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5.10C: Oxidación de compuestos de azufre reducidos - Biología

5.10C: Oxidación de compuestos de azufre reducidos - Biología


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La oxidación del azufre implica la oxidación de compuestos de azufre reducido, azufre inorgánico y tiosulfato para formar ácido sulfúrico.

Objetivos de aprendizaje

  • Describe el proceso de oxidación del azufre.

Puntos clave

  • La oxidación del sulfuro ocurre en etapas, y el azufre inorgánico se almacena dentro o fuera de la celda hasta que se necesite.
  • Este proceso de dos pasos se produce porque el sulfuro es un mejor donante de electrones que el azufre inorgánico o el tiosulfato; esto permite translocar un mayor número de protones a través de la membrana.
  • Los organismos oxidantes del azufre generan poder reductor para la fijación de dióxido de carbono a través del ciclo de Calvin usando el flujo de electrones inverso, un proceso que requiere energía y que empuja a los electrones contra su gradiente termodinámico para producir NADH.

Términos clave

  • ciclo de Calvin: Serie de reacciones bioquímicas que tienen lugar en el estroma de los cloroplastos en organismos fotosintéticos.
  • tiosulfato: Cualquier sal o éster de ácido tiosulfúrico.
  • quimiolitoautotrófico: Característica de un microorganismo que obtiene energía de la oxidación de compuestos inorgánicos y carbono de la fijación de dióxido de carbono.

El azufre es un elemento esencial para toda la vida y se usa ampliamente en procesos bioquímicos. En las reacciones metabólicas, los compuestos de azufre sirven como combustibles y materiales respiratorios (alternativos al oxígeno) para organismos simples. El azufre es una parte importante de muchas enzimas y moléculas antioxidantes como el glutatión y la tiorredoxina.

Oxidación de azufre

La oxidación del azufre implica la oxidación de compuestos reducidos de azufre como el sulfuro (H2S), azufre inorgánico (S0) y tiosulfato (S2O2−3) para formar ácido sulfúrico (H2ASI QUE4). Un ejemplo de bacteria oxidante de azufre es Paracoccus.

Generalmente, la oxidación del sulfuro ocurre en etapas, y el azufre inorgánico se almacena dentro o fuera de la celda hasta que se necesite. El proceso de dos pasos ocurre porque el sulfuro es un mejor donante de electrones que el azufre inorgánico o el tiosulfato; esto permite translocar un mayor número de protones a través de la membrana. Los organismos oxidantes del azufre generan poder reductor para la fijación de dióxido de carbono a través del ciclo de Calvin usando el flujo de electrones inverso, un proceso que requiere energía y que empuja a los electrones contra su gradiente termodinámico para producir NADH. Bioquímicamente, los compuestos de azufre reducido se convierten en sulfito (SO2−3) y, posteriormente, sulfato (SO2−4) por la enzima sulfito oxidasa. Algunos organismos, sin embargo, logran la misma oxidación usando una reversión del sistema APS reductasa usado por las bacterias reductoras de sulfato (ver arriba). En todos los casos, la energía liberada se transfiere a la cadena de transporte de electrones para la producción de ATP y NADH. Además de la oxidación aeróbica del azufre, algunos organismos (por ejemplo, Thiobacillus denitrificans) usan nitrato (NO−3) como aceptor terminal de electrones y, por tanto, crecen anaeróbicamente.

Beggiatoa

Un ejemplo clásico de bacteria oxidante de azufre es Beggiatoa, un microbio descrito originalmente por Sergei Winogradsky, uno de los fundadores de la microbiología ambiental. Beggiatoa se puede encontrar en ambientes marinos o de agua dulce. Por lo general, se pueden encontrar en hábitats que tienen altos niveles de sulfuro de hidrógeno. Estos entornos incluyen filtraciones frías, manantiales de azufre, aguas contaminadas con aguas residuales, capas de lodo de lagos y respiraderos hidrotermales cercanos a las profundas. Beggiatoa también se puede encontrar en la rizosfera de las plantas de los pantanos. Durante su investigación en el laboratorio de botánica de Anton de Bary en 1887, el botánico ruso Winogradsky descubrió que Beggiatoa oxidaba sulfuro de hidrógeno (H2S) como fuente de energía, formando gotitas de azufre intracelulares. Winogradsky se refirió a esta forma de metabolismo como inorgoxidación (oxidación de compuestos inorgánicos). El hallazgo representó el primer descubrimiento de litotrofia.

Beggiatoa puede crecer quimioorgano-heterotróficamente al oxidar compuestos orgánicos a dióxido de carbono en presencia de oxígeno, aunque las altas concentraciones de oxígeno pueden ser un factor limitante. Los compuestos orgánicos también son la fuente de carbono para la biosíntesis. Algunas especies pueden oxidar el sulfuro de hidrógeno a azufre elemental como fuente suplementaria de energía (facultativamente litoheterótrofo). Este azufre se almacena intracelularmente. Algunas especies tienen la capacidad de crecimiento quimiolitoautotrófico, utilizando la oxidación de sulfuros para obtener energía y el dióxido de carbono como fuente de carbono para la biosíntesis. En este proceso metabólico, el nitrato almacenado internamente es el aceptor de electrones y se reduce a amoníaco.

Oxidación de sulfuro: 2H2S + O2 → 2S + 2H2O

Las especies marinas autótrofas de Beggiatoa pueden oxidar el azufre intracelular a sulfato. La reducción del azufre elemental ocurre con frecuencia cuando falta oxígeno. El azufre se reduce a sulfuro a costa del carbono almacenado o mediante la adición de gas hidrógeno. Esta puede ser una estrategia de supervivencia para salvar períodos sin oxígeno.


Oxidación de compuestos de azufre inorgánicos por bacterias obligatoriamente organotróficas

Se revisan los nuevos datos obtenidos por el autor y otros investigadores sobre dos grupos diferentes de bacterias estrictamente heterótrofas capaces de oxidar el azufre inorgánico. Entre los heterótrofos marinos y (halo) alcalifílicos cultivables que oxidan los compuestos de azufre (tiosulfato y, mucho menos activamente, azufre y sulfuro elemental) de forma incompleta a tetrationato, representantes de las gammaproteobacterias, especialmente de las Halomonas grupo, dominar. Algunas especies desnitrificantes de este grupo pueden llevar a cabo la oxidación anaeróbica de tiosulfato y sulfuro utilizando óxidos de nitrógeno como aceptores de electrones. A pesar de la baja producción de energía de la reacción de oxidación del tiosulfato a tetrationato, algunos heterótrofos productores de tetrationato pueden utilizarlo para la síntesis de ATP; sin embargo, este potencial no siempre se realiza durante su crecimiento. Otro grupo de bacterias heterótrofas marinas y (halo) alcalifílicas capaces de oxidar completamente los compuestos de azufre a sulfato incluye principalmente a representantes de las alfaproteobacterias que están más estrechamente relacionadas con las bacterias púrpuras sin azufre. Pueden oxidar sulfuro (polisulfuro), tiosulfato y azufre elemental a través de sulfito a sulfato, pero no producen ni oxidan tetrationato. Todas las bacterias heterótrofas formadoras de sulfato investigadas pertenecen a litoheterótrofos, pudiendo obtener energía adicional de la oxidación de compuestos de azufre durante el crecimiento heterótrofo en sustratos orgánicos. También se discuten algunos casos dudosos de oxidación heterotrófica del azufre descritos en la literatura.


Abstracto

Se ha demostrado la viabilidad de reutilizar cenizas de madera como catalizador económico en un proceso de ozonización catalítica. Se demostró que la ozonización catalítica oxida H2S, metanotiol (MT), sulfuro de dimetilo (DMS) y disulfuro de dimetilo (DMDS) a bajas temperaturas (23-25 ​​° C). El proceso oxidó el 25-50% de una corriente de entrada de MT a 70 ppmv sin la formación de DMDS (a diferencia de la ceniza más oxígeno en el aire), oxidó el 90-95% de una corriente de 85 ppmv de DMS y oxidó el 50% de una corriente de 100 Flujo de DMDS ppmv que utiliza 2 g de ceniza de madera a una velocidad espacial de 720 h - 1 utilizando concentraciones de ozono que van de 100 a 300 ppmv. De manera similar, 60-70% de conversión de 70 ppmv H2La corriente S se logró con 2 g de ceniza en 1,1 s sin desactivación catalítica (~ 44 h). La tasa de oxidación general de H2S, DMS y DMDS aumentaron con el aumento de la concentración de ozono contrariamente a la tasa de oxidación de MT, que era independiente de la concentración de ozono. El dimetilsulfóxido y la dimetilsulfona se identificaron como los principales productos finales de la oxidación del DMS, y el SO2 fue el producto final de H2Oxidación de S y MT.

Teléfono del autor para correspondencia: (706)583-0155 fax: (706)542-8806 correo electrónico: [email & # 160protected]


La oxidación reducida del azufre inorgánico favorece el crecimiento autótrofo y mixotrófico de la cepa J10 de Magnetospirillum y Magnetospirillum gryphiswaldense

N2 - Las bacterias magnetotácticas están presentes en la zona de transición óxico-anóxica donde existen gradientes opuestos de oxígeno y azufre y hierro reducidos. El crecimiento de la cepa J10 de Magnetospirillum litoautotrófico no magnetotáctico y su magnetotáctico relativo cercano Magnetospirillum gryphiswaldense se caracterizó en cultivo continuo microaeróbico. Ambas cepas pudieron crecer en condiciones mixotróficas (acetato + sulfuro) y autótrofas (sulfuro o tiosulfato). Las células de crecimiento autótrofo convirtieron completamente el sulfuro o tiosulfato en sulfato y produjeron 7,5 g de peso seco por mol de sustrato a una tasa de crecimiento máxima observada de 0,09 h (-1) para la cepa J10 y 0,07 h (-1) para M. gryphiswaldense. La actividad respiratoria del acetato se reprimió en cultivos autótrofos y también mixotróficos, lo que sugiere que se utilizó acetato como fuente de C en estos últimos. Hemos estimado las proporciones de sustrato utilizado para los procesos de asimilación y evaluado los rendimientos de biomasa por mol de sustrato disimilado. El rendimiento del crecimiento litoheterotrófico usando acetato como fuente de C fue aproximadamente el doble del rendimiento del crecimiento autótrofo y muy similar al rendimiento heterotrófico, lo que demuestra la importancia de los compuestos de azufre reducidos para el crecimiento. En el borrador de la secuencia del genoma de M. gryphiswaldense se identificaron homólogos de genes que codifican un sistema enzimático oxidante parcial de azufre (Sox) y sulfito reductasa disimilatoria inversa (Dsr), que pueden estar implicados en la oxidación de sulfuro y tiosulfato. Magnetospirillum gryphiswaldense es la primera especie magnetotáctica de agua dulce para la que se muestra el crecimiento autótrofo.

AB - Las bacterias magnetotácticas están presentes en la zona de transición óxico-anóxica donde existen gradientes opuestos de oxígeno y azufre y hierro reducidos. El crecimiento de la cepa J10 de Magnetospirillum litoautotrófico no magnetotáctico y su magnetotáctico relativo cercano Magnetospirillum gryphiswaldense se caracterizó en cultivo continuo microaeróbico. Ambas cepas pudieron crecer en condiciones mixotróficas (acetato + sulfuro) y autótrofas (sulfuro o tiosulfato). Las células de crecimiento autótrofo convirtieron completamente el sulfuro o tiosulfato en sulfato y produjeron 7,5 g de peso seco por mol de sustrato a una tasa de crecimiento máxima observada de 0,09 h (-1) para la cepa J10 y 0,07 h (-1) para M. gryphiswaldense. La actividad respiratoria del acetato se reprimió en cultivos autótrofos y también mixotróficos, lo que sugiere que se utilizó acetato como fuente de C en estos últimos. Hemos estimado las proporciones de sustrato utilizado para los procesos de asimilación y evaluado los rendimientos de biomasa por mol de sustrato disimilado. El rendimiento del crecimiento litoheterotrófico usando acetato como fuente de C fue aproximadamente el doble del rendimiento del crecimiento autótrofo y muy similar al rendimiento heterotrófico, lo que demuestra la importancia de los compuestos de azufre reducidos para el crecimiento. En el borrador de la secuencia del genoma de M. gryphiswaldense se identificaron homólogos de genes que codifican un sistema enzimático oxidante parcial de azufre (Sox) y sulfito reductasa disimilatoria inversa (Dsr), que pueden estar implicados en la oxidación de sulfuro y tiosulfato. Magnetospirillum gryphiswaldense es la primera especie magnetotáctica de agua dulce para la que se muestra el crecimiento autótrofo.


Oxidación de hierro

El hierro férrico es un aceptor de electrones terminal anaeróbico, con la enzima final una reductasa de hierro férrico.

Objetivos de aprendizaje

Resume el propósito de la oxidación del hierro y los tres tipos de microbios ferrosos oxidantes del hierro (acidófilos, microaerófilos y bacterias fotosintéticas anaeróbicas).

Conclusiones clave

Puntos clave

  • El hierro ferroso es una forma soluble de hierro que es estable a pH extremadamente bajos o en condiciones anaeróbicas. En condiciones aeróbicas, de pH moderado, el hierro ferroso se oxida espontáneamente a la forma férrica (Fe3 +) y se hidroliza abióticamente a hidróxido férrico insoluble (Fe (OH) 3).
  • Tres tipos distintos de microbios oxidantes de hierro ferroso: acidófilos, microaerófilos que oxidan el hierro ferroso a pH cirum neutro, bacterias fotosintéticas anaeróbicas que utilizan hierro ferroso para producir NADH para la fijación autótrofa de dióxido de carbono.
  • Aunque el hierro férrico es el aceptor de electrones inorgánicos más frecuente, varios organismos pueden utilizar otros iones inorgánicos en la respiración anaeróbica.

Términos clave

  • autótrofo: Cualquier organismo que pueda sintetizar su alimento a partir de sustancias inorgánicas, utilizando el calor o la luz como fuente de energía.
  • heterótrofo: Un organismo que requiere un aporte externo de energía en forma de alimento ya que no puede sintetizar el suyo propio.

El hierro férrico (Fe 3+) es un aceptor de electrones terminal anaeróbico extendido tanto para organismos autótrofos como heterótrofos. El flujo de electrones en estos organismos es similar al del transporte de electrones, que termina en oxígeno o nitrato, excepto que en los organismos reductores de hierro férrico, la enzima final de este sistema es una reductasa de hierro férrico. Los organismos modelo incluyen Shewanella putrefaciens y Geobacter metalireducens. Dado que algunas bacterias reductoras de hierro férrico (por ejemplo, G. metallireducens) pueden usar hidrocarburos tóxicos como el tolueno como fuente de carbono, existe un interés significativo en usar estos organismos como agentes de biorremediación en acuíferos contaminados ricos en hierro férrico.

Bacterias de hierro: Los efectos comunes del exceso de hierro en el agua son un color marrón rojizo y ropa manchada. Las bacterias del hierro son una parte natural del medio ambiente en la mayor parte del mundo. Estos microorganismos combinan hierro o manganeso disuelto con oxígeno y lo utilizan para formar depósitos de color óxido. En el proceso, las bacterias producen una baba marrón que se acumula en las rejillas de los pozos, las tuberías y los accesorios de plomería. Las bacterias que se sabe que se alimentan de hierro son Thiobacillus ferrooxidans y Leptospirillum ferrooxidans.

El hierro ferroso es una forma soluble de hierro que es estable a pH extremadamente bajos o en condiciones anaeróbicas. En condiciones aeróbicas, de pH moderado, el hierro ferroso se oxida espontáneamente a la forma férrica (Fe 3+) y se hidroliza abióticamente a hidróxido férrico insoluble (Fe (OH)3). Hay tres tipos distintos de microbios oxidantes de hierro ferroso. Los primeros son acidófilos, como las bacterias Acidithiobacillus ferrooxidans y Leptospirillum ferrooxidans, así como el arqueón Ferroplasma. Estos microbios oxidan el hierro en ambientes que tienen un pH muy bajo y son importantes en el drenaje ácido de las minas. El segundo tipo de microbios oxida el hierro ferroso a un pH neutro. Estos microorganismos (por ejemplo, Gallionella ferruginea o Leptothrix ochracea) viven en las interfaces óxicas-anóxicas y son microaerófilos. El tercer tipo de microbios oxidantes de hierro son las bacterias fotosintéticas anaeróbicas como Rhodopseudomonas, que utilizan hierro ferroso para producir NADH para la fijación autótrofa de dióxido de carbono. Bioquímicamente, la oxidación aeróbica del hierro es un proceso energéticamente muy pobre que, por lo tanto, requiere que la enzima rusticianina oxide grandes cantidades de hierro para facilitar la formación de la fuerza motriz del protón. Al igual que la oxidación del azufre, el flujo de electrones inverso debe usarse para formar el NADH usado para la fijación de dióxido de carbono a través del ciclo de Calvin.

Aunque el hierro férrico es el aceptor de electrones inorgánicos más frecuente, varios organismos (incluidas las bacterias reductoras de hierro mencionadas anteriormente) pueden utilizar otros iones inorgánicos en la respiración anaeróbica. Si bien estos procesos pueden ser a menudo menos importantes desde el punto de vista ecológico, son de considerable interés para la biorremediación, especialmente cuando se utilizan metales pesados ​​o radionúclidos como aceptores de electrones. Ejemplos incluyen:

  • Reducción de iones mangánicos (Mn 4+) a iones manganosos]] (Mn 2+)
  • Selenate (SeO2 −4) reducción a selenita (SeO2 −3) y reducción de selenito a selenio inorgánico (Se0)
  • Arseniato (AsO3 −4) reducción a arsenito (AsO3 −3 )
  • Ion iónico uranilo (UO2 +2) reducción a dióxido de uranio (UO2)

5.10C: Oxidación de compuestos de azufre reducidos - Biología

La respiración aeróbica, la reducción de oxígeno molecular (O 2) junto con la oxidación de compuestos reducidos como carbono orgánico, hierro ferroso, compuestos de azufre reducido o hidrógeno molecular mientras se conserva energía para impulsar los procesos celulares, es el metabolismo más generalizado y bioenergéticamente favorable. en la Tierra hoy. La respiración aeróbica es esencial para el desarrollo de la vida multicelular compleja, por lo que la presencia de abundante O 2 es una métrica importante para la habitabilidad planetaria. El O 2 en la Tierra es suministrado por la fotosíntesis oxigénica, pero cada vez se comprende más que los procesos abióticos pueden suministrar cantidades significativas de O 2 en otros mundos. La atmósfera moderna y el registro de rocas de Marte sugieren una historia de O 2 relativamente alto como resultado de procesos fotoquímicos, que potencialmente se superponen con el rango de concentraciones de O 2 utilizadas por la biología. Europa puede haber acumulado altas concentraciones de O 2 en su océano subsuperficial debido a la radiólisis del hielo de agua en su superficie. Los recientes esfuerzos de modelado sugieren que el agua y el O 2 coexistentes pueden ser comunes en los exoplanetas, y la confirmación de las mediciones de las atmósferas de los exoplanetas podría llegar pronto. En todos estos casos, el O 2 se acumula a través de procesos abióticos, independientemente de la fotosíntesis oxidante del agua. Presumimos que el O 2 abiogénico puede mejorar la habitabilidad de algunos ambientes planetarios, permitiendo una respiración aeróbica altamente energética y potencialmente incluso el desarrollo de vida multicelular compleja que depende de él, sin la necesidad de desarrollar primero la fotosíntesis oxigenada. Esta hipótesis es comprobable con más esfuerzos de exploración y detección de vida en mundos ricos en O 2 como Marte y Europa, y con la comparación con mundos pobres en O 2 como Encelado. Esta hipótesis sugiere además una nueva dimensión de la habitabilidad planetaria: "Siga el oxígeno", en el que los entornos con oportunidades para metabolismos ricos en energía, como la respiración aeróbica, se dirigen preferentemente a la investigación y la detección de vida.


La proteína TusA

TusA (cd00291) es una proteína de ∼8 kDa altamente conservada y ampliamente distribuida que puede encontrarse como una sola proteína o fusionarse con otras proteínas como las cisteína desulfurasas o rodanesas 4, 24, 25. TusA ha sido ampliamente estudiado tanto estructural como funcionalmente 25, 26. Todas las proteínas TusA contienen un motivo de secuencia Cys-Pro-X-Pro común en la región N-terminal con la cisteína de unión al azufre como elemento central 4, 11, 25. En E. coli, el motivo contiene un residuo de glutamato en la posición "X", que se reemplaza por un residuo hidrofóbico (más a menudo leucina, a veces isoleucina o metionina) o glicina en las proteínas de los oxidantes de azufre 4. Está surgiendo evidencia de que el aminoácido no conservado en el motivo es un elemento decisivo para la interacción de TusA con sus diversas proteínas asociadas posibles 4, 24. TusA solo es incapaz de movilizar azufre del tiosulfato o persulfuros orgánicos de bajo peso molecular como el persulfuro de glutatión (GSSH ref. 4).

Para E. coli, está bien establecido que TusA funciona como un mediador de azufre para la síntesis de 2-tiouridina de la base oscilante modificada 5-metil-aminometil-2-tiouridina [(mnm) 5 s 2 U] en tRNA 27. En los últimos años, se han asignado varios roles adicionales a TusA. A tusA-deficiente E. coli Se encontró que la cepa formaba células filamentosas debido a un grave deterioro de la formación del anillo FtsZ 28, 29. Además, TusA junto con TusBCD y TusE parece jugar un papel en el mantenimiento del estado redox intracelular 30, y se ha sugerido que TusA está involucrado en la transferencia de azufre para la síntesis de molibdopterina y también en la regulación equilibrada de la disponibilidad. de IscS a varias biomoléculas en E. coli 24. En conjunto, todos estos hallazgos indican un papel pleiotrópico de TusA en E. coli que implica una interacción específica con varios socios proteicos diferentes 24.

Los análisis bioinformáticos y el perfil transcriptómico proporcionaron los primeros indicios de que el papel de TusA en bacterias distintas de E. coli no se limita a los procesos biosintéticos. En varios oxidantes de azufre, incluidos Acidithiobacillus ferrooxidans, Metallosphaera sedula, y la bacteria azufre púrpura Alochromatium vinosum, niveles relativos de ARNm para tusA fueron significativamente mayores en condiciones de oxidación de azufre que en ausencia de compuestos de azufre reducido 22, 31-33. Un A. vinosum cepa deficiente de la rhd-tusA-dsrE2 genes se vio afectada en su capacidad para degradar el azufre de valencia cero formado durante la oxidación de sulfuro y tiosulfato 4. El papel eminentemente importante de TusA se destaca aún más por el hallazgo de que TusA se encuentra entre las proteínas más abundantes en A. vinosum células cultivadas fotolitoautotróficamente en compuestos de azufre reducido (Fig.2 ref. 34). En estas células, las enzimas implicadas en la fijación de dióxido de carbono (RubisCo, fosforribuloquinasa), la fotosíntesis (complejos captadores de luz) y la conservación de energía (subunidades de ATP sintasa) son muy abundantes. Además, las enzimas del metabolismo oxidativo del azufre como el flavocitocromo C La sulfuro deshidrogenasa (FccAB), DsrA y DsrC y los componentes del sistema Sox dominan entre las proteínas de mayor rango. Es intrigante que incluso SoxYZ y DsrC, las proteínas donantes de sustrato de azufre en los sistemas Sox y Dsr, respectivamente, sean superadas en número por TusA (Fig. 2).

Las 150 proteínas más abundantes en A. vinosum cultivado con azufre como donante de electrones. Las proteínas se clasifican de acuerdo con la proporción de sus coincidencias de espectro de péptidos y el número de aminoácidos, evitando así una subestimación de las proteínas pequeñas y la sobreestimación de las grandes. Se distinguieron proteínas pertenecientes a cinco grupos funcionales: conservación de energía (azul) metabolismo C (verde) expresión génica, replicación y chaperonas (gris) fotosíntesis (rojo) y metabolismo del azufre (amarillo). Datos tomados de la ref. 34.


Discusión

Este estudio proporciona la primera evidencia molecular de que diversos genes del metabolismo energético del azufre están presentes y transcritos activamente en el S. velum población simbionte bajo en el lugar condiciones. El metatranscriptoma contenía transcripciones de bacterias que codifican genes de varias vías primarias de oxidación del azufre, incluido el complejo sulfito reductasa disimilatorio inverso (Dsr) para la oxidación del azufre a sulfito, la vía de la adenosina-5 & # x02032 -fosfato (APS) reductasa para la oxidación del sulfito y la vía vía de oxidación del azufre (Sox) que media la oxidación del tiosulfato. En total, los genes de oxidación del azufre identificados aquí (norte & # x0003D 28 Figura 4) representó el 6,6% de las lecturas de codificación de proteínas de las bacterias en el conjunto de datos (1 de cada 15 secuencias). Varios genes que codifican enzimas para la oxidación de sulfuros y tiosulfatos, incluido el dsr genes y SAT (ATP sulfurilasa), se encontraban entre los principales genes de referencia más abundantes (es decir, números de acceso únicos) detectados en el estudio (Figura 3). Muchos de estos estaban más estrechamente relacionados con homólogos de gammaproteobacterias oxidantes de azufre conocidas (Figuras 1 & # x020133), en particular A. vinosum y Endoriftia persephone, el simbionte del gusano tubular Riftia pachyptila, en consonancia con la ubicación filogenética de la Solemya simbionte dentro de este grupo (Eisen et al., 1992 Distel, 1998). Sorprendentemente, un solo gen de referencia, el previamente caracterizado cbbL gen que codifica la subunidad grande del CO2 enzima de fijación RubisCO (ribulosa 1,5-bisfosfato carboxilasa & # x02013oxigenasa) del S. velum symbiont, representó más del 4% de todas las lecturas de codificación de proteínas (Figura 3). La gran abundancia de transcripciones para las enzimas de oxidación de compuestos de azufre y fijación de carbono sugiere que la tioautotrofia dominaba el metabolismo de la comunidad simbionte en el momento de la recolección a principios del invierno.

Los genes de la vía Dsr inversa se encontraban entre los más expresados ​​en el metatranscriptoma simbionte (Figuras 3 y 4). En bacterias reductoras de sulfato y arqueas, la sulfito reductasa disimilatoria (DsrAB) media la reducción de sulfito a sulfuro (Klein et al., 2001 Wagner et al., 2005). Se han aislado homólogos de DsrAB de una amplia variedad de taxones oxidantes de azufre (Loy et al., 2009), en los que se cree que las enzimas operan en la dirección oxidativa junto con un conjunto diverso de proteínas accesorias, incluido el complejo transmembrana DsrMKJOP , las moléculas lanzadera de azufre DsrEFH y DsrC, y la flavoproteína citoplasmática DsrL (Dahl et al., 2005 Ghosh y Dam, 2009), todas las cuales fueron detectadas en el Solemya transcriptoma simbionte (Figura 4). Se ha sugerido que el sulfuro para la oxidación por el complejo DsrAB se libera mediante la reducción de una molécula portadora de polisulfuro, catalizada por la actividad NADH: (aceptor) oxidorreductasa de DsrL (Dahl et al., 2005), que se ha demostrado que ser crítico para la oxidación del azufre en A. vinosum (Lubbe et al., 2006). En esta especie, la molécula portadora puede ser un perthiol orgánico involucrado en llevar azufre elemental almacenado (glóbulos de azufre) desde el periplasma al citoplasma (Frigaard y Dahl, 2009). Glóbulos de azufre almacenados en A. vinosum se producen durante el crecimiento en sulfuro por enzimas que incluyen FccAB y Sqr o mediante la actividad de la vía Sox durante el crecimiento en tiosulfato (Frigaard y Dahl, 2009 Ghosh y Dam, 2009). Curiosamente, la deposición de glóbulos de almacenamiento de azufre, aunque es común en otros simbiontes tioautotróficos (p. Ej., Endoriftia persephone), no se ha observado en Solemya, lo que sugiere un recambio potencialmente rápido de compuestos de azufre elemental por un sistema Dsr activo. Si bien las funciones exactas de las enzimas Dsr aún no se han confirmado en el Solemya symbiont, nuestros datos indican un papel destacado de la oxidación del azufre a sulfito en esta simbiosis.

De acuerdo con este hallazgo, las transcripciones que codifican la vía APS para la oxidación del sulfito fueron abundantes en el conjunto de datos. Uso de la vía APS por Solemya Los simbiontes se establecieron previamente mediante ensayos enzimáticos que mostraban la actividad de APS reductasa (AprAB) y ATP sulfurilasa (SAT Chen et al., 1987). Juntas, estas enzimas catalizan la oxidación de sulfito a APS dependiente de AMP y la posterior conversión de APS a sulfato que genera ATP (Figura 4). Aquí, las transcripciones codificantes de AprAB y SAT representaron un 1,5% combinado de todas las lecturas de bacterias codificadoras de proteínas. Además, las transcripciones que codifican el ancla transmembrana AprM se detectaron en baja abundancia. En otros taxones de bacterias, el transporte de electrones desde la APS reductasa citoplásmica al grupo de quinol / quinona de la membrana está mediado por interacciones con AprM, que es más común en los oxidantes de azufre gammaproteobacterianos (p. Ej., A. vinosum), o el complejo redox unido a membrana funcionalmente asociado QmoABC, común en las bacterias verdes de azufre del orden Chlorobiales (Meyer y Kuever, 2007). Aquí, detección de aprM pero no qmoABC transcripciones es consistente con la ubicación de la Solemya simbionte entre las Gammaproteobacteria. Juntos, estos datos sugieren un complejo de oxidación de sulfito funcional en esta simbiosis.

La detección de transcripciones que coinciden con genes de la vía Sox también confirmó un papel activo para la oxidación del tiosulfato en S. velum simbiontes. La vía Sox (oxidación de azufre) media la oxidación de tiosulfato a sulfato en una variedad de bacterias oxidantes de azufre no fotosintéticas y fotosintéticas (Frigaard y Dahl, 2009 Ghosh y Dam, 2009 Sakurai et al., 2010). La vía ha sido ampliamente estudiada en Alphaproteobacterium. Paracoccus pantotrophus, en el que 15 genes soxRSVWXYZABCDEFGH comprenden el sox operón (Friedrich et al., 2001, 2005 Rother et al., 2001). De estos, siete genes (soxABCDXYZ) codifican las proteínas sox periplásmicas centrales, SoxB, SoxXA, SoxYZ y SoxCD, con SoxYZ actuando como la molécula portadora principal en cada paso de la ruta (Friedrich et al., 2001 Figura 4). Análisis de la S. velum el metatranscriptoma symbiont reveló transcripciones que coinciden con dos genes sox periféricos (soxHW) en baja abundancia y cinco de los siete genes centrales sox (soxABXYZ) en abundancias más altas (Figura 4). Las transcripciones que codifican la azufre deshidrogenasa SoxCD no se detectaron en nuestro análisis, lo que coincide con la ausencia de estos genes en los genomas de una variedad de bacterias de azufre verdes y púrpuras, incluidas A. vinosum y los endosimbiontes de almejas y gusanos tubulares de aguas profundas (Frigaard y Dahl, 2009 Harada et al., 2009). Alternativamente, es posible que soxC y soxD están presentes en el genoma del simbionte, pero no se transcribieron (por encima del nivel de detección) en el momento de la recolección. En organismos que carecen soxCD, el átomo de azufre del intermedio de sulfano (SoxYZ-S-SH, Figura 4) se transfiere a otros sustratos aceptores (RSnorteH & # x02212 y & # x02212 HSnorte & # x02212 en la Figura 4) y eventualmente en los glóbulos de almacenamiento de azufre, o ingresa a otras vías de oxidación del azufre (Sauve et al., 2007 Frigaard y Dahl, 2009). La deposición de glóbulos de azufre elemental aún no se ha demostrado para S. velum. Sin embargo, el potencial de almacenamiento de glóbulos en concentraciones variables de tiosulfato o sulfuro aún no se ha explorado exhaustivamente.

Trascendencia

Nuestros datos de metatranscriptoma indican el uso de diversas vías para la oxidación de sulfuro y tiosulfato por S. velum simbiontes en condiciones ambientales, consistente con experimentos previos que muestran que ambos sustratos estimulan la fijación de carbono simbionte (Cavanaugh, 1983 Scott y Cavanaugh, 2007). La utilización de múltiples vías de oxidación del azufre no es inusual entre las bacterias tioautotróficas y probablemente esté relacionada con la disponibilidad de sustrato (Ghosh y Dam, 2009). Para los endosimbiontes de las almejas de aguas profundas, que comparten un complemento de genes de oxidación del azufre similar al de S. velum simbiontes (Kuwahara et al., 2007 Newton et al., 2007), se ha argumentado que la capacidad de oxidar tanto el tiosulfato (sistema Sox) como el sulfuro (Dsr, Sqr / Fcc) está relacionada con la abundancia relativa de estos compuestos en el microhábitat de la almeja (grietas basálticas y fisuras en zonas de ventilación de flujo difuso Harada et al., 2009). Por el contrario, el endosimbionte del gusano tubular Riftia pachyptila supuestamente carece de la vía de los Sox (Markert et al., 2007 Robidart et al., 2008), lo que puede reflejar una adaptación a una mayor dependencia del sulfuro en las zonas que rodean a los fumadores negros donde ocurre esta simbiosis (Nelson y Fisher, 1995 Harada et al. ., 2009).

Para S. velum, la abundancia relativa de especies de azufre reducido disponibles para la oxidación de simbiontes no se ha caracterizado directamente. El bivalvo huésped vive en lodos costeros, ubicándose en la convergencia de una madriguera en forma de Y (Levinton, 1977) donde puede acceder al agua anóxica desde la parte inferior del sedimento. Es probable que esta agua esté enriquecida en sulfuro, pero también puede contener tiosulfato, tal vez como resultado de la oxidación química del sulfuro durante la ventilación de la madriguera (Howarth et al., 1983 Elsgaard y Jorgensen, 1992). Alternativamente, el tiosulfato también puede estar disponible a través de la oxidación de sulfuro por las mitocondrias del huésped, como se ha demostrado en el congénere del Pacífico. S. reidi (Obrien y Vetter, 1990). Aunque tanto el sulfuro como el tiosulfato pueden alimentar la autotrofia simbionte, el sulfuro tiene un efecto mucho más fuerte (siete veces) en las tasas de fijación de carbono en S. velum simbiontes (Scott y Cavanaugh, 2007), lo que sugiere que la simbiosis está adaptada para utilizar el sulfuro de manera más eficiente.

Nuestros datos de transcriptoma, que muestran la abundancia relativa de transcripciones en las vías Dsr y Sqr / Fcc (Figura 4), indican potencialmente un papel dominante para el metabolismo de sulfuros en el S. velum simbiosis. Sin embargo, es posible que la abundancia de transcripciones no esté estrechamente relacionada con la abundancia de proteínas o la actividad enzimática (Taniguchi et al., 2010) y se debe interpretar como un sustituto de la actividad metabólica sin datos bioquímicos de apoyo. In other endosymbioses, namely those involving deep-sea hydrothermal vent clams, diverse sulfur pathways (Sox, Dsr, APS) have been shown to be constitutively expressed under variable environmental conditions (e.g., oxygen concentration (Harada et al., 2009). However, compared to gene expression in the relatively stable environment of the deep sea, expression of S. velum symbiont genes, and the relative reliance on diverse reduced sulfur sources, may be more stochastic given the potential for diel and seasonal variation in the coastal environment.

Metatranscriptomics can now provide a comprehensive molecular framework for interpreting physiochemical measurements of metabolism in uncultured symbionts. Such analyses can be easily integrated into studies exploring the links between sulfur availability, environmental conditions, and symbiont gene expression. Our study confirms that genes of sulfur energy metabolism are a dominant component of the transcriptionally active symbiont gene pool in S. velum. Future experiments will help determine the extent to which genes of thioautotrophy co-vary with other metabolic pathways in the transcriptome (Dmytrenko et al., in preparation) and with the biochemical transformations of sulfur mediated by this model symbiosis.


Información del autor

These authors contributed equally: Kristopher Kieft, Zhichao Zhou.

Afiliaciones

Department of Bacteriology, University of Wisconsin–Madison, Madison, WI, USA

Kristopher Kieft, Zhichao Zhou & Karthik Anantharaman

Biology Department, Carleton College, Northfield, MN, USA

Department of Microbiology, University of Tennessee, Knoxville, TN, USA

Department of Biological Sciences, Life Science Facility, Clemson University, Clemson, SC, USA

Department of Microbiology & Immunology, University of British Columbia, Vancouver, BC, Canada

Graduate Program in Bioinformatics, University of British Columbia, Genome Sciences Centre, Vancouver, BC, Canada

Genome Science and Technology Program, University of British Columbia, Vancouver, BC, Canada

Life Sciences Institute, University of British Columbia, Vancouver, BC, Canada

ECOSCOPE Training Program, University of British Columbia, Vancouver, BC, Canada

Department of Animal Science, University of California Davis, Davis, CA, USA

Department of Microbiology, The Ohio State University, Columbus, OH, USA

Groupe de recherche interuniversitaire en limnologie, Department of Biology, Concordia University, Montréal, QC, Canada

DOE Joint Genome Institute, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA, USA

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Contribuciones

K.K., Z.Z., S.R., and K.A. diseñó el estudio. K.K. and S.R. identified the genomes. K.K., Z.Z., and K.A. conducted the analyses. K.K., Z.Z., and K.A. drafted the manuscript. All authors (K.K., Z.Z., R.E.A., A.B., B.J.C., S.J.H., M.H., M.B.S., D.A.W., S.R., and K.A.) reviewed the results, revised, and approved the manuscript.

Autor correspondiente


Resultados y discusión

The architecture of the SoxAX complex

The crystal structure of the SoxAX heterodimer with four molecules in the asymmetric unit of a PAG21 cell was solved at 2.5 Å resolution by Fe-multiple wavelength anomalous dispersion (MAD). The structure subsequently was refined at 1.75 Å resolution using data collected from a crystal of space group PAG21212 with a single molecular copy in the asymmetric unit (Table I). The heterodimer seen in the crystal corresponds to the oligomeric state observed in solution by analytical ultracentrifugation studies ( Appia-Ayme et al., 2001). SoxAX is an elongated molecule of approximate dimensions 34 × 36 × 75 Å 3 (Figure 3A and B). The SoxA subunit is organized into two domains each binding a C-type haem with histidine–cysteine axial coordination. These are designated haems 1 and 2, labelled in the order in which the corresponding CXXCH ligand motifs appear in the SoxA sequence. Post-translational modification of the cysteine ligand to haem 2 is apparent and is discussed further below. The single domain SoxX subunit binds a C-type haem with histidine–methionine axial ligands (haem 3) and forms the interface with the C-terminal domain of SoxA. The haem ligands observed in the structure are in agreement with those inferred from previous spectroscopic characterization of oxidized protein samples ( Cheesman et al., 2001). The geometrical arrangement of the haem groups is presented in Table II. The use of cysteinate as a haem iron ligand is unusual, with only cytochromes P450, the CO sensor protein CooA and cystathionine β-synthase previously having been reported to have such a ligand ( Ojha et al., 2000). Indeed, SoxA is the first C-type cytochrome with cysteine haem iron coordination and only the second structurally characterized haemoprotein containing a haem with a cysteine–histidine ligand set, cystathionine β-synthase being the other ( Meier et al., 2001 ).

Recopilación de datos MAD data collection space group PAG21a = 81.2 ÅB = 102.9 Åc = 114.4 Åβ = 110.5° Oxidized, space group PAG21212 a = 66.4 Å B = 87.3 Å C = 71.7Å Reduced, space group PAG21212 a = 65.8 Å B = 87.2 Å C = 71.5 Å
λ1 = 1.729 Å λ2 = 1.741 Å λ3 = 1.000 Å λ = 0.933 Å λ = 0.98 Å
Resolution (Å) 2.5 2.5 2.55 1.75 1.5
Completeness (%) 95.0 (92.2) 94.8 (89.6) 98.2 (88.7) 93.4 (91.4) 99.3 (98.4)
Rsym a a Rsym = ΣΣ|Ii − <I>|/Ii, where <I> is the average of symmetry equivalent reflections and the summation extends over all observations for all unique reflections.
(%)
4.9 (9.1) 5.1 (10.4) 3.1 (5.0) 7.0 (16.8) 4.1 (28.4)
Ranom b b Ranom = Σ|<I+> − <I−>|/Σ|<I+> + <I−>|.
(%)
4.4 (7.1) 3.5 (8.7) 1.8 (5.4)
(<I>/<σI>) >3 (%) 92.9 (82.4) 90.6 (73.9) 96.6 (89.2) 78.7 (44.2) 78.6 (48.4)
Independent reflections 61 072 61 950 58 706 42 647 66 141
Total reflections 903 590 901 411 101 074 262 534 670 264
Overall temperature factor (Å 2 ) 34.7 36.7 36.7 17.8 13.2
SOLVE mean FOM c c Average figure of merit (FOM) calculated by SOLVE ( Terwilliger and Berendzen, 1999 ).
0.74
Refinement statistics PAG21 PAG21212 oxidized PAG21212 reduced
Wavelength (Å) 1.000 0.933 0.98
Resolution range (Å) 20–2.55 20–1.75 25–1.5
Refined structure d d The final structural model for the PAG21 crystal form contained four copies of the indicated residues of SoxA and SoxX in the asymmetric unit
SoxA 1–261, SoxX 1–138, + 691 water SoxA 1–261, SoxX 1–51, 55–137, + 353 water SoxA 1–261, SoxX 1–51, 55–137, + 667 water, + 2 ethylene glycol
Rcryst e e Rcryst = Σ‖F| − |FC‖/Σ|F|.
21.0 (29.6) 17.7 (21.3) 19.9 (23.5)
Rgratis f f For Rgratis, the summations extends over a subset (5%) of reflections excluded from all stages of refinement.
26.4 (36.8) 21.4 (23.0) 23.0 (27.4)
C–N 0.005 0.009 0.005
N–Cα 0.009 0.014 0.008
Cα-C 0.012 0.016 0.009
N–Cα-C 0.88 1.08 1.36
C–N–Cα 1.30 1.77 2.16
Main chain atoms 18.5 16.5 14.4
Side chain atoms 19.1 21.9 17.3
  • Figures in parentheses refer to data in the highest resolution bin.
  • a Rsym = ΣΣ|Ii − <I>|/Ii, where <I> is the average of symmetry equivalent reflections and the summation extends over all observations for all unique reflections.
  • B Ranom = Σ|<I+> − <I−>|/Σ|<I+> + <I−>|.
  • c Average figure of merit (FOM) calculated by SOLVE ( Terwilliger and Berendzen, 1999 ).
  • d The final structural model for the PAG21 crystal form contained four copies of the indicated residues of SoxA and SoxX in the asymmetric unit
  • mi Rcryst = Σ‖F| − |FC‖/Σ|F|.
  • f For Rgratis, the summations extends over a subset (5%) of reflections excluded from all stages of refinement.
Haems 1–2 Haems 2–3
Distance (Fe–Fe) (Å) 31.4 (31.0) 19.0 (18.8)
Distance (closest approach) (Å) 23.9 (23.4) 10.7 (10.6)
Interplanar angle (°) 56.1 (55.1) 80.95 (78.3)
Haem 1 Haem 2 Haem 3
Ligand distances (Å)
Fe–S 2.45 (2.37) 2.41 (2.35) 2.34 (2.43)
Fe–N 2.08 (2.11) 2.08 (2.08) 2.05 (2.07)
Haem solvent accessibility (Å 2 ) 179.2 (179.7) 56.7 (53.3) 80.8 (82.9)
  • The figures in parentheses refer to the average calculated over the four independent molecules of the PAG21 cell.

The haem 2–haem 3 interplanar angle and distance of closest approach together with the haem solvent-accessible areas are consistent with haem 3 being the route for electron transfer away from the complex (Table II). The solvent-exposed edge of haem 3, the presumed locus for cytochrome C2 binding, lies on the opposite face of SoxX from haem 2. The edge–edge separation of haems 1 and 2, in contrast to that between haems 2 and 3, is sufficiently long to preclude efficient electron transfer in the absence of a chain of cofactors ( Page et al., 1999 ). An extended groove runs across the molecule at the subunit interface. This leads to a solvent-filled channel lined with basic residues, at the bottom of which the haem 2 iron atom and modified cysteine ligand lie exposed to solvent (Figure 3C). These observations, together with the post-translational modification to haem 2, led us to identify this haem as the catalytic active site.

The folds of the SoxA and SoxX subunits

The SoxX subunit has a C-type cytochrome fold as defined in the SCOP database ( Holm and Sander, 1993 ). Yeast mitochondrial cytochrome C (PDB entry 1ycc, 108 residues) was found to be most similar, with 82 structurally aligned residues and an r.m.s.d. of 2.3 Å. The SoxX subunit can thus be classified as a member of the mono-domain cytochrome C family ( Murzin et al., 1995 ). Inspection of the SoxA subunit reveals a pronounced internal pseudo-dyad encompassing residues 51–150 and 151–250 for domains that we term SoxAnorte and SoxAC, respectivamente. Alignment of these domains gave an overall r.m.s.d. of 1.8 Å for 93 structurally conserved residues for which the percentage residue identity was 18%. The haem groups in each domain are also well conserved, having an r.m.s.d. of 1.2 Å in this alignment (excluding propionate groups). The folds of these domains are clearly highly homologous and, as was the case for SoxX, each of these A-subunit domains has a C-type cytochrome fold. Again taking the mitochondrial cytochrome C for comparison, the r.m.s.ds are 2.7 and 3.1 Å for the SoxAnorte and SoxAC domains (both 69 aligned residues), respectively. The structure, in conjunction with sequence alignment, suggests that SoxA, apart from the N-terminal 50 amino acids, has evolved from duplication of a cytochrome C gene.

The di-haem SoxA subunit

Like SoxA, proteins of the two-domain cytochrome C family possess a pseudo 2-fold symmetry axis relating the two haem domains ( Murzin et al., 1995 ). However, fold homology searches failed to align the SoxA subunit with members of this family ( Chen et al., 1994 Fülöp et al., 1995 Kadziola and Larsen, 1997 ). As such, SoxA represents the first example of a new family of two-domain cytochromes C in which the packing of the two domains differs radically from the previously characterized examples (Figure 3D). The novel domain arrangement seen in SoxA may arise because a combination of the C-terminal (residues 251–261) and N-terminal polypeptides (residues 1–50) of SoxA block the face of the C-terminal domain that forms the domain interface in the other two-domain cytochrome C proteínas. The result is that in SoxA the two domains pack with their C-terminal α4 helices arranged about the local pseudo 2-fold axis relating the SoxAnorte and SoxAC dominios. A major consequence of this unusual packing is to give a distance of closest approach of the haems in SoxA (24 Å) that is much greater than that seen in the other two-domain cytochrome C proteins (<14 Å). The result is that effective electron transfer between the SoxA haems is precluded.

It is notable that the haem 1 consensus Cys-Xaa-Xaa-Cys-His haem-binding motif is absent from the SoxA proteins of Rhodopseudomonas palustris y de Chlorobium species (Figure 2A). In place of haem 1, an intradomain disulfide bridge is found between the remaining (second) cysteine of the haem-binding motif and the conserved cysteine residue that is a ligand to that haem in R.sulfidophilum SoxA ( Klarskov et al., 1998). However, the α-carbon atoms of these cysteines in the SoxAnorte domain are >10 Å apart, a distance greater than the maximum for a disulfide bridge ( Sowdhamini et al., 1989 ). The question then naturally arises as to whether, nevertheless, the Anorte domain of the R.palustris y Chlorobium sp. SoxA proteins can adopt the cytochrome C fold but substitute a disulfide bridge for the C haem to form a different superfamily. An important observation in this respect is that the haem-less SoxA domains preserve the cluster of hydrophobic residues at positions A61 (6), A65 (10), A134 (94) and A137 (97) (tuna cytochrome C residue numbering in parentheses see Figure 2A) in the N- and C-terminal helices of the fold. These four residues are not involved in haem binding and are conserved in otherwise highly divergent cytochromes C. This, together with the absence of an apparent functional role for these residues, has led to the suggestion that they are involved in a common folding nucleus of all subfamilies of C-type cytochromes ( Ptitsyn, 1998 ). It therefore appears reasonable to conclude that the haem-less SoxAnorte domain in these proteins may adopt a modified cytochrome C pliegue.

The nature of the subunit interface

The SoxAX complex is purified readily from the periplasm of R.sulfidophilum, suggesting a subunit interaction that is both specific and of relatively high affinity ( Appia-Ayme et al., 2001). At present, the complex of yeast cytochrome antes de Cristo1 with cytochrome C ( Lange and Hunte, 2002 ) is the sole example of a crystal structure of a productive electron transfer complex involving two cytochrome C proteínas. Furthermore, there are few examples of stable, structurally characterized homo-oligomeric proteins with the cytochrome C pliegue. Under these circumstances, the nature of the subunit interface in the SoxAX complex is of some interest. In an attempt to determine whether the SoxAC: SoxX packing is structurally unique, the PQS server ( Henrick and Thornton, 1998 ) was used to generate an independent set of stable cytochrome C dimer packings. Adding to these the domain packings observed in the two-domain cytochromes C, a total of 11 independent cytochrome C:cytochrome C domain packings were found. Comparison reveals that the SoxAC:SoxX domain packing bears a passing resemblance to that observed between monomers of the cytochrome C6 from the green alga Chlamydomonas reinhardtii although the relative orientation of the haems is significantly different. It is appropriate to note that there is some evidence that the dimerization of the latter has functional significance ( Kerfeld et al., 1995 ). Notably, there is no similarity between the packing of cytochrome C domains at the SoxAC:SoxX interface and that observed in the yeast cytochrome antes de Cristo1:cytochrome C complex ( Lange and Hunte, 2002 ). Thus, the packings of the C-type cytochrome domains both within SoxA and at the subunit interface are essentially unique. Citocromo C domains are limited in their packing arrangements if the haem groups are to fall within suitable minimum edge–edge distances for electron transfer without the requirement for other cofactors. This requirement is clearly illustrated in the packing of domains within the SoxA subunit.

Analysis of the high resolution structure reveals a subunit interface that is well packed. This is evidenced by the shape complementarity statistic (Sc) ( Lawrence and Colman, 1993 ), which has a value of 0.74 and is consistent with previously compiled statistics on permanent heterodimeric complexes ( Jones and Thornton, 1996 ). Despite being well packed, the interface is also apparently fairly plastic. The largest r.m.s.d. between pairs of high and low resolution structures of the complex is ∼0.6 Å (based on all α-carbon atoms), and this difference can be accounted for in the most part by a rigid body screw domain displacement of SoxX relative to SoxAC of 4° and a translation of 0.2 Å. As is often the case, the root cause of this difference in the SoxAX structures may be attributable to crystal lattice packing contacts. However, whilst the haem edge–edge distances and interplanar angles are not affected greatly by the excursions of the SoxX subunit relative to SoxA (Table II), the observed plasticity at least suggests that conformational changes may occur on binding of SoxYZ. The increased mobility of SoxX is also reflected in the average atomic temperature factor for atoms in this subunit (25.5 Å 2 ) being greater than that for the SoxA subunit (15.1 Å 2 ).

The interface of the complex is predominantly hydrophobic in nature, in keeping with that observed in other stable electron transfer complexes ( Mathews and White, 1993 ). Approximately 2500 Å 2 is buried on complex formation (6.8% of the total accessible surface area), of which apolar and aromatic residues contribute 42%. This buried area is consistent with that observed in other heterodimeric complexes ( Jones and Thornton, 1996 ). The interface is composed of two distinct, non-overlapping contact regions which we label A and B. Four short polypeptide stretches in SoxA form the majority of the interaction surface with SoxX (Figure 2A). Those contributing to region A are 183–184 and 187–191, whilst 168–175 and 224–232 contribute to region B. In SoxX, a number of short polypeptides are involved in forming the interface: residues 37–44 and 55–60 (region A), and residues 89–93 (region B) (Figure 2B). These three polypeptides contribute ∼50% of the total buried surface area of the SoxX subunit in the complex. The remainder comes from residues 101–110 (region B) which form part of a loop extending from the core domain structure to form an intimate association with residues of SoxA. Notably, this interface loop (residues 99–118) constitutes a major insertion in SoxX relative to other members of the cytochrome C superfamily. Interestingly, this loop is also missing in the SoxX proteins from Chlorobium tepidum, Aquifex aeolicus y R.palustris (Figure 2B). In addition, the overall sequence homology of the other contact peptides in SoxX relative to the corresponding regions in the loop-less proteins appears to be low (Figure 2B) and this may have important consequences in terms of the stability of their complexes. It should be noted that the absence of a permanent SoxAX complex in these organisms may imply generation of a means of stabilizing one-electron-oxidized intermediates.

A single midpoint potential using NADH as reductant has been observed for R.sulfidophilum SoxAX with a value of +180 mV that has been assigned to two redox-linked haems ( Little, 2000 ). The packing of SoxAC to SoxX at the subunit interface provides a haem–haem distance of closest approach of 10.7 Å. This distance is marginally shorter than that seen in the di-haem cytochrome C peroxidase (14.5 Å) and the cytochrome C4 protein (11.2 Å) and involves transversing a region of the interface predicted to be solvent accessible. However, electron transfer should be rapid and essentially independent of the environment between the haems for a separation of 14 Å or less ( Page et al., 1999 ). We therefore assume that haems 2 and 3 constitute the redox-linked pair. The haem groups arranged closest by the SoxAC:SoxX packing are the C-pyrrole rings. Several lines of evidence have implicated the exposed edge of the haem pyrrole ring C in electron transfer in C-type cytochromes ( Pelletier and Kraut, 1992 ).

Post-translational modification to catalytic haem ligand

Fourier maps calculated using a fully refined structural model based on the predicted amino acid sequence of SoxA reveal regions of unexplained difference electron density adjacent to the cysteine axial haem ligand to haem 2 in the vicinity of its terminal sulfur atom. El |FoFC| difference electron density peaks are at >5.2σ and 11.5σ from the mean electron density calculated over the volume of the molecule (where σ is the standard deviation of the distribution), indicating the presence of at least one additional atom (Figure 4A). The refined cysteine sulfur to ferric haem iron distance is 2.57 Å in this model. Given the likely geometry of the modified amino acid as indicated by the electron density, cysteine persulfide and cysteine sulfenic acid are the most probable derivatives. There is precedent for both modifications in other protein crystal structures ( Claiborne et al., 1999 Bordo et al., 2000). We attempted to refine both possibilities against our X-ray data with the result that both the cysteine persulfide sulfane sulfur to haem iron distance and the alternative cysteine sulfenic acid terminal oxygen to haem iron distance refined to 2.41 Å. However, whilst the cysteine persulfide form showed only minor residual difference electron density after the modification, the cysteine sulfenic acid residue showed a +7.0σ difference electron density peak in the vicinity of the sulfenic oxygen atom. This strongly suggests that cysteine persulfide is the post-translational modification observed for CysA222. Unfortunately, anomalous difference Fourier maps calculated using the iron K-edge wavelength data set (λ1 in Table I), which could positively identify a terminal sulfane sulfur atom on this residue, were inconclusive due to the proximity of the additional atom to the iron centre. So, in the absence of an unambiguous sulfur anomalous scattering signal, further supportive evidence was sought for this interpretation.



Comentarios:

  1. Nizam

    lo siento, borré este mensaje

  2. Bakazahn

    Me uno. Entonces sucede. Discutamos esta pregunta.

  3. Hanlon

    Es notable, es una pieza muy valiosa

  4. Shelomo

    Creo que estás cometiendo un error. Vamos a discutir. Envíeme un correo electrónico a PM.



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