresis after PCR processing is not necessary

Greater specificity and sensitivity


Ver el vídeo: 33min result, New qPCR Detective Solution for DNARNA Release (Agosto 2022).