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¿Cuál es el papel de las RAGEs?

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Según los artículos que leí, los AGE (productos finales de glicación avanzada) activan los RAGE (receptores para los AGE). Esta activación aumenta los niveles de ROS (especies reactivas de oxígeno) en las células.

Los radicales libres pueden dañar las células, lo que definitivamente no es bueno. ¿Qué piensas, cuál es el papel de los RAGE, que es más importante que el daño celular?


Señalización RAGE en biología esquelética

Propósito de la revisión: El receptor de productos finales de glicación avanzada (RAGE) y varios de sus ligandos se han implicado en la aparición y progresión de patologías asociadas con el envejecimiento, la inflamación crónica y el estrés celular. En particular, se ha investigado el papel de RAGE y sus ligandos en el tejido óseo durante condiciones tanto fisiológicas como patológicas. Sin embargo, no está claro hasta qué punto la señalización de RAGE regula la homeostasis ósea y la aparición de la enfermedad. Además, se desconocen los efectos de RAGE en las diferentes células óseas y si estos efectos son específicos del tipo de célula. El objetivo de la revisión actual es describir la literatura sobre la señalización de RAGE en biología esquelética, así como discutir el potencial clínico de RAGE como diana diagnóstica y / o terapéutica en enfermedades óseas.

Hallazgos recientes: Se está empezando a descubrir el papel de RAGE y sus ligandos durante la homeostasis esquelética, la reparación de tejidos y el inicio / progresión de la enfermedad. Por ejemplo, se han identificado efectos perjudiciales de los ligandos de RAGE, productos finales de glicación avanzada (AGE) para la viabilidad / actividad de los osteoblastos, mientras que otros han observado que la exposición a AGE de bajo nivel estimula la autofagia de los osteoblastos, lo que posteriormente promueve la viabilidad y la función. Se han informado hallazgos similares con HMGB1, otro ligando de RAGE, en el que niveles altos del ligando se asocian con apoptosis de osteoblastos / osteocitos, mientras que la administración de niveles bajos / corto plazo estimula la diferenciación de osteoblastos / formación de hueso y promueve la curación de fracturas. Además, los niveles elevados de varios ligandos de RAGE (AGE, HMGB1, proteínas S100) inducen la apoptosis de los osteoblastos / osteocitos y estimulan la producción de citocinas, que se asocia con una mayor diferenciación / actividad de los osteoclastos. Por el contrario, la exposición directa al ligando de RAGE en los osteoclastos puede tener efectos inhibidores. Estas observaciones apoyan la conclusión de que la resorción ósea elevada observada en condiciones de alta expresión de ligandos circulantes y RAGE se debe a acciones sobre osteoblastos / osteocitos en lugar de acciones directas sobre osteoclastos, aunque se requiere trabajo adicional para fundamentar las observaciones. Estudios recientes han demostrado que RAGE y sus ligandos juegan un papel fisiológico importante en la regulación del desarrollo esquelético, homeostasis y reparación / regeneración. Por el contrario, los niveles elevados de RAGE y sus ligandos están claramente relacionados con diversas enfermedades asociadas con una mayor pérdida de masa ósea y fragilidad. Sin embargo, a pesar de los avances recientes en el campo, muchas preguntas sobre RAGE y sus ligandos en biología esquelética siguen sin respuesta.

Palabras clave: Osteoblastos óseos Osteoclastos Osteoporosis Osteoporosis RAGE.

Declaracion de conflicto de interes

Lillian Plotkin, Alyson Essex y Hannah Davis declaran no tener ningún conflicto de intereses.


Revisar

Introducción

El receptor para productos finales de glicación avanzada [RAGE] es un miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas, codificada en la región de clase III del complejo principal de histocompatibilidad [1-4]. Este receptor multiligando tiene un dominio de tipo V, dos dominios de tipo C, un dominio transmembrana y una cola citoplasmática. El dominio V tiene dos sitios de N-glicosilación y es responsable de la mayoría (pero no de todos) de la unión de ligandos extracelulares [5]. Se cree que la cola citoplasmática es esencial para la señalización intracelular, posiblemente uniéndose a diáfano-1 para mediar la migración celular [6]. De hecho, se pensaba que los productos finales de glicación (AGE) originalmente avanzados eran sus principales ligandos activadores, pero desde entonces se han identificado muchos otros ligandos de RAGE, incluidos los patrones moleculares asociados al daño (DAMP) [1, 7, 8]. Por tanto, RAGE se considera un receptor de reconocimiento de patrones (PRR), que tiene una amplia variedad de ligandos [9-11].

RAGE se expresa como formas unidas a la membrana de longitud completa (fl-RAGE o mRAGE, que no deben confundirse con RAGE de ratón) y diversas formas solubles que carecen del dominio transmembrana. El RAGE soluble se produce tanto por escisión proteolítica de fl-RAGE como por empalme de ARNm alternativo. Las isoformas solubles incluyen los dominios extracelulares, pero carecen de los dominios transmembrana y citoplasmático [12-15]. El RAGE soluble derivado específicamente de la escisión proteolítica es sRAGE, aunque esta terminología no es coherente en la bibliografía; sRAGE a veces se refiere a RAGE soluble en general. RAGE se expresa a niveles bajos en una amplia gama de células adultas diferenciadas de una manera regulada, pero en neumocitos de pulmón tipo I maduros se expresa a niveles sustancialmente más altos que en otros tipos de células en reposo. Se expresa altamente en cantidades fácilmente detectables en células embrionarias [16]. RAGE también se expresa en gran medida y se asocia con muchos estados patológicos relacionados con la inflamación, como enfermedades vasculares, cáncer, neurodegeneración y diabetes (Figura 1) [17, 18]. Las excepciones son los tumores pulmonares y la fibrosis pulmonar idiopática, en los que la expresión de RAGE disminuye desde un nivel más alto en el tejido sano [19, 20].

RAGE es fundamental para muchos procesos biológicos fundamentales. Centrarse en RAGE nos permite ver muchos aspectos de la biología celular desordenada y las enfermedades crónicas asociadas. El estrés crónico promueve un amplio espectro de enfermedades a través de la expresión y señalización de RAGE, enfocando la respuesta inflamatoria y reparadora del huésped.

Furia y furia soluble

El ARNm de RAGE humano se somete a un corte y empalme alternativo, al igual que con otras proteínas ubicadas dentro del locus MHC-III en el cromosoma 6. Se detecta una forma soluble con un extremo C-terminal novedoso a nivel de proteína, denominada "RAGE secretora endógena" (esRAGE o RAGE_v1) [21]. Esta forma se detecta por inmunohistoquímica en una amplia variedad de tejidos humanos que no se tiñen para cantidades notables de fl-RAGE [22]. Hasta la fecha se han identificado más de 20 variantes de corte y empalme diferentes para RAGE humano. El corte y empalme de RAGE humano es muy dependiente del tejido, con el ARNm de fl-RAGE más prevalente en las células de músculo liso de pulmón y aorta, mientras que el ARNm de esRAGE prevalece en las células endoteliales. Muchas de las secuencias de corte y empalme son objetivos potenciales de la vía de desintegración mediada por sin sentido (NMD) y, por lo tanto, es probable que se degraden antes de la expresión de la proteína. Varios más carecen de la secuencia señal en el exón1 y, por tanto, la proteína expresada podría estar sujeta a una degradación prematura. Las únicas variantes humanas que se han detectado a nivel de proteínas en vivo Estos son FL-RAGE, sRAGE y esRAGE [17, 22].

El fl-RAGE humano también está sujeto a escisión proteolítica por la metaloproteinasa de membrana ADAM10, liberando el dominio extracelular como una isoforma soluble [12-14]. Los anticuerpos producidos en el nuevo C-terminal de esRAGE no reconocen la isoforma resultante de la escisión proteolítica. En suero, la especie predominante es la escisión proteolítica y no la isoforma de corte y empalme del ARNm [12]. La mejora de la escisión proteolítica aumentará los niveles de RAGE soluble, mientras que la inhibición aumentará los niveles de fl-RAGE. Este proceso de escisión está modulado por los niveles de Ca ++, y después de la escisión proteolítica, el fragmento C-terminal restante unido a la membrana está sujeto a una mayor degradación por la γ-secretasa [13, 14]. La escisión del fragmento C-terminal por la γ-secretasa liberará un dominio intercelular RAGE (RICD) en el espacio citosólico / nuclear. Aunque aún no se ha detectado RICD y presumiblemente se degrada rápidamente, la sobreexpresión de una forma recombinante de RICD aumentará la apoptosis medida por el ensayo TUNEL, lo que indica que el procesamiento de RAGE tiene otra función intercelular [14].

El ARNm de fl-RAGE murino también se somete a un empalme alternativo, y algunos de los productos de empalme son ortólogos de esRAGE [23]. Hasta la fecha se han detectado más de 17 empalmes de ARNm diferentes. Al igual que con las variantes de empalme humano, las variantes de empalme de ratón se expresan de una manera dependiente del tejido y muchas son dianas de NMD. Existen varios patrones de empalme comunes cuando se comparan RAGE en humanos y ratones, aunque las variantes que darían lugar a una isoforma soluble son mucho más raras en ratones [15].

El RAGE recombinante se ha clonado en una variedad de vectores de expresión, y el RAGE soluble nativo se ha purificado de pulmón murino, bovino y humano [24-28]. Una isoforma soluble recombinante adquiere un fenotipo dominante negativo y bloquea la señalización. El RAGE soluble puede actuar como un "receptor señuelo" extracelular, antagonizando el fl-RAGE y otros receptores mediante la unión de DAMP y otros ligandos e inhibiendo el reclutamiento de leucocitos en una variedad de enfermedades inflamatorias agudas y crónicas [4]. Tanto esRAGE como sRAGE actúan como receptores señuelo para el ligando HMGB1 [12]. Sin embargo, el RAGE soluble tiene otras funciones además de bloquear la función fl-RAGE, y ejerce propiedades proinflamatorias a través de la interacción con Mac-1 [10, 29]. Por tanto, aunque el RAGE soluble tiene propiedades protectoras en el contexto de la inflamación crónica, podría describirse mejor como un biomarcador de la inflamación crónica [30, 12]. Aún no se dispone de información sobre los efectos a largo plazo del tratamiento con RAGE soluble exógeno, y aún no se ha demostrado que los niveles plasmáticos de RAGE soluble sean suficientes para actuar eficazmente como receptor señuelo. en vivo [18].

Las dos propiedades diferentes del RAGE soluble (receptor señuelo y proinflamatorio) y las diferentes vías asociadas con su producción podrían explicar por qué existen correlaciones tanto positivas como negativas entre sus niveles en suero humano y la enfermedad. El RAGE soluble total en suero es significativamente menor en los hombres no diabéticos con enfermedad de las arterias coronarias que en los que no la padecen [31]. Según la evaluación de la hipersensibilidad de tipo retardado y la colitis inflamatoria, el RAGE soluble suprimió la inflamación en ratones deficientes en IL-10, redujo la activación de NFκB y redujo la expresión de citocinas inflamatorias [32, 33]. Los ratones knockout para RAGE tienen una capacidad limitada para mantener la inflamación y alterar la elaboración y el crecimiento del tumor. Por lo tanto, RAGE impulsa y promueve respuestas inflamatorias durante el crecimiento tumoral en múltiples etapas y tiene un papel central en la inflamación crónica y el cáncer [34].

Los niveles más bajos de RAGE soluble se encuentran en la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), y los niveles más bajos de esRAGE predicen la mortalidad cardiovascular en pacientes con enfermedad renal en etapa terminal [35, 36]. En pacientes con diabetes tipo 2, los niveles más altos de RAGE soluble se correlacionan positivamente con otros marcadores inflamatorios como MCP-1, TNF-α, AGE y sVCAM-1 [37, 38]. El RAGE soluble total, pero no el esRAGE, se correlaciona con la albuminuria en la diabetes tipo 2 [39]. Curiosamente, aunque los cambios en los niveles séricos humanos de RAGE soluble se correlacionan muy bien con la progresión de patologías relacionadas con la inflamación, en el suero de ratón el RAGE soluble es indetectable [18]. Esto contrasta la importancia del empalme y la escisión proteolítica de las formas solubles de RAGE en ratones y seres humanos [15]. Una advertencia es que, aunque los ensayos ELISA de RAGE soluble en suero muestran una alta precisión y reproducibilidad, los niveles muestran una gran variación (500-3500 ng / L P & lt 0,05) entre donantes por lo demás sanos [40]. Los niveles de RAGE soluble se correlacionan con los niveles de AGE incluso en sujetos no diabéticos [41]. Por tanto, aunque una medición de RAGE soluble puede no ser suficiente para predecir un estado patológico, los cambios en los niveles a lo largo del tiempo podrían predecir el desarrollo de una enfermedad.

La señalización RAGE perpetúa la respuesta inmunitaria e inflamatoria

Una revisión reciente cubre ampliamente el papel de la señalización de RAGE en la diabetes y la respuesta inmune [18]. La activación de múltiples moléculas de señalización intracelular, incluido el factor de transcripción NF-κB, MAP quinasas y moléculas de adhesión, se observa después de la activación de RAGE. El reclutamiento de tales moléculas y la activación de las vías de señalización varían con los ligandos de RAGE individuales. Por ejemplo, HMGB1, S100B, Mac-1 y S100A6 activan el RAGE a través de distintas vías de transducción de señales [42, 43]. Ann Marie Schmidt postuló un modelo de "dos golpes" para la perturbación vascular mediada por RAGE y sus ligandos [9]. Este modelo de "dos impactos" plantea la hipótesis de que el primer "impacto" es una mayor expresión de RAGE y sus ligandos expresados ​​dentro de la vasculatura. El segundo "impacto" es la presencia de diversas formas de estrés (por ejemplo, estrés isquémico, estímulos inmunes / inflamatorios, estrés físico o lipoproteínas modificadas), lo que conduce a una respuesta celular exagerada que promueve el desarrollo de lesiones vasculares. Más importante aún, la participación de RAGE perpetúa la activación de NF-kB mediante la síntesis de novo de NF-kBp65, produciendo así un grupo en constante crecimiento de este factor de transcripción proinflamatorio [44]. RAGE se asocia con respuestas amplificadas del huésped en varias condiciones patológicas, como diabetes, inflamación crónica, tumores y trastornos neurodegenerativos [18]. De manera similar, postularíamos que durante los períodos de interrupción de la barrera epitelial, tanto la señal 1, un estímulo del factor de crecimiento, como la señal 2, diversas formas de estrés, junto con los ligandos de RAGE y RAGE, ayudan a mediar este efecto.

Ligandos de RAGE

Los ligandos de RAGE se dividen en varias familias distintas. Incluyen las proteínas de la familia High Mobility Group que incluyen el prototipo HMGB1 / anfoterina, miembros de la familia de proteínas S100 / calgranulina, proteínas de matriz como el colágeno I y IV, el péptido Aβ y algunos productos finales de glicación avanzada como la carboximetilisina (CML-AGE) [ 4, 6, 16, 45]. No todos los miembros de estas familias se han identificado como ligandos de RAGE, y muchos ligandos de RAGE tienen una variedad de efectos independientes de RAGE [46]. Las moléculas de AGE prevalecen en condiciones patológicas marcadas por estrés oxidativo, generación de especies de metoxilo y aumentos de azúcar en sangre, como se encuentra en la diabetes mellitus tipo 2 [6, 27]. La familia S100 / calgranulina consta de polipéptidos de unión a calcio estrechamente relacionados que actúan como citocinas extracelulares proinflamatorias.

La acumulación y el compromiso de ligandos a su vez regulan positivamente la expresión de RAGE [2]. No se sabe por qué algunos ligandos (como HMGB1, algunos S100 y CML-AGE) causan una fuerte señalización proinflamatoria a través de RAGE, mientras que moléculas similares (como pentosidina-AGE y pirralina-AGE) parecen tener mucho menos o ningún señalización. La hipótesis más comúnmente aceptada para reconciliar estas diferencias implica la oligomerización de ligandos. De los ligandos de RAGE identificados, los que oligomerizan activan RAGE con más fuerza [3]. Los oligómeros de ligandos podrían reclutar potencialmente varios receptores RAGE así como receptores tipo Toll [TLR] en la superficie celular o en vesículas intracelulares e inducir su agrupamiento en la superficie celular. Por ejemplo, los dímeros S100 y los multímeros de orden superior se unen a varios receptores, incluido el TLR4, y la agrupación de RAGE podría promover una respuesta igualmente fuerte [47]. Estudios recientes muestran que los AGE y ciertos multímeros S100 agruparán RAGE de esta manera [11, 48, 49]. Sin embargo, esto no explica completamente por qué algunos ligandos activarán fuertemente el RAGE mientras que otros estructuralmente similares no parecen activarlo en absoluto [50].

Descripción general de HMGB1 y la familia de proteínas HMG

Las proteínas HMG (High Mobility Group) son proteínas cromosómicas no histonas, nucleares, muy básicas, de las cuales HMGB1 es el único miembro que se ha demostrado que activa RAGE. Las proteínas HMG no deben confundirse con el compuesto no relacionado en la ruta del mevalonato "HMG-CoA" (3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A) e "inhibidores de la HMG-CoA reductasa" (estatinas) [51]. Las proteínas HMG se identificaron por primera vez en el timo de ternera en 1973 y se denominaron así por su alta movilidad en geles de separación de proteínas [52]. Por lo general, tienen un alto porcentaje de aminoácidos cargados y tienen menos de 30 kDa de masa. Las proteínas HMG se expresan en casi todos los tipos de células, son relativamente abundantes en el tejido embrionario y se unen al ADN de una manera dependiente del contenido pero independiente de la secuencia [53]. Son importantes en la remodelación de la cromatina y tienen muchas otras funciones. Los datos de knockout de ratón muestran que la pérdida de cualquiera de las proteínas HMG dará como resultado cambios fenotípicos deletéreos detectables. De ellos, los ratones HMGB1 (- / -) mueren de hipoglucemia dentro de las 24 horas posteriores al nacimiento [54, 55]. El retrocruzamiento extendido del alelo knockout en varias cepas murinas ha revelado un fenotipo aún más profundo con ratones que mueren por E15 del desarrollo [Marco Bianchi, comunicación personal]. La homología entre HMGB1 de ratón y humano es extraordinaria con solo dos diferencias de aminoácidos observadas. Existe una homología profunda similar en todas las especies de vertebrados con un 85% de homología con el pez cebra.

Hay tres subclasificaciones de proteínas HMG: HMGA, HMGB y HMGN (Tabla 1). También hay un conjunto similar conocido como proteínas con motivo HMG. Las proteínas del motivo HMG difieren en que son específicas del tipo de célula y se unen al ADN de una manera específica de secuencia. Las proteínas HMGA (antes HMGI / Y) se distinguen de otras proteínas HMG por tener tres secuencias de gancho AT (que se unen a secuencias de ADN ricas en AT) [56, 57]. También tienen una cola C-terminal algo ácida, aunque el HMGA1c recientemente descubierto no tiene una cola ácida y solo tiene dos ganchos AT. Las proteínas HMGN (antes HMG14 y HMG17) tienen dominios de unión nucleosomal. Las proteínas HMGB (anteriormente HMG1 a HMG4) se distinguen por tener dos cajas de unión al ADN que tienen una alta afinidad por el ADN CpG, núcleos apoptóticos y estructuras muy dobladas, como uniones Holliday de cuatro vías y ADN platino modificado. Las proteínas HMGB tienen una larga cola ácida C-terminal, excepto la HMGB4, que recientemente se ha detectado a nivel de proteína en los testículos, donde actúa como represor transcripcional [58]. La cola ácida de HMGB consta de al menos 20 residuos consecutivos de ácido aspártico y glutámico. Una cola ácida C-terminal de esta longitud y composición rara vez se ve en la naturaleza, aunque algunas otras proteínas relacionadas con la autofagia y la apoptosis, como la paratimosina, tienen un tramo interno largo de péptidos ácidos [59-61].

De las proteínas HMG, la HMGB1 tiene un papel citosólico y extracelular adicional como proteína promotora de la autofagia y como citocina sin líder, respectivamente [62]. Los macrófagos, las células NK y las CD maduras secretan activamente HMGB1 y las células necróticas la secretan pasivamente. También se ha detectado HMGB1 en el citosol, dependiendo del tipo de célula, donde tiene un papel positivo importante en la regulación de la autofagia [63].Aunque HMGA1 tiene un papel en la exportación de HIPK2 (proteína quinasa 2 que interactúa con el homeodominio, un activador proapoptótico de p53) desde el núcleo al citoplasma [64], las proteínas HMG distintas de HMGB1 rara vez se detectan fuera del núcleo. Esto probablemente explica por qué HMGB1 es el único miembro de la familia que activa RAGE [65]. Dado que HMGB1 se transloca entre el núcleo y el citosol, existe la posibilidad de que se una al RAGE soluble en el citosol y, por lo tanto, desempeñe un papel en la regulación de su actividad.

Bioquímica de HMGB1

HMGB1 es una proteína altamente conservada que consta de 215 aminoácidos. Se expresa en casi todas las células de mamíferos. El HMGB1 humano comparte una similitud del 80% con HMGB2 y HMGB3 [55]. Tiene dos cajas de unión de ADN ricas en lisina (A- y B-) separadas por un conector corto. Las cajas están separadas de la cola ácida C-terminal por otra secuencia enlazadora que termina en cuatro lisinas consecutivas. Se ha detectado una isoforma que se cree que resulta de la escisión de la cola ácida. en vivo [66]. HMGB1 tiene tres cisteínas, de las cuales las dos primeras cisteínas vecinas (Cys 23 y 45, basadas en Met1 como Met inicial en la proteína inmadura) pueden formar un enlace disulfuro interno dentro de la caja A. La caja A y el estado de oxidación de estas dos cisteínas juegan un papel importante en la capacidad de HMGB1 para unirse a sustratos. La oxidación de estas dos cisteínas también reducirá la afinidad de HMGB1 por el ADN-CpG [67, 68]. La adición de A-box recombinante antagoniza la capacidad de HMGB1 para unirse a otros sustratos [67, 69]. Queda por determinar si la acción de la caja A es el resultado de la inhibición competitiva uniéndose a otros sustratos o interfiriendo con la capacidad de la caja B para unirse a sustratos. Las dos cajas que actúan en conjunto reconocerán el ADN doblado [70]. La tercera cisteína (Cys106, en la caja B) a menudo permanece reducida y es importante para la translocación nuclear [68]. La región alrededor de esta cisteína es el área mínima con actividad de citocinas [65]. HMGB1 sufre una modificación postraduccional significativa, incluida la acetilación de algunas lisinas, lo que afecta su capacidad de transporte entre el núcleo y el citosol [71, 72]. La accesibilidad de la modificación postraduccional y de unión al ADN se puede modular mediante interacciones de la cola ácida con la caja B básica [73-75]. Señales HMGB1 a través de TLR2, TLR4 y TLR9 además de RAGE [76, 77]. También se une a la trombomodulina y al sindecano a través de interacciones con la caja B [78].

Evolución de HMGB1

Las proteínas HMG se pueden encontrar en los organismos multicelulares más simples [79]. Las dos cajas de ADN resultaron de la fusión de dos genes individuales de una caja [80]. La estructura de dos cajas lo hace particularmente ávido específico para el ADN doblado, y está altamente conservado entre muchos organismos [81, 82]. Esta similitud hace que la generación de anticuerpos específicos de HMGB1 sea un desafío. La reactividad cruzada de anticuerpos podría resultar de la fuerte similitud de HMGB1 en especies individuales, HMGB1 con otras proteínas HMGB e incluso HMGB1 con histonas H1 (Sparvero, Lotze y Amoscato, datos no publicados). La posibilidad de una identificación errónea de HMGB1 debe descartarse cuidadosamente en cualquier estudio. Una forma de distinguir las proteínas HMGB entre sí es por la longitud de la cola ácida (30, 22 y 20 residuos ácidos consecutivos para HMGB1, 2 y 3 respectivamente, mientras que HMGB4 no tiene ninguno). Las colas ácidas están precedidas por un sitio de escisión tríptico proximal y todas tienen composiciones ligeramente diferentes. Esto hace que la espectrometría de masas junto con la digestión tríptica sea un medio atractivo de identificación.

Niveles normales / saludables de HMGB1

La expresión relativa de HMGB1 varía ampliamente según la condición y el tipo de tejido. Los tejidos indiferenciados e inflamados tienden a tener una mayor expresión de HMGB1 que sus contrapartes. El bazo, el timo y los testículos tienen cantidades relativamente grandes de HMGB1 en comparación con el hígado. La ubicación subcelular varía, y la HMGB1 hepática tiende a encontrarse en el citosol más que en el núcleo [55, 83]. La HMGB1 está presente en algunas células a niveles sólo superados por la actina y se estima que es de hasta 1 × 10 6 moléculas por célula, o una décima parte de la abundancia de las histonas centrales totales. Pero este número debe considerarse con cierta cautela, ya que incluye líneas celulares transformadas y no define los niveles de abundancia de HMGB1. en vivo en la mayoría de los linajes celulares [55]. Los niveles séricos de HMGB1 (determinados por Western Blot) se han informado con amplios rangos: 7,0 ± 5,9 ng / ml en pacientes sanos, 39,8 ± 10,5 ng / ml en hígado cirrótico y 84,2 ± 50,4 ng / ml en carcinoma hepatocelular [84 ]. A modo de comparación, los niveles de proteína sérica total humana varían de aproximadamente 45 a 75 mg / ml, y los niveles de proteína citosólica total son de aproximadamente 300 mg / ml [85, 86]. Esto coloca al HMGB1 sérico en el rango bajo de partes por millón en masa, lo que dificulta la detección y separación de proteínas séricas altamente abundantes.

HMGB1 y RAGE en cáncer e inflamación

HMGB1, junto con RAGE, se regula al alza en muchos tipos de tumores (Tabla 2). HMGB1 se libera pasivamente de las células necróticas pero no de la mayoría de las células apoptóticas. Se desconoce la razón de esto, pero se ha planteado la hipótesis de que es el resultado de cambios redox o de una acetilación insuficiente de histonas en células apoptóticas [87, 88]. Las células necróticas HMGB1 (- / -) se ven gravemente obstaculizadas en su capacidad para inducir inflamación. La señalización de HMGB1, en parte a través de RAGE, está asociada con la señalización de ERK1, ERK2, Jun-NH2-quinasa (JNK) y p38. Esto da como resultado la expresión de NFκB, moléculas de adhesión (ICAM y VCAM, que conducen al reclutamiento de macrófagos y neutrófilos) y la producción de varias citocinas (TNFα, IL-1α, IL-6, IL-8, IL-12 MCP-1, PAI-1 y tPA) [89]. Una noción emergente es que la molécula por sí misma tiene poca actividad inflamatoria pero actúa junto con otras moléculas como IL-1, ligandos TLR2, ligandos LPS / TLR4 y ADN. La señalización de HMGB1 a través de TLR2 y TLR4 también da como resultado la expresión de NFκB. Esto promueve la inflamación a través de un circuito de retroalimentación positiva ya que NFκB aumenta la expresión de varios receptores, incluidos RAGE y TLR2. La estimulación de los macrófagos con LPS conducirá a una liberación temprana de TNFα (en varias horas) y una liberación posterior de HMGB1 (después de varias horas y en unos pocos días). Dirigirse a HMGB1 con anticuerpos para prevenir la letalidad de las endotoxinas se convierte, por tanto, en una atractiva posibilidad terapéutica, ya que el anti-HMGB1 es eficaz en ratones incluso cuando se administra horas después de la estimulación con LPS [90]. La estimulación con HMGB1 de células endoteliales y macrófagos promueve la secreción de TNFα, que a su vez también mejora la secreción de HMGB1 [91]. Otro medio para inducir la secreción de HMGB1 es el estrés oxidativo [92]. Se cree que la forma secretada activamente de HMGB1 está al menos parcialmente acetilada, aunque tanto la HMGB1 liberada de forma activa como pasiva promoverán la inflamación [71].

Una de las primeras observaciones que se remonta a 1973 es que las proteínas HMG se agregan con proteínas menos básicas [52]. HMGB1 se une a LPS y una variedad de citocinas como IL-1β. Esto da como resultado un aumento de la producción de interferón gamma (INFγ) por las PBMC (células mononucleares de sangre periférica) que es mucho mayor que con solo HMGB1 o citocinas solas. La unión de HMGB1 a RAGE se mejora con ADN de CpG. La capacidad de HMGB1 para activar RAGE puede deberse más a su capacidad para formar un complejo con otras moléculas proinflamatorias, con este complejo activando posteriormente RAGE [93]. Por lo tanto, cualquier prueba de unión de RAGE únicamente por HMGB1 tendrá que tener en cuenta esto, ya que la contaminación incluso con pequeñas cantidades de ADN de LPS o CpG aumentará la unión. La trombomodulina compite con RAGE por HMGB1 in vitro y el complejo resultante no parece unirse a RAGE, lo que sugiere un posible enfoque para atenuar la señalización de RAGE-HMGB1 [78, 94]. De hecho, la unión a la trombomodulina también puede conducir a la escisión proteolítica de HMGB1 por la trombina, lo que da como resultado un producto inflamatorio menos activo [94].

Un péptido que consta solo de los residuos 150-183 de HMGB1 (el extremo de la caja B y su enlazador a la cola ácida) exhibe unión de RAGE y compite con éxito con la unión de HMGB1 in vitro [95]. Esta secuencia es similar a los primeros 40 aminoácidos (la primera secuencia EF-hand helix-loop-helix) de varias proteínas S100. Un mutante de HMGB1 en el que los aminoácidos 102-105 (FFLF, B-box en el medio) se reemplazan por dos glicinas induce una liberación de TNFα significativamente menor que la HMGB1 de longitud completa en cultivos de monocitos humanos [96]. Este mutante también es capaz de inhibir competitivamente la simulación de HMGB1 de una manera dependiente de la dosis cuando se añaden ambos.

¿Es HMGB1 el único activador de RAGE de la familia HMG?

Por todas las razones indicadas anteriormente, HMGB1 es el único ligando de caja de HMG conocido de RAGE. Ninguna de las otras proteínas HMG nucleares ha demostrado activar RAGE. Las proteínas HMGB pueden complejar el ADN CpG y las estructuras muy dobladas, como las uniones Holliday de cuatro vías y el ADN platinado / modificado con platino, mientras que otros miembros no pueden. A diferencia de otras proteínas HMGB, HMGB1 se expresa abundantemente en casi todos los tejidos y, por lo tanto, está disponible para la translocación fuera del núcleo al citosol para la secreción activa y pasiva. Aunque como nota de advertencia, HMGB2 y HMGB3 también están regulados positivamente en algunos cánceres y podrían desempeñar un papel como activadores de RAGE además de HMGB1. La similitud de estas proteínas con HMGB1 sugiere en varios ensayos que pueden identificarse erróneamente e incluirse en los niveles de HMGB1 informados. Los miembros de la familia HMG y S100 constan cada uno de proteínas similares que tienen propiedades de activación de RAGE distintas y, a menudo, no aparentes.

Proteínas S100 como ligandos de RAGE y su papel en la inflamación

Se ha publicado una revisión reciente de las proteínas S100, que proporciona más detalles que los que se dan aquí [97]. Nos centraremos en los elementos críticos necesarios para considerar su papel en el cáncer y la inflamación. Las proteínas S100 son una familia de más de 20 proteínas expresadas exclusivamente en vertebrados y caracterizadas por dos motivos de mano EF que se unen al calcio conectados por una región de bisagra central [98]. Hace más de cuarenta años, los primeros miembros se purificaron a partir de cerebro bovino y se les dio el nombre de "S-100" por su solubilidad en sulfato de amonio al 100% [99]. Se encontró que muchas de las proteínas S100 identificadas por primera vez se unían a RAGE y, por lo tanto, se teorizó que la unión a RAGE era una propiedad común de todas las proteínas S100. Sin embargo, varios de los miembros de la familia identificados más recientemente no se unen a RAGE. Los genes ubicados en un grupo en el cromosoma humano 1q21 se designan como s100a subfamilia y se numeran consecutivamente comenzando en s100a1. Los genes S100 en otros lugares reciben una sola letra, como s100b [100]. En general, el ADNc de S100 de ratón y humano es 79,6-95% homólogo, aunque el genoma de ratón carece del gen de S100A12 / EN-RAGE [101]. La mayoría de las proteínas S100 existen como homodímeros no covalentes dentro de la célula [98]. Algunos forman heterodímeros con otras proteínas S100; por ejemplo, el heterodímero S100A8 / S100A9 es en realidad la forma preferida que se encuentra dentro de la célula. Los dos bucles de unión de Ca ++ de la mano EF están flanqueados cada uno por hélices α. El bucle N-terminal no es canónico y tiene una afinidad mucho menor por el calcio que el bucle C-terminal. Los miembros de esta familia se diferencian entre sí principalmente en la longitud y secuencia de sus regiones de bisagra y la región de extensión C-terminal después de los bucles de unión. La unión de Ca ++ induce un gran cambio conformacional que expone un dominio de unión hidrofóbico (excepto para S100A10 que está bloqueado en esta conformación) [47]. Este cambio de conformación permite que un dímero S100 se una a dos proteínas diana y, en esencia, forme un puente entre ellas como heterotetrámero [102]. Como resultado, las proteínas S100 se han denominado "sensores de calcio" o "interruptores regulados por calcio". Algunas proteínas S100 también se unen a Zn ++ o Cu ++ con alta afinidad, y esto podría afectar su capacidad para unirse a Ca ++ [101].

Las proteínas S100 tienen patrones de expresión muy variables (Tabla 3). Están regulados positivamente en muchos cánceres, aunque se ha informado que S100A2, S100A9 y S100A11 son represores tumorales [50]. Las proteínas S100 y las calgranulinas se expresan en varios tipos de células, incluidos neutrófilos, macrófagos, linfocitos y células dendríticas [2]. Las proteínas S100 sin líder, específicas de fagocitos, se secretan activamente a través de una vía alternativa, sin pasar por el aparato de Golgi [103]. Varias proteínas S100 se unen al dominio de tetramerización de p53 y algunas también se unen al dominio regulador negativo de p53. La unión del dominio de tetramerización de p53 (controlando así su estado de oligomerización) podría ser una propiedad común a todas las proteínas S100, pero esto no se ha informado [104]. Tampoco se ha informado de sus funciones en la regulación del contrapeso entre autofagia y apoptosis.

Las proteínas S100 individuales prevalecen en una variedad de enfermedades inflamatorias, específicamente S100A8 / A9 (que posiblemente emite señales a través de RAGE además de otros mecanismos) y S100A12 (que definitivamente envía señales a través de RAGE). Estas enfermedades incluyen artritis reumatoide, artritis idiopática juvenil, enfermedad autoinmune sistémica y enfermedad intestinal inflamatoria crónica. El bloqueo de la interacción S100-RAGE con RAGE soluble en ratones redujo la inflamación colónica en ratones deficientes en IL-10, inhibió el desarrollo de artritis y suprimió la infiltración de células inflamatorias [43, 33, 32, 105]. Algunas proteínas S100 tienen funciones dependientes de la concentración en la cicatrización de heridas, el crecimiento de neuritas y la remodelación de tejidos.

Hay varias preguntas importantes que deben abordarse al examinar las interacciones propuestas de S100-RAGE: ¿Se produce esta interacción? en vivo además de in vitro? ¿Podrían los efectos observados explicarse por un mecanismo independiente de RAGE (o incluso además de un mecanismo no RAGE)? ¿Esta interacción depende del estado oligomérico de la proteína S100? (El estado oligomérico de S100 depende en sí mismo de la concentración de Ca ++ y otros iones metálicos, así como del entorno redox). Un área que no ha recibido mucha atención es la posibilidad de que S100 se una a un RAGE soluble en el citosol o núcleo (a diferencia del RAGE soluble extracelular).

Las proteínas S100 no son ligandos de RAGE universales

Varios de los miembros de la familia S100 no son ligandos de RAGE. Aunque no existe una forma directa de identificar la capacidad de unión de RAGE basada en las secuencias de aminoácidos de las proteínas S100, se pueden sacar conclusiones basadas en propiedades bioquímicas comunes de los no ligandos S100 conocidos de RAGE: la primera es que los no ligandos a menudo exhiben una fuerte unión a Zn ++. La segunda es que su unión a Ca ++ está impedida o es diferente de alguna manera de los ligandos S100 RAGE. La tercera es que su estado de oligomerización está alterado o no existe.

No ligandos de RAGE: S100A2, A3, A5, A10, A14, A16, G, Z

S100A2 es un homodímero que puede formar tetrámeros tras la unión de Zn ++, y esta unión de Zn ++ inhibe su capacidad para unirse a Ca ++. Aunque dos ligandos de RAGE (S100B y S100A12) también se unen muy bien a Zn ++, el efecto sobre ellos es aumentar su afinidad por Ca ++ [106, 107]. El S100A3 relacionado se une al Ca ++ de forma escasa, pero al Zn ++ con mucha fuerza [101]. S100A5 también es un aglutinante de Zn ++, pero se une a Ca ++ con una afinidad de 20 a 100 veces mayor que otras proteínas S100. También puede unirse a Cu ++, lo que dificultará su capacidad para unirse a Ca ++ [108]. S100A10 (o p11) es el único miembro de la familia S100 que es insensible al Ca ++. Tiene alteraciones de aminoácidos en los dos dominios de unión de Ca ++ que bloquean la estructura en un estado activo independientemente de la concentración de calcio [109]. Formará un heterotetrámero con la anexina A2 y se le ha denominado "cadena ligera de la anexina A2" [110]. S100A14 tiene sólo 2 de los 6 residuos conservados en el extremo C-terminal de la mano EF y, por lo tanto, es probable que su capacidad para unirse a Ca ++ se vea obstaculizada [111]. S100A16 se une a Ca ++ de manera deficiente, con solo un átomo por monómero de proteína. Sin embargo, tras la adición de Zn ++, se forman agregados superiores [112]. La S100G también se conocía como proteína de unión al calcio dependiente de la vitamina D, CABP intestinal, Calbindin-3 y Calbindin-D9k [113]. Es principalmente un monómero en solución y tras la unión de Ca ++ no presenta los cambios conformacionales que caracterizan a muchas otras proteínas S100 [114]. S100Z es una proteína de 99 aminoácidos que se une a S100P in vitro. Existe como un homodímero que se une a Ca ++ pero su estado de agregación no se ve afectado por Ca ++ [115].

Posibles ligandos de RAGE: S100A1, S100A8 / 9

S100A1 normalmente existe como un homodímero, y su ARNm se observa de manera más prominente en el corazón, con niveles decrecientes en riñón, hígado, piel, cerebro, pulmón, estómago, testículos, músculo, intestino delgado, timo y bazo. S100A1 está presente en el citoplasma y el núcleo; la línea celular de músculo cardíaco de rata H9c2 es principalmente nuclear, músculo esquelético adulto principalmente citoplasmático. El S100A1 se libera en la sangre durante los períodos isquémicos y el S100A1 extracelular inhibe la apoptosis mediante la activación de ERK1 / 2 [101]. S100A1 se une tanto a la tetramerización como a los dominios reguladores negativos de p53 [104]. S100A1 interactúa con S100A4 y se antagonizan entre sí in vitro y en vivo [116]. Todavía existe cierto debate sobre si S100A1 se une a RAGE, aunque un trabajo reciente con PET Imaging de S100A1 marcado con flúor-18 administrado a ratones indica que se co-localiza con RAGE [117].

Además de formar homodímeros, S100A8 y S100A9 pueden formar heterodímeros y heterotetrámeros entre sí de forma dependiente del calcio y de la oxidación [101]. No se ha demostrado directamente que S100A8 y S100A9 activen RAGE, pero existe evidencia funcional sustancial de que muchos de sus efectos están bloqueados por la supresión o silenciamiento de RAGE. S100A8 / 9 ejerce un efecto proapoptótico en concentraciones elevadas, pero promueve el crecimiento celular en concentraciones bajas [118]. Los efectos de S100A8 / 9 modificado con N-carboximetil-lisina se mejoran en ratones knockout para RAGE o mediante la administración de RAGE soluble a ratones de tipo salvaje [119]. S100A8 / 9 se une a heparán sulfato, proteoglicanos y N-glicanos carboxilados [103]. Una pequeña (& lt2%) subpoblación de RAGE expresada en células tumorales de colon se modifica a N-glicanos carboxilados, y es muy posible que esta subpoblación sea activada por S100A8 / 9 [120]. Las proteínas S100A8 y S100A9 son secretadas de una manera dependiente de la energía por los fagocitos durante los procesos inflamatorios. Estimulan patrones inflamatorios específicos en las células endoteliales, interactuando con componentes del citoesqueleto, incluidos los filamentos de queratina, los microtúbulos, los filamentos intermedios de tipo III y la F-actina [121]. En presencia de calcio, S100A8 y S100A9 forman tetrámeros y se unen directamente a los microtúbulos. S100A8 / S100A9 también modula el reordenamiento del citoesqueleto dependiente de tubulina durante la migración de fagocitos. S100A8 y S100A9 interactúan con los filamentos intermedios de tipo III y los filamentos de queratina con el fin de reparar heridas.Extracelularmente, el complejo S100A8 / S100A9 muestra actividades citostáticas y antimicrobianas e inhibe la activación de macrófagos y la síntesis de inmunoglobulinas por los linfocitos [122]. El homodímero de S100A8 reducido pero no oxidado es fuertemente quimiotáctico para los leucocitos [121]. La regulación al alza de S100A8 y S100A9 en tejido pulmonar premetastásico proporciona un nicho para la migración de células tumorales [123]. Esta regulación positiva puede ser inducida por la secreción de VEGF-A, TGFβ y TNFα de tumores distantes. La regulación al alza en las células endoteliales VE-cadherina + de pulmón promueve el reclutamiento y la infiltración de células mieloides Mac1 + y, por lo tanto, proporciona un nicho para la migración de células tumorales. El bloqueo de la expresión de S100A8 y S100A9 en la etapa premetastásica podría evitar que se forme este nicho permisivo y así inhibir la migración de células tumorales.

Ligandos de RAGE: S100A4, A6, A7 / A7A / A15, A11, A12, A13, B, P

S100A4

S100A4 se une a RAGE y se ha implicado en la regulación positiva de MMP-13 (metaloproteinasa de matriz 13) en la osteoartritis, lo que conduce a la remodelación tisular [124]. S100A4 se expresa en astrocitos, células de Schwann y otras células neuronales además de condrocitos [43]. S100A4 se regula al alza después de una lesión del tejido nervioso. El crecimiento de neuritas estimulado por S100A4 se observa para la proteína en el estado oligomérico, no dimérico [121]. Esta proteína también estimula la angiogénesis a través de la vía de señalización ERK1 / 2. S100A4 se une al dominio de tetramerización pero no al dominio regulador negativo de p53 [104].

S100A6

S100A6 se encuentra principalmente en las neuronas de regiones restringidas del cerebro [42]. S100A6 también se encuentra en el medio extracelular de las células de cáncer de mama. S100A6 se une al dominio de tetramerización de p53 [104]. S100A6 se unió significativamente al dominio C2 de RAGE, a diferencia de los dominios V y / o C1 a los que se unen la mayoría de los otros ligandos y, por tanto, sugiere que podría tener una función discordante de otros ligandos de RAGE. S100A6 desencadena la vía JNK y, posteriormente, la vía Caspasa 3/7, lo que da lugar a la apoptosis [125].

S100A7 / S100A7A / S100A15

La S100A7, también llamada psoriasina 1, es parte de una subfamilia de varias proteínas [101]. El altamente homólogo S100A7A, un miembro de esta subfamilia, se conocía anteriormente como S100A15, pero este nombre ha sido retirado [113]. S100A7 y S100A7A son funcionalmente distintos a pesar de la alta similitud de secuencia [126]. S100A7 se expresa en gran medida en la enfermedad hiperproliferativa epidérmica y recluta linfocitos CD4 + y neutrófilos [102]. Aunque varias proteínas S100 están reguladas al alza en diversas formas de cáncer de mama, S100A7 está fuertemente regulado al alza solo en el carcinoma ductal. en el lugar [127]. Hay altos niveles de S100A7 monomérico y de alto peso molecular reticulado covalentemente en el exudado de heridas humanas y en el tejido de granulación. Los estudios inmunohistológicos sugieren que el S100A7 es producido por los queratinocitos que rodean la herida y se libera en el exudado de la herida. S100A7 ejerce actividad antibacteriana, y la región central que incluye sólo los aminoácidos 35-80 es suficiente para mediar esta actividad [128]. Aunque tanto S100A7 como S100A7A se expresan en queratinocitos, S100A7A también se expresa en melanocitos y células de Langerhans de la epidermis y células endoteliales de músculo liso dérmico [126]. La unión, la señalización y la quimiotaxis de S100A7 dependen de Zn ++ y RAGE in vitro, mientras que S100A7A parece señalizar a través de una vía independiente de RAGE. S100A7 y S100A7A ejercen un efecto sinérgico, promoviendo la inflamación. en vivo [126].

S100A11

S100A11 se sobreexpresa en muchos cánceres [129]. Es homodimérico e interactúa de forma dependiente de Ca ++ con la anexina I [130]. Es un mediador clave del crecimiento de los queratinocitos epidérmicos humanos desencadenado por niveles elevados de Ca ++ o TGFβ [129]. En estas condiciones, S100A11 se fosforila y se transporta al núcleo mediante nucleolina. S100A11 se une al dominio de tetramerización (pero no al dominio regulador negativo) de p53 [104]. El S100A11 extracelular es dimerizado por la transglutaminasa 2, y este homodímero covalente adquiere la capacidad de señalizar a través de la vía p38 MAPK, acelerar la hipertrofia de los condrocitos y el catabolismo de la matriz y, por lo tanto, asocia la inflamación con la activación de los condrocitos para promover la progresión de la osteoartritis [131].

S100A12 / EN-RAGE

S100A12 (EN-RAGE) se expresa principalmente en granulocitos, pero también se encuentra en queratinocitos y lesiones psoriásicas. S100A12 representa aproximadamente el 5% de la proteína citosólica total en neutrófilos en reposo. Se expresa en inflamación aguda, crónica y alérgica. Interactúa con RAGE de una manera dependiente de Ca ++, pero también se une a Cu ++. No hay s100a12 gen en ratones, aunque S100A8 parece ser un homólogo funcional [132, 133]. S100A12 está regulado positivamente en psoriasis y melanoma [101]. Se une a los dominios RAGE C1 y C2 en lugar del dominio V [49]. También puede unirse a RAGE expresado en células endoteliales, señalizando a través de las vías NF-κB y MAPK. S100A12 comparte homología de secuencia con el dominio de unión a RAGE putativo de HMGB1 (residuos 153-180). El S100A12 secretado se une a RAGE y mejora la expresión de la molécula de adhesión intercelular I (ICAM-1), la molécula de adhesión de células vasculares I (VCAM-1), el NF-κB y el factor de necrosis tumoral (TNF) -α [43]. S100A12 es un quimioatrayente para monocitos y mastocitos, aunque sólo la región de la bisagra parece importante para estos últimos [134]. Dado que los mastocitos no expresan proteína o ARNm de RAGE, su activación por S100A12 se produce de forma independiente de RAGE. El S100A12 existe como un homodímero en condiciones bajas de Ca ++, pero formará agregados de hexámeros (tres dímeros) a concentraciones milimolares de Ca ++ [135]. S100A12, además de S100A13, se une a los fármacos antialérgicos cromolín, tranilast y amlexanox de una manera dependiente de Ca ++. Esto sugiere que S100A12 y S100A13 podrían estar involucrados en la desgranulación de mastocitos de una manera independiente de RAGE [136].

S100A13

S100A13 tiene un patrón de expresión muy amplio, en contraste con las otras proteínas S100. S100A13 se expresa en células endoteliales, pero no en células de músculo liso vascular. Se regula al alza en las lesiones de endometriosis extrauterina en comparación con los tejidos normales y puede tener un papel en la vascularización [137]. Su afinidad por Ca ++ es baja, pero la unión de Ca ++ conduce a un cambio conformacional que expone un nuevo sitio de unión de Cu ++ [138]. Tras la unión de Cu ++, regula la liberación de FGF-1 dependiente del estrés y desempeña un papel en la angiogénesis en los gliomas astrocíticos de alto grado [139]. S100A13 además de S100A12 puede estar implicado en la desgranulación de mastocitos [136].

S100B

S100B se expresa principalmente en los astrocitos de la corteza humana y los melanocitos, así como en las células dendríticas mieloides [42]. S100B, junto con S100A1 y S100A6, son las proteínas S100 más abundantes en el cerebro de varias especies, incluidos ratones y ratas. Se han encontrado niveles elevados de S100B en pacientes tras un traumatismo cerebral, isquemia / infarto, enfermedad de Alzheimer y síndrome de Down [42]. El S100B se utiliza como marcador de la activación y muerte de las células gliales [140]. Se cree que existe como una mezcla de dímeros covalentes y no covalentes en el cerebro, ya que los ensayos ELISA realizados en condiciones no oxidantes subestimarán la cantidad de S100B [141, 142]. En este sentido, los dímeros covalentes S100B se pueden utilizar como un marcador de estrés oxidativo [142]. S100B se une tanto al dominio de tetramerización como al dominio regulador negativo de p53 [104]. S100B también inhibe microtubulina y conjuntos de filamentos intermedios de tipo III. S100B se une a las regiones variable (V) y constante (C1) de RAGE, y los oligómeros de S100B se unen a RAGE con más fuerza [42, 48]. A concentraciones equivalentes, S100B aumenta la supervivencia celular, mientras que S100A6 induce la apoptosis a través de interacciones RAGE, que dependen de la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS). Al unirse a RAGE y activar la formación de ROS intracelulares, S100B activa la vía PI 3-quinasa / AKT y posteriormente la vía NFκB, lo que da como resultado la proliferación celular. S100B ejerce efectos tróficos sobre neuronas y astrocitos en concentraciones más bajas y causa apoptosis neuronal, activando astrocitos y microglia en concentraciones más altas [143-146]. La activación de S100B de RAGE regula al alza la expresión de IL-1β y TNF-α en microglia y estimula la actividad transcripcional de AP-1 a través de la señalización de JNK. La regulación al alza de la expresión de COX-2, IL-1β y TNF-α en microglia por S100B requiere la activación concurrente de NF-κB y AP-1.

S100P

S100P se une a RAGE y es importante en los cánceres de próstata, páncreas y gástrico [146, 147]. También se detecta en pulmón normal y en tejido canceroso de pulmón, y aumenta principalmente en los adenocarcinomas [148]. El tratamiento de las líneas de células pancreáticas con S100P estimula la proliferación celular, la migración, la invasión y activa las vías MAP quinasa y NFκB [149]. El fármaco antialérgico cromolín se une a S100P y bloqueará la interacción S100P-RAGE. Inhibe el crecimiento tumoral y aumenta la eficacia de la gemcitabina en modelos animales de experimentación [150]. Los fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) son simultáneamente pro-tumorigénicos al regular al alza la expresión de S100P y anti-tumorigénicos al disminuir la actividad de Cox2 [151].

Proteínas S100: diferencias sutiles que se traducen en grandes cambios en la unión de RAGE

Aunque las proteínas S100 comparten mucha similitud estructural con sus dos dominios de unión de Ca ++ de la mano EF flanqueados por hélices α, sólo algunos de los miembros activan RAGE [97]. Las diferencias estructurales sutiles que conducen a diferentes propiedades bioquímicas (unión de Ca ++ y Zn ++ y estado de oligomerización preferido) parecen conducir a diferentes capacidades para activar RAGE. Los estados de oligomerización más altos tienden a conducir a la activación de RAGE. RAGE también se une a varias familias de proteínas que forman fácilmente agregados y oliogmers: péptido beta amiloide, colágeno y AGE.

RAGE y Abeta

El péptido beta-amiloide (Abeta) es un péptido de 40 o 42 aminoácidos cuya acumulación en placas amiloides es una de las características del cerebro de Alzheimer. Abeta existe extracelularmente como monómero, oligómero soluble o fibrillas y agregados insolubles. Abeta se une a RAGE en neuronas y células microgliales [152]. En las neuronas, la activación de Abeta de RAGE generará estrés oxidativo y activará NF-KB. La activación de abeta de la microglía mejorará la proliferación y migración celular [153, 154]. Sin embargo, otros receptores también podrían mediar en la toxicidad de Abeta, ya que también existen efectos independientes de RAGE [155]. Los dominios V y C1 de RAGE se unen a oligómeros y agregados de Abeta (respectivamente), y bloquearlos evitará la neurotoxicidad inducida por Abeta [156]. La exposición de una línea celular de neuroblastoma humano que expresa RAGE (SHSY-5Y) a oligómeros de Abeta causó una muerte celular masiva, mientras que la exposición a fibrillas y agregados de Abeta causó solo una muerte celular menor. El tratamiento con anticuerpos bloqueantes específicos de los dominios de RAGE pudo proteger contra la muerte inducida por agregados u oligómeros de Abeta (pero no la muerte inducida por fibrillas).

RAGE y colágeno

A diferencia de otros tejidos no embrionarios, RAGE se expresa altamente en pulmones sanos y su expresión disminuye en estados patológicos. La expresión de RAGE en el pulmón es un marcador de diferenciación de las células epiteliales alveolares de tipo I (AT I) y se localiza en la membrana plasmática basolateral [20]. RAGE mejora la adherencia de estas células a las superficies recubiertas de colágeno e induce la propagación celular [16]. RAGE se une a laminina y al colágeno I y IV in vitro, pero no a la fibronectina. Por lo tanto, RAGE desempeña un papel en el anclaje de las células AT I a la membrana basal del pulmón, que es rica en colágeno IV [20, 157, 158]. La ausencia de expresión de RAGE en ratones (- / -) conduce a un aumento de la fibrosis pulmonar idiopática espontánea (FPI). El pulmón humano de pacientes con FPI en fase tardía mostró una regulación a la baja significativa de RAGE en comparación con el tejido pulmonar sano [20].

Productos finales de glicación avanzada (AGE) una amplia clase de productos no enzimáticos de reacciones entre proteínas o lípidos y azúcares de aldosa [159]. La reacción entre la proteína y el azúcar provoca su característico pardeamiento en los productos alimenticios. La dieta occidental en particular está llena de PGA. Aunque la glicación es un término general para la adición de un azúcar, en este caso se refiere específicamente a la adición no enzimática a una proteína. La "glicosilación" se usa a menudo para la adición enzimática de azúcares. La reacción de Maillard, a partir de la glicación de proteínas y progresando hasta la formación de AGE, está implicada en el desarrollo de complicaciones de la diabetes mellitus, así como en la patogénesis de enfermedades cardiovasculares, renales y neurodegenerativas [3, 119, 160, 161]. La reacción de Maillard comienza con los azúcares que forman bases de Schiff y productos Amadori. Los grupos carbonilo de estos precursores pueden reaccionar con los grupos funcionales amino, sulfhidrilo y guanidinilo de las proteínas. Los AGE no pueden revertirse químicamente a sus formas originales, pero su precursor, los productos Amadori, sí. Los AGE son una categoría diversa de modificaciones no enzimáticas que resultan de estas reacciones, y no todas las proteínas modificadas por AGE activan el RAGE. Se han caracterizado más de veinte modificaciones diferentes de AGE, de las cuales las proteínas modificadas con carboximetil lisina (CML) son fuertes inductores de la señalización de RAGE [3, 160]. Otras modificaciones de AGE a proteínas (como pentosidina y pirralina) no aumentan la señalización de RAGE. Como tal, es importante caracterizar las modificaciones de proteínas por AGE. Una técnica prometedora es la espectrometría de masas, especialmente la proteómica "ascendente" que implica la escisión de proteínas seguida del análisis de los péptidos posteriores [160].

RAGE y AGE en el entorno redox

La acumulación de AGE en sí misma se considera una fuente de estrés oxidativo. En entornos hiperglucémicos, la glucosa puede sufrir una autooxidación y generar radicales OH [161, 162]. Los propios productos a base de Schiff y Amadori provocan la producción de ROS [162]. Los donantes de óxido nítrico pueden eliminar los radicales libres e inhibir la formación de AGE [163]. Con el tiempo, los depósitos de AGE contribuyen a la aterosclerosis diabética en los vasos sanguíneos. A medida que un ser humano envejece naturalmente, se generan altos niveles de AGE endógenos [164, 165].

RAGE fue nombrado originalmente por su capacidad para unirse a los AGE, pero desde 1995 se han encontrado muchos más ligandos [8, 166]. La formación de AGE es una forma de mantener la señal de un breve estallido oxidativo en una proteína modificada postraduccionalmente de vida mucho más larga [119]. RAGE se unirá a la albúmina modificada con AGE pero no a la albúmina no glucosilada [167]. La activación de RAGE por EDAD se encuentra en la diabetes, la neuodegeneración y el envejecimiento [168]. Los tumores proporcionan un entorno que favorece la generación de AGE ya que, según la hipótesis original de Warburg, se basan principalmente en la glucolosis anaeróbica para obtener energía y tienen una mayor absorción de glucosa [169, 170]. Las células del carcinoma de próstata se unen a los AGE a través del dominio V de RAGE [171]. De hecho, se han identificado AGE en tejido canceroso, lo que conduce a la posibilidad de que la activación de RAGE por AGE contribuya al crecimiento del cáncer [172]. Sin embargo, también hay otros ligandos de RAGE en mayor abundancia. Las moléculas individuales de RAGE no se unen bien a los AGE, pero los oligómeros de RAGE los unen fuertemente [11]. Esto apoya la idea de que la oligomerización de RAGE es importante para la señalización sostenida. El colágeno normalmente acumulará algún grado de glicación. en vivo, pero el colágeno con modificación sintética de AGE mejorará la adhesión y propagación de los neutrófilos [173].

El sorbinil y el zenarestat son inhibidores de la aldosa reductasa (IRA) activos por vía oral derivados de la quinazolina. Ellos, además de la vitamina C y E, tienen beneficios paliativos en la disminución del estrés oxidativo intracelular [174]. La vitamina E es eficaz en parte debido a su estructura química. Es capaz de donar un átomo de hidrógeno de su grupo hidroxilo, combinándose con ROS y neutralizándolos [175]. Lamentablemente, muchos de los ensayos clínicos de antioxidantes no han logrado modificar el cáncer y en algunos casos han mejorado su desarrollo, lo que sugiere que los eventos extracelulares "aeróbicos" u oxidativos pueden ser un medio preferido para limitar la inflamación crónica. La inyección de RAGE soluble previene la lesión por reperfusión hepática y reduce los niveles de TNF-α (factor de necrosis tumoral α), una citocina que señala la apoptosis y contribuye a la inflamación sistémica, y por tanto disminuye la insulitis [176]. La administración de aminoguanidina también disminuye los niveles de albúmina en el torrente sanguíneo y disminuye los niveles séricos y aórticos de AGE, lo que ralentiza la progresión de la aterosclerosis [177].

Ligandos de RAGE en neurobiología

El eje RAGE-NF-κB opera en la neuropatía diabética. Esta activación se atenuó en ratones RAGE (- / -), incluso 6 meses después de la inducción diabética. La pérdida de percepción del dolor se invierte en ratones de tipo salvaje tratados con RAGE soluble exógeno [178]. La interacción entre HMGB1 y RAGE in vitro promueve el crecimiento neurítico de las células corticales, lo que sugiere un papel potencial de RAGE como mediador en el desarrollo neuronal [166]. Las concentraciones nanomolares de S100B promueven respuestas de supervivencia celular como la migración celular y el crecimiento de neuritas. Si bien la interacción de RAGE con S100B puede producir señales antiapoptóticas, las concentraciones micromolares de S100B producirán oxirradicales, induciendo apoptosis. S100B también activa RAGE junto con HMGB1, promoviendo la producción del factor de transcripción NF-kB [144]. Otro mecanismo propuesto de cómo RAGE puede mediar en el crecimiento de neuritas implica carbohidrato de sulfoglucuronilo (SGC). El examen de HMGB1 y SGC en el cerebro de ratón en desarrollo revela que la cantidad de RAGE expresada en el cerebelo aumenta con la edad. Los anticuerpos contra HMGB1, RAGE y SGC inhiben el crecimiento de neuritas, lo que sugiere que RAGE puede estar implicado en la unión de estas moléculas y sus procesos posteriores [179].

Como RAGE puede estar involucrado en el crecimiento y muerte celular, también se ha examinado su papel en la recuperación celular después de una lesión. En ratas con oclusión permanente de la arteria cerebral media, los niveles de RAGE aumentan como lo hacen en las células PC12 después de la privación de oxígeno y glucosa (OGD). El bloqueo de RAGE reduce la citotoxicidad causada por OGD [180]. La unión de RAGE a sus ligandos activa la vía NF-κB. La presencia de citocinas reguladas por RAGE, NF-κB y NF-κB en células CD4 +, CD8 + y CD68 + reclutadas en los nervios de pacientes con neuropatías vasculíticas sugiere que la vía de RAGE también puede desempeñar un papel en la regulación positiva de la inflamación en este contexto [ 181]. Otro ligando de RAGE, AGE-CML, está presente en células mononucleares endoneuriales y epineuriales en la polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica y la polineuropatía vasculítica [182].

En las células de glioma, RAGE es parte de un punto de control molecular que regula la invasividad, el crecimiento y el movimiento de las células. A diferencia de las células de cáncer de pulmón, las células de glioma normales expresan menos RAGE que las células tumorales. La adición de AGE a las células estimula la proliferación, el crecimiento y la migración.La adición de anticuerpos dirigidos a RAGE inhibe a la inversa el crecimiento y la proliferación causados ​​por los AGE, aumentando el tiempo de supervivencia y disminuyendo las metástasis en ratones inmunodeprimidos que portan células de glioma C6 de rata implantadas [183].

RAGE en neoplasias epiteliales

La interacción entre RAGE y sus diversos ligandos juega un papel considerable en el desarrollo y metástasis del cáncer. RAGE altera el estímulo proliferativo de las células cancerosas de pulmón y esófago [184]. RAGE se expresa en gran medida en neumatocitos de tipo I, específicamente localizados en el epitelio alveolar. Curiosamente, la sobreexpresión de RAGE conduce a una menor proliferación y crecimiento celular, mientras que la regulación a la baja de RAGE promueve el desarrollo de tumores pulmonares en estadio avanzado [19, 185]. Además, el bloqueo de las interacciones AGE-RAGE conduce a una disminución del crecimiento celular [186]. Las células que expresan RAGE tienen una activación disminuida de la vía p42 / p44-MAPK y la producción del factor de crecimiento (incluido IGF-1) está alterada. Los ligandos de RAGE detectados en tumores de pulmón incluyen HMGB1, S100A1 y S100P. En las células de cáncer de pulmón transfectadas con una forma de RAGE deficiente en señal que carece del dominio citoplásmico, se observa un mayor crecimiento en comparación con las células transfectadas con fl-RAGE. La sobreexpresión de RAGE en las células de cáncer de pulmón no aumenta la migración celular, mientras que el RAGE deficiente en señal sí lo hace [187].

RAGE y células inmunes

RAGE también actúa como un receptor de adhesión endotelial que media las interacciones con la integrina β2 Mac-1 [29]. HMGB1 mejora las interacciones RAGE-Mac1 en células inflamatorias, vinculándolas con respuestas inflamatorias (Tabla 4) [71, 72]. Los neutrófilos y las células mielomonocíticas se adhieren a células RAGE inmovilizadas o transfectadas con RAGE, y esta interacción se atribuye a interacciones Mac-1 [24, 71]. RAGE se expresa en gran medida en macrófagos, linfocitos T y linfocitos B [188]. El RAGE expresado en estos tipos de células contribuye a los mecanismos inflamatorios. La activación de RAGE en las células T es uno de los primeros eventos que conduce a la diferenciación de las células T Th1 + [189]. RAGE también es un contrarreceptor para las integrinas leucocitarias, que contribuye directamente al reclutamiento de células inflamatorias in vivo e in vitro. Se ha postulado que el RAGE soluble es un inhibidor directo del reclutamiento de leucocitos [190]. El reclutamiento de leucocitos mediado por RAGE puede ser particularmente importante en condiciones asociadas con una mayor expresión de RAGE, como diabetes mellitus, inflamación crónica, aterosclerosis o cáncer [33]. RAGE puede mediar directamente en el reclutamiento de leucocitos, actuando como un receptor adhesivo de células endoteliales y atrayendo leucocitos. RAGE provoca un aumento "indirecto" del reclutamiento de células inflamatorias debido a la activación celular mediada por RAGE y la regulación positiva de moléculas de adhesión y factores proinflamatorios [190]. S100A12 y S100B activan células endoteliales de músculo liso vascular, monocitos y células T a través de RAGE, lo que resulta en la generación de citocinas y moléculas de adhesión proinflamatorias [24, 67, 68].

La expresión de RAGE en las células T es necesaria para las respuestas proliferativas activadas por antígenos [189]. Las células T deficientes en RAGE disminuyen la producción de IL-2, IFN-γ y Th1 mientras que producen más IL-4 e IL-5 como citocinas Th2. Por tanto, la activación de RAGE juega un papel en el equilibrio de la inmunidad Th1 y Th2. Las células dendríticas deficientes en RAGE parecen mediar en la actividad de presentación de antígeno más bien normal y en la migración tanto en vivo y in vitro. Sin embargo, la expresión de RAGE es necesaria para que las CD en proceso de maduración migren a los ganglios linfáticos de drenaje [191].


Papel crucial de RAGE en el aumento inadecuado de las células del músculo liso de pacientes con hipertensión arterial pulmonar

Fondo: La remodelación vascular pulmonar de la hipertensión arterial pulmonar (HAP) se caracteriza por un aumento inadecuado de las células vasculares. El receptor de productos finales de glicación avanzada (RAGE) es una proteína transmembrana de paso único de tipo I que pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas y está implicada en una amplia gama de enfermedades hiperproliferativas. RAGE también está implicado en la etiología de la HAP y se sobreexpresa en las células del músculo liso de la arteria pulmonar (PASMC) en pacientes con HAP. Examinamos el papel de RAGE en el aumento inadecuado de PASMC en pacientes con HAP.

Métodos y resultados: Las PASMC se obtuvieron de 12 pacientes con HAP, incluidos 9 pacientes con HAP idiopática (HAPI) y 3 pacientes con HAP hereditaria (HAPH) (2 pacientes con mutación BMPR2 y un paciente con mutación SMAD9) que se sometieron a trasplante de pulmón. El análisis de transferencia de Western y la tinción de inmunofluorescencia revelaron que RAGE y S100A8 y A9, ligandos de RAGE, estaban sobreexpresados ​​en IPAH y HPAH-PASMC en ausencia de cualquier estímulo de crecimiento externo. PDGF-BB (10 ng / ml) regulaba positivamente la expresión de RAGE en IPAH y HPAH-PASMC. Las PAH-PASMC son hiperplásicas en ausencia de cualquier estímulo de crecimiento externo según lo evaluado por la incorporación de 3H-timidina. Este resultado indica un crecimiento excesivo caracterizado por un crecimiento continuo en condiciones de ausencia de estimulación del crecimiento en las PAH-PASMC. La estimulación con PDGF-BB provocó una mayor tasa de crecimiento de PAH-PASMC que la de no PAH-PASMC. AS-1, un inhibidor de la señalización de RAGE mediada por el dominio TIR, inhibió significativamente el sobrecrecimiento caracterizado por un crecimiento continuo en una condición de no estimulación del crecimiento en IPAH y HPAH-PASMC (P & lt0,0001). Además, AS-1 inhibió significativamente la proliferación estimulada por PDGF de IPAH y HPAH-PASMC (P & lt0.0001).

Conclusiones: RAGE juega un papel crucial en el aumento inadecuado de PAH-PASMC. La inhibición de la señalización de RAGE puede ser una nueva estrategia terapéutica para la HAP.

Declaracion de conflicto de interes

Los autores han declarado que no existen intereses en competencia.

Cifras

Fig 1. Expresión de RAGE en PASMC de…

Fig 1. Expresión de RAGE en PASMC de pacientes con HAP.

A. Tinción inmunohistoquímica de RAGE ...

Fig 2. Expresión de S100A8 / A9 en PASMC de…

Fig 2. Expresión de S100A8 / A9 en PASMC de pacientes con HAP.

A. Tinción inmunohistoquímica de S100A8…

Fig 3. Mayor expresión de RAGE en ...

Fig 3. Aumento de la expresión de RAGE en PASMC de pacientes con HAP por estimulación con PDGF-BB ...

Fig 4. Efectos inhibidores de AS-1 o…

Fig 4. Efectos inhibidores de AS-1 o aptámero de RAGE sobre la proliferación de PAH-PASMC evaluados por…


Abstracto

Objetivo-

La inflamación juega un papel clave en la aterosclerosis. Presumimos que los nuevos marcadores inflamatorios pueden predecir el riesgo de enfermedad coronaria (CHD).

Enfoque y resultados

Investigamos la asociación de 16 biomarcadores inflamatorios con el riesgo de enfermedad coronaria en un subconjunto aleatorio de 839 individuos sin enfermedad coronaria en un estudio de cohorte prospectivo basado en la población. Un Bonferroni corregido PAG Se utilizó un valor de 3,1 × 10 −3 como umbral de significación estadística. La edad media al inicio del estudio fue de 72,8 años. Durante una mediana de seguimiento de 10,6 años, se observaron 99 casos de cardiopatía coronaria incidente. Entre todos los biomarcadores inflamatorios, el s100a12 humano derivado de neutrófilos (receptor extracelular recientemente identificado para la proteína de unión a productos finales de glicación avanzada [EN-RAGE]) mostró la asociación más fuerte con el riesgo de cardiopatía coronaria (PAG valor 2,0 × 10 −3). Después del ajuste multivariable para los factores de riesgo cardiovascular establecidos, cada aumento de la desviación estándar en el EN-RAGE transformado logarítmicamente natural se asoció con un 30% más de riesgo de cardiopatía coronaria incidente (índice de riesgo, 1,30 intervalo de confianza del 95%, 1,06-1,59). El ajuste adicional de los marcadores inflamatorios estudiados previamente no atenuó la asociación. La exclusión de las personas con diabetes mellitus tipo 2 prevalente, insuficiencia renal o personas que usan medicación antihipertensiva no modificó las estimaciones del efecto. Los cocientes de riesgo de causas específicas sugirieron una asociación más fuerte entre EN-RAGE y la mortalidad por cardiopatía coronaria en comparación con la cardiopatía coronaria estable.

Conclusiones

Nuestros resultados destacan la EN-RAGE como un marcador inflamatorio de CC en el futuro en una población general, más allá de los factores de riesgo y los marcadores inflamatorios tradicionales de las CC.

Introducción

Con 7,3 millones de muertes al año en todo el mundo, la enfermedad coronaria (CC) sigue siendo la principal causa de mortalidad en el mundo. 1 Se cree que la inflamación juega un papel clave en la patogenia de la aterosclerosis y la cardiopatía coronaria. 2 En consecuencia, se han investigado marcadores inflamatorios para predecir el riesgo de CC, un esfuerzo que ha llevado a la identificación y validación de varios marcadores inflamatorios de CC. 3-6 Sin embargo, los marcadores inflamatorios que se han investigado hasta la fecha solo representan una pequeña parte de las diversas moléculas que constituyen la compleja respuesta inmune humana. 7 Explorar de forma prospectiva la asociación de marcadores inflamatorios relativamente no investigados con la EC puede desentrañar nuevos factores de riesgo inflamatorio para la EC y puede arrojar luz sobre vías adicionales que podrían estar involucradas en la patogenia de la aterosclerosis y la EC.

Planteamos la hipótesis de que los indicadores de inflamación que no se han estudiado previamente con la incidencia de CC se asocian con CC incidente más allá de los factores de riesgo tradicionales y los marcadores inflamatorios previamente estudiados. Con este fin, estudiamos la asociación de 16 biomarcadores de inflamación con el riesgo de cardiopatía coronaria en el Estudio de Rotterdam, un estudio de cohorte prospectivo basado en la población.

Materiales y métodos

Los materiales y métodos están disponibles en el Suplemento de datos solo en línea.

Resultados

La Tabla 1 resume las características basales de 839 participantes (consulte la Tabla II en el Suplemento de datos solo en línea para conocer las características basales en futuros casos y no casos de cardiopatía coronaria). Al inicio del estudio, la edad media (± DE) era de 72,8 (7,5) y el 58% de la población eran mujeres. Durante una mediana de seguimiento de 10,6 años (rango intercuartílico, 6,8-11,9), 2 se perdieron durante el seguimiento, 353 personas murieron (302 no relacionadas con CC) y 99 desarrollaron CC (tasa de incidencia, 12,7 por 1000 personas-año) . De los 16 biomarcadores inflamatorios (Figura 1), después de la corrección de Bonferroni, solo el receptor extracelular recientemente identificado para la proteína de unión a productos finales de glicación avanzada (EN-RAGE) se asoció significativamente con la cardiopatía coronaria cuando se ajustó por edad y sexo (Tabla III en línea -sólo suplemento de datos). El riesgo de cardiopatía coronaria aumentó casi un tercio por aumento de la desviación estándar en el EN-RAGE transformado logarítmicamente natural (índice de riesgo [HR], 1,37 intervalo de confianza (IC) del 95%, 1,12–1,67 Tabla 2). En comparación con el tercil más bajo, los participantes en el tercil más alto experimentaron aproximadamente un riesgo 2.6 veces mayor de desarrollar cardiopatía coronaria en comparación con los participantes en el tercil más bajo (HR, 2.59 IC del 95%, 1.52–4.40). Cuando ajustamos aún más la asociación para los factores de riesgo cardiovascular tradicionales, las estimaciones del efecto se atenuaron ligeramente (HR, 1.30 IC 95%, 1.06-1.59). El ajuste adicional para los marcadores inflamatorios previamente estudiados produjo estimaciones de efecto ligeramente aumentadas (Tabla 2 Tabla IV en el Suplemento de datos solo en línea).

Figura 1. Diagrama de flujo de inclusión de biomarcadores inflamatorios.

Tabla 1. Características iniciales de los participantes en riesgo de cardiopatía coronaria

Los valores más-menos son medias ± DE.

CHD indica enfermedad coronaria.

* Los valores se presentan como mediana (rango intercuartílico).

Tabla 2. La asociación entre los niveles séricos de EN-RAGE y la cardiopatía coronaria incidente

Modelo 1, ajustado por edad y sexo Modelo 2, ajustado por edad, sexo, IMC, presión arterial sistólica, uso de medicación antihipertensiva, colesterol HDL, colesterol total, tabaquismo (actual, no actual), diabetes mellitus tipo 2 prevalente y modelo de TFGe 3, adicionalmente ajustado para ligando CD40, complemento 3, proteína C reactiva, interleucina 8, interleucina 18, proteína quimiotáctica de monocitos 1, factor inhibidor de la migración de macrófagos, RANTES, resistina, receptor de TNF 2 y glóbulos blancos.

El IMC indica índice de masa corporal CC, cardiopatía coronaria IC, intervalo de confianza eGFR, tasa de filtración glomerular estimada EN-RAGE, receptor extracelular recién identificado para productos finales de glicación avanzada que se unen a proteína HDL, lipoproteína de alta densidad HR, cociente de riesgo SD, desviación estándar y TNF, factor de necrosis tumoral.

* Los cocientes de riesgo están representados por aumento de desviación estándar en EN-RAGE transformado logarítmicamente.

Las curvas de incidencia acumulada para los terciles de EN-RAGE ajustadas para los riesgos competitivos se muestran en la Figura 2. La probabilidad de 10 años del primer evento incidente de CC fue de 0.05 (IC del 95%, 0.03–0.08) para el primer tercil, 0.11 (95 % CI, 0.07–0.14) para el segundo tercil y 0.14 (95% CI, 0.10–0.18) para el tercer tercil.

Figura 2. Curvas de incidencia acumulada para el primer, segundo y tercer tercil de EN-RAGE sérico en relación con la incidencia de enfermedad arterial coronaria ajustadas para muerte por cardiopatía no coronaria competidora ≤ 10 años de seguimiento. EN-RAGE indica un receptor extracelular recientemente identificado para la proteína de unión a productos finales de glicación avanzada.

Después de excluir a los participantes con enfermedad renal crónica al inicio del estudio, la asociación entre EN-RAGE y CHD incidente se atenuó ligeramente (1.28 IC del 95%, 1.03–1.59 Tabla 3). Excluyendo a los participantes con diabetes mellitus tipo 2, las estimaciones del efecto de la asociación entre EN-RAGE y CHD no cambiaron: índice de riesgo 1,29 (IC del 95%, 1,04–1,60) en el modelo totalmente ajustado. Finalmente, después de excluir a los participantes que tomaban medicación antihipertensiva, la razón de riesgo no cambió (HR, 1,40 IC del 95%, 1,05–1,87).

Tabla 3. La asociación de EN-RAGE con cardiopatía coronaria en ausencia de pacientes con ERC, DT2 o uso de antihipertensivos

Modelo 1, ajustado por edad y sexo Modelo 2, ajustado por edad, sexo, IMC, presión arterial sistólica, uso de medicación antihipertensiva, colesterol HDL, colesterol total, tabaquismo (actual y no actual), diabetes mellitus tipo 2 prevalente y TFGe.

IMC indica índice de masa corporal CHD, IC de enfermedad coronaria, intervalo de confianza ERC, FGe de enfermedad renal crónica, tasa de filtración glomerular estimada EN-RAGE, receptor extracelular recién identificado para productos finales de glicación avanzada que se unen a proteína HDL, lipoproteína de alta densidad HR, peligro ratio y T2D, diabetes mellitus tipo 2.

* Los cocientes de riesgo están representados por aumento de desviación estándar en EN-RAGE transformado logarítmicamente.

La Tabla 4 muestra los resultados de las asociaciones entre EN-RAGE y las diferentes manifestaciones de cardiopatía coronaria por separado. Observamos la asociación más fuerte con la mortalidad por cardiopatía coronaria (HR, 1,56 IC del 95%, 1,19-2,04) en comparación con el infarto de miocardio y la revascularización, que no fueron significativas. Un mayor ajuste de los factores de riesgo cardiovascular tradicionales no cambió la estimación del efecto de la mortalidad por cardiopatía coronaria. La frecuencia cardíaca específica por causa no fue significativamente menor para la revascularización en comparación con el infarto de miocardio (Lunn y McNeil, PAG= 0,700), pero fueron casi significativos para la mortalidad por cardiopatía coronaria en comparación con la revascularización (Lunn y McNeil, PAG=0.055).

Cuadro 4. La asociación entre EN-RAGE e infarto de miocardio incidente, revascularización coronaria y mortalidad por cardiopatía coronaria

Modelo 1, ajustado por edad y sexo Modelo 2, ajustado por edad, sexo, IMC, presión arterial sistólica, uso de medicación antihipertensiva, colesterol HDL, colesterol total, tabaquismo (actual y no actual), diabetes tipo 2 prevalente y TFGe.

El IMC indica índice de masa corporal CHD, IC de enfermedad coronaria, intervalo de confianza eGFR, tasa de filtración glomerular estimada EN-RAGE, receptor extracelular recién identificado para productos finales de glicación avanzada que se unen a proteína HDL, lipoproteína de alta densidad y HR, índice de riesgo.

* Los cocientes de riesgo están representados por aumento de desviación estándar en EN-RAGE transformado logarítmicamente.

La estadística c del modelo tradicional de puntuación de riesgo de Framingham para el riesgo de cardiopatía coronaria a 10 años fue 0,730 (IC del 95%, 0,672–0,788). Cuando agregamos EN-RAGE al modelo, el estadístico c mejoró a 0,741 (IC del 95%, 0,683–0,799) con una diferencia de 0,011 (IC del 95%, −0,012 a 0,033 PAG= 0,33). La adición de EN-RAGE al modelo de puntuación de riesgo de Framingham dio como resultado un índice de reclasificación neto continuo significativo de 0,36 (IC del 95%, 0,05-0,67 PAG= 0,02) y una mejora de la discriminación integrada de 0,026 (IC del 95%, 0,009-0,0437 PAG=3.3×10 −03 ).

Discusión

En este estudio de cohorte prospectivo basado en la población, encontramos que niveles más altos de EN-RAGE se asociaron con un mayor riesgo de cardiopatía coronaria más allá de los factores de riesgo convencionales. Los ajustes adicionales de los marcadores inflamatorios, así como la exclusión de las personas enfermas, no cambiaron los resultados. Estos hallazgos sugieren EN-RAGE proinflamatorio como un nuevo marcador de riesgo inflamatorio para la enfermedad coronaria que representa una vía inflamatoria distinta en comparación con otros marcadores inflamatorios.

Estudios previos han observado niveles elevados de EN-RAGE en pacientes con trastornos inflamatorios crónicos, que incluyen enfermedad inflamatoria intestinal, 8 diabetes mellitus tipo 2, 9 enfermedad renal crónica, aterosclerosis subclínica, 10,11 y enfermedad de las arterias coronarias. 12-16 El diseño de los estudios mencionados es principalmente transversal y se realiza en poblaciones de pacientes. En un estudio prospectivo se demostró una asociación positiva entre EN-RAGE y mortalidad por cardiopatía coronaria, que incluyó a pacientes en hemodiálisis. 17 Además, un estudio reciente en individuos japoneses con cardiopatía coronaria observó una asociación significativa entre EN-RAGE y futuros eventos cardíacos adversos importantes. 18 Hasta donde sabemos, somos los primeros en investigar la asociación entre EN-RAGE y CHD en un estudio de cohorte prospectivo basado en la población con seguimiento a largo plazo.

Para abordar la posibilidad de confusión, ajustamos en el modelo multivariable para los diferentes factores de riesgo tradicionales de cardiopatía coronaria y marcadores inflamatorios previamente estudiados. Para abordar la cuestión de si nuestros resultados fueron impulsados ​​por un determinado subgrupo, analizamos los datos que excluyeron a los participantes con enfermedad renal crónica, diabetes mellitus tipo 2 y uso de antihipertensivos en los análisis de sensibilidad. En todos estos análisis, hubo un efecto consistente de EN-RAGE sobre el riesgo de cardiopatía coronaria, incluso después de ajustar los marcadores inflamatorios establecidos. Estos resultados sugieren un efecto de EN-RAGE sobre el riesgo de cardiopatía coronaria más allá de las vías metabólicas e inflamatorias bien establecidas.

Observamos una asociación más fuerte entre EN-RAGE y futuro infarto de miocardio y mortalidad por cardiopatía coronaria en comparación con la revascularización. Esto sugiere que EN-RAGE es más un factor determinante de los eventos coronarios agudos con inestabilidad de la placa que una enfermedad arterial coronaria estable. Esta observación de que EN-RAGE, un miembro de la familia de proteínas S100, es un fuerte determinante de eventos coronarios agudos está en línea con estudios previos que informaron niveles más altos de ARNm y niveles plasmáticos de proteínas de la familia S100 (S100A8 / 9) en pacientes con Infarto de miocardio con elevación del ST en comparación con casos de enfermedad arterial coronaria estable. 19 Además, un estudio post mórtem en personas fallecidas por muerte súbita cardíaca ha encontrado altos niveles de expresión de S100A12 en el músculo liso de la arteria coronaria en las placas rotas, especialmente en diabéticos.20 Sin embargo, la razón de riesgo de causa específica para los eventos de cardiopatía coronaria no fue significativamente diferente utilizando el método propuesto por Lunn y McNeil. Es posible que no tengamos el poder suficiente para observar una diferencia significativa debido al número limitado de casos en este análisis de causas específicas.

Al estudiar el valor agregado de EN-RAGE en la predicción del riesgo de cardiopatía coronaria a 10 años, encontramos una mejora en la predicción del riesgo cuando agregamos EN-RAGE a la puntuación de riesgo de Framingham. Esto sugiere que EN-RAGE, como marcador no invasivo de CC futura, podría ser útil para predecir el riesgo de CC en la población general. Aunque corregimos el cambio en el estadístico c por optimismo, creemos que se necesitan más estudios para establecer el papel potencial de EN-RAGE en la predicción del riesgo de cardiopatía coronaria.

EN-RAGE, un miembro de la familia de proteínas S100 de proteínas de unión al calcio de la mano EF, es un ligando inflamatorio producido endógenamente del RAGE 21 y del receptor tipo Toll 4. 22 RAGE es un miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas de moléculas de superficie celular y se expresa en múltiples tejidos, incluyendo células de endotelio, células de músculo liso vascular y macrófagos derivados de monocitos. 23 La unión de RAGE por EN-RAGE activa cascadas inflamatorias, incluida la vía de señalización proinflamatoria NF-κB, una vía bien conocida del sistema inmunológico innato involucrado en la patogenia de la EC. 21,24 Además, las vías de señalización intracelular desencadenadas por EN-RAGE pueden alterar la expresión génica y regular al alza la síntesis de la molécula de adhesión celular 1 vascular y la síntesis de la molécula de adhesión intracelular 1. 21 Considerando la aterosclerosis como una enfermedad inflamatoria crónica, la participación de RAGE por EN-RAGE puede desempeñar un papel importante en la patogénesis de la aterosclerosis y, posteriormente, la cardiopatía coronaria. De acuerdo con esta evidencia, la expresión de EN-RAGE en las células del músculo liso vascular puede modular la remodelación de la pared aórtica y estimula la producción de citocinas y aumenta el estrés oxidativo. Además, EN-RAGE acelera la aterosclerosis y la calcificación vascular en ratones sin apolipoproteína E. 26 Recientemente, se ha demostrado que EN-RAGE acelera el desarrollo de hipertrofia cardíaca y disfunción diastólica en ratones con enfermedad renal crónica. 27 También se ha observado que el efecto de activación de monocitos de EN-RAGE es dependiente del receptor 4 tipo Toll. 22 Se demostró que EN-RAGE facilita la activación de los monocitos inflamatorios por el receptor 4 tipo Toll y que este efecto fue modulado por RAGE. Los receptores tipo Toll se han investigado ampliamente en el campo de las enfermedades cardiovasculares porque se expresan en las membranas de las células vasculares y del miocardio. 28 El importante papel de EN-RAGE en la patogénesis de la aterosclerosis se enfatiza aún más en un estudio reciente en el que la inhibición farmacológica de la aterosclerosis mediada por S100A12 mejoró las características de la placa aterosclerótica, incluidos núcleos necróticos más pequeños, disminución de la calcificación y menor número de células inflamatorias. 29

Este estudio tiene ciertas fortalezas y limitaciones. El diseño de un estudio prospectivo basado en la población, la diversidad de los biomarcadores inflamatorios disponibles y el seguimiento a largo plazo de la EC pueden ser marcados como las principales fortalezas del presente estudio. Además, nuestros hallazgos son sólidos con respecto al estricto Bonferroni PAG valor que usamos como umbral para asociaciones significativas en el primer paso. También deben reconocerse varias limitaciones. Primero, aunque ajustamos nuestro análisis para diferentes factores de confusión potenciales, no podemos excluir el efecto de factores de confusión desconocidos o no medidos. Sin embargo, debido a que ajustamos los factores de riesgo tradicionales y de uso común para las CC y las vías inflamatorias, creemos que EN-RAGE como un marcador inflamatorio novedoso para las CC es interesante porque podría reflejar otras vías que conducen a las CC. En segundo lugar, tuvimos que excluir los biomarcadores inflamatorios con concentraciones séricas bajas. No obstante, los biomarcadores seleccionados tienen & gt60% de completitud de las mediciones, lo que indica una calidad de cuantificación aceptable. En tercer lugar, nuestra población es ≥55 años. Por lo tanto, la generalización de los resultados a una categoría de edad más joven debe realizarse con precaución. Nuestro estudio solo indica una asociación que creemos que se necesitan más estudios para establecer el papel causal de EN-RAGE en la patogenia de las enfermedades del corazón.

En conclusión, nuestro estudio sugiere que niveles más altos de EN-RAGE en suero se asocian con la incidencia de cardiopatía coronaria más allá de los factores de riesgo cardiovascular convencionales y los marcadores inflamatorios. Estos resultados proporcionan evidencia de un papel de EN-RAGE en el desarrollo de cardiopatía coronaria y sugieren que este marcador es un objetivo potencial para la terapia con medicamentos y la predicción de riesgos.


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Dirigirse a la señalización de RAGE en enfermedades inflamatorias

El receptor de productos finales de glicación avanzada (RAGE) es un receptor de reconocimiento de patrones multiligando implicado en diversos estados inflamatorios crónicos. RAGE se une y media la respuesta celular a una variedad de moléculas de patrón molecular asociadas al daño (DAMP) que incluyen AGE, HMGB1, S100 y ADN. RAGE también puede actuar como un sensor inmune innato de moléculas de patrón molecular asociadas a patógenos microbianos (PAMP), incluidas endotoxinas bacterianas, virus respiratorios y ADN microbiano. RAGE se expresa a niveles bajos en condiciones fisiológicas normales, pero está altamente regulado por aumento en la inflamación crónica debido a la acumulación de varios ligandos de RAGE. El bloqueo de la señalización de RAGE en modelos celulares y animales ha revelado que la selección de RAGE altera la inflamación y la progresión de las complicaciones vasculares diabéticas, la enfermedad cardiovascular (ECV) y la progresión y metástasis del cáncer. La relevancia clínica de RAGE en enfermedades inflamatorias se está demostrando en ensayos clínicos emergentes de nuevos inhibidores de RAGE de molécula pequeña.


Abstracto

Receptor for AGE (RAGE) es un miembro de múltiples ligandos de la superfamilia de inmunoglobulinas de moléculas de superficie celular. La participación de RAGE por sus ligandos de transducción de señales provoca la infiltración y activación de células inflamatorias en la pared del vaso. En la diabetes, cuando está alimentado por estrés oxidante, hiperglucemia y tensiones superpuestas como hiperlipidemia o lesión arterial aguda denudación del endotelio / globo, el eje ligando-RAGE amplifica el estrés vascular y acelera la aterosclerosis y la expansión de la neoíntima. En esta breve sinopsis, revisamos el uso de modelos de roedores para probar estos conceptos. Tomados en conjunto, nuestros hallazgos apoyan la premisa de que RAGE es un paso de amplificación en la inflamación vascular y la aceleración de la aterosclerosis. Los estudios futuros deben probar rigurosamente el impacto potencial del bloqueo de RAGE en sujetos humanos, tales ensayos están en el horizonte.

La participación del ligando del receptor para productos finales de glicación avanzada (RAGE) provoca inflamación y perturbación vascular. En la diabetes, cuando se alimenta de oxidación, hiperglucemia y tensiones superpuestas, el eje ligando-RAGE acelera la aterosclerosis y la expansión de la neoíntima. Los estudios en modelos de diabetes en roedores sugieren que es lógico probar el impacto del bloqueo de RAGE en seres humanos.

El receptor de productos finales de glicación avanzada (RAGE) es un miembro de múltiples ligandos de la superfamilia de inmunoglobulinas de moléculas de superficie celular. 1,2 Su capacidad para reconocer múltiples clases de ligandos, como los productos finales de glicación avanzada (AGE), S100 / calgranulinas, anfoterina, péptido amiloide-β y fibrillas de hoja β, y MAC-1, 3-8 sugiere que el repertorio de los efectos dependientes de RAGE en los tejidos pueden ser diversos. En este contexto, la función de este receptor no parece ser la de degradar / desintoxicar el ligando, sino más bien, mediante la transducción de señales activada por el dominio citosólico de RAGE, propagar respuestas inmunes / inflamatorias. 3,9

Aunque los AGE son una clase heterogénea de compuestos, los estudios han demostrado que una clase particular de estas especies, los aductos de proteínas / lípidos con N ε carboximetil lisina (CML), son ligandos de transducción de señales específicos de RAGE. 9 Los aductos modificados para CML pueden generarse mediante una variedad de estímulos. Además de la generación en la hiperglucemia, los aductos de CML también pueden generarse mediante la activación de la vía de la mieloperoxidasa. 10 Estudios recientes han demostrado que el peroxinitrito puede inducir la formación de CML por escisión de un producto de Amadori y, también, por la generación de α-oxoaldehídos reactivos a partir de glucosa. 11 Estas consideraciones resaltan el concepto de que una vez que se pone en marcha, la hiperglucemia y el estrés oxidativo asociados a la diabetes magnifican la producción de una amplia gama de especies bioquímicas que se acumulan para estimular la activación celular y mantener la perturbación tisular.

Además, en la diabetes, se pueden activar distintos mecanismos para impulsar aún más el ciclo de generación de AGE y estrés oxidativo. 12 Un ejemplo específico es la vía de los poliol. La glucosa se reduce a sorbitol por la aldosa reductasa, la enzima central de esta vía. Esto da como resultado la generación de fructosa La fructosa se convierte en fructosa-3-fosfato por la acción de la 3-fosfoquinasa. Un producto principal de esta reacción es la 3-desoxiglucosona, un precursor clave en la generación de múltiples tipos de AGE, como los aductos de CML y otros. 13,14 Se ha demostrado que en la insuficiencia renal, los niveles plasmáticos de 3-desoxiglucosona aumentan en paralelo con el aumento de los niveles de aldosa reductasa en los eritrocitos. 14 La administración de un inhibidor de la aldosa reductasa, epalrestat, a sujetos con diabetes resultó en niveles reducidos de aductos de CML y sus precursores en eritrocitos y niveles plasmáticos reducidos de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico. 15 Estas consideraciones resaltan el concepto de que en la diabetes intervienen múltiples fuerzas para aumentar la generación de especies bioquímicas dañinas para los tejidos que señalan la perturbación celular crónica.

De hecho, una vez que se forman los AGE, su interacción con RAGE desencadena la generación de citocinas proinflamatorias, moléculas de adhesión y quimiocinas. La atracción de células inflamatorias como leucocitos polimorfonucleares, fagocitos mononucleares y linfocitos T al tejido proporciona un mecanismo para mantener la respuesta inflamatoria. En el contexto de RAGE, estas células pueden albergar S100 / calgranulinas proinflamatorias y anfoterina. Una vez que estas moléculas se liberan en el tejido, la interacción S100 / calgranulinas / anfoterina-RAGE puede amplificar la inflamación y la lesión tisular por vías autocrinas y paracrinas. 3,16-18

Modelos de aterosclerosis en diabetes

Múltiples investigaciones epidemiológicas apoyan la premisa de que la diabetes acelera la aterosclerosis. Los sujetos humanos con diabetes muestran una sorprendente aceleración de la aterosclerosis, además de una mayor incidencia de eventos cardíacos, como ataques cardíacos y accidentes cerebrovasculares. 19-22 Los estudios en seres humanos indican que RAGE y sus ligandos de transducción de señales se expresan en la vasculatura diabética y en placas ateroscleróticas. 23,24 Cipollone et al demostraron que, en comparación con las placas humanas no diabéticas, las placas diabéticas se caracterizaban por un mayor número de fagocitos mononucleares, linfocitos T y células HLA-DR +, en paralelo con una mayor expresión de RAGE, NF-kB activado, cox -2, y metaloproteinasas de matriz. Se encontró que el grado de expresión de RAGE se correlaciona con los niveles de hemoglobina glicosilada. 24 Aunque tales estudios no delinean el vínculo bioquímico / molecular entre el eje ligando / RAGE, la inflamación y la aterosclerosis, estos experimentos apoyan la premisa de que RAGE puede participar en el aumento de la lesión vascular y la progresión de la aterosclerosis.

Se están realizando estudios en modelos murinos para probar la premisa de que RAGE contribuye a la aceleración de la aterosclerosis en la diabetes.

Modelos animales y aterosclerosis diabética acelerada

El primer modelo murino que respalda el concepto de que la hiperglucemia acelera la aterosclerosis probó la hipótesis de que la inducción de la diabetes mediante el uso de estreptozotocinas múltiples en dosis bajas daría como resultado un aumento de la aterosclerosis en ratones alimentados con una dieta de tipo occidental. 25 En estos primeros estudios, se utilizaron ratones BALB / cy C57BL / 6 de tipo salvaje. En estos animales, la manipulación genética no se utilizó como un medio para desencadenar / mejorar el desarrollo de la aterosclerosis. Más bien, la modificación de la dieta indujo hiperlipidemia. En este estudio, Kunjathoor et al demostraron que los ratones BALB / c alimentados con una dieta aterogénica y que se volvieron diabéticos con estreptozotocina mostraron un aumento de 17 veces en el área de la lesión aterosclerótica en comparación con los ratones tratados con citrato (no diabéticos) alimentados con la misma dieta aterogénica. Aunque las lesiones se limitaron a estrías grasas, los estudios histológicos revelaron, no obstante, la presencia de un exceso de fagocitos mononucleares y células de músculo liso en las placas. 25 Curiosamente, estos investigadores encontraron que no había diferencias en el área media de la lesión aterosclerótica entre ratones C57BL / 6 diabéticos (estreptozotocina) versus no diabéticos aterogénicos alimentados con dieta. 25 Estas consideraciones subrayan la influencia crítica que pueden ejercer múltiples factores en el inicio y el progreso de la aterosclerosis, como los antecedentes genéticos, la dieta y el entorno, especialmente en el contexto de hiperglucemia superpuesta.

Además de la modulación dietética del perfil de lípidos, la modificación genética proporciona un medio para alterar el perfil de lípidos en ratones. Para probar el papel de la hiperglucemia en la aterosclerosis potencialmente acelerada, utilizamos ratones en los que la manipulación genética hizo que los animales se volvieran hiperlipidémicos mediante la deleción de la apolipoproteína E (apo E - / -). 26-27 Los ratones Apo E - / - presentan lesiones de múltiples fases de aterosclerosis distribuidas por todo el árbol arterial. 28 Con una dieta de pienso normal, el trabajo del grupo de Russell Ross mostró que los ratones apo E - / - mostraban lesiones de células espumosas desde las 8 semanas de edad a las 15 semanas de edad, las lesiones avanzadas eran evidentes. 28 Las lesiones avanzadas consistieron en un casquete fibroso que contenía células musculares lisas rodeadas por una matriz de tejido conectivo que cubría un núcleo necrótico con macrófagos espumosos. 28 Tras la inducción de una dieta de tipo occidental, las lesiones generalmente estaban más avanzadas. 28

Basándonos en la observación de que los ratones apo E - / - desarrollaron lesiones complejas características de las placas humanas avanzadas, buscamos probar la hipótesis de que la inducción de hiperglucemia en estos animales aceleraría aún más la aterosclerosis y la complejidad de las lesiones. En los primeros estudios, hicimos que ratones macho apo E - / - de 6 semanas de edad fueran diabéticos con estreptozotocina. 29 Estos ratones apo E - / - se retrocruzaron previamente con generaciones & gt10 en C57BL / 6. Después de 6 semanas de diabetes establecida, a la edad de ~ 13 a 14 semanas, los ratones diabéticos apoE - / - exhibieron lesiones discretas en los puntos de ramificación principales en la aorta torácica y en el arco de la aorta. Por el contrario, los ratones apoE - / - euglucémicos de la misma edad no mostraron lesiones en la aorta proximal. 30 El análisis morfométrico cuantitativo reveló un aumento de ~ 5 veces en el área media de la lesión a nivel del seno aórtico en ratones diabéticos apoE - / - en comparación con animales apoE - / - no diabéticos (Figura 1a). El análisis histológico de ratones apoE - / - euglucémicos reveló vetas grasas típicas visualizadas con rojo aceite O. A esta edad, la mayoría de las lesiones en los animales no diabéticos no progresaron a estadios avanzados. Sin embargo, en ratones apoE - / - diabéticos de la misma edad, se observaron placas fibrosas más grandes y más avanzadas con una propensión a la formación de casquete (Figura 1b). La complejidad de la lesión se definió por la presencia de hendiduras de colesterol, necrosis o formación de capa fibrosa. 30

Figura 1. El bloqueo de RAGE suprime la aterosclerosis acelerada en ratones diabéticos apo E - / -: intervención temprana. Los ratones Apo E - / - se hicieron diabéticos con estreptozotocina o se trataron con tampón citrato (control). En ratones diabéticos, los animales se trataron con vehículo una vez al día, albúmina de suero murino (MSA) o diferentes dosis diarias de sRAGE. Después de 6 semanas de tratamiento con diabetes o control, se disecaron el corazón y la aorta. Se muestra el impacto del bloqueo de RAGE en el área de la lesión (a) y la complejidad (b).

En este modelo, la diabetes fue seguida por un aumento del colesterol total en plasma dependiente del tiempo. 30 Después de 6 semanas de diabetes, se observó un aumento de ~ 2 veces en el colesterol en ratones diabéticos apoE - / - en comparación con animales no diabéticos, mientras que los niveles de triglicéridos en plasma no cambiaron. El fraccionamiento del colesterol plasmático mediante ultracentrifugación en gradiente de densidad reveló aumentos significativos en quilomicrones / lipoproteínas de muy baja densidad (≈2,6 veces) y lipoproteínas de densidad intermedia / lipoproteínas de baja densidad (LDL) (≈2,5 veces) en diabéticos de la misma edad. versus ratones euglucémicos apoE - / -, mientras que el HDL se alteró más modestamente (≈1,5 veces mayor en ratones diabéticos en comparación con ratones de control). 30 Por el contrario, la ultracentrifugación en gradiente de densidad mostró diferencias mínimas o nulas en el perfil de triglicéridos plasmáticos. 30

Paralelamente con la elevación de la glucosa, la formación mejorada de AGE en ratones diabéticos apoE - / - se demostró por un aumento de 2.3 veces en los epítopos inmunorreactivos de AGE en material soluble en ácido extraído del tejido renal después de 6 semanas de diabetes, en comparación con apoe euglucémico. Controles E - / - y aumento de aproximadamente 2,5 veces en los AGE plasmáticos en ratones diabéticos apoE - / - en comparación con ratones de control no diabéticos. 30 Estudios posteriores revelaron que los lisados ​​aórticos recuperados de ratones apo E - / - diabéticos mostraron niveles aumentados de la familia de ligandos proinflamatorios RAGE, epítopos S100 / calgranulina, en comparación con ratones apo E - / - no diabéticos de la misma edad. 31

Es interesante que aunque Kunjathoor et al no encontraron aterosclerosis sustancial en ratones C57BL / 6 diabéticos (estreptozotocina), 25 el desencadenante de la aterosclerosis, hiperlipidemia inducida por la dieta, difirió de los medios para inducir hiperlipidemia en ratones apoE - / -. Estos hallazgos resaltan el concepto de que, además de los antecedentes genéticos, otras influencias, como el grado y la naturaleza de la elevación de lípidos, pueden influir de manera importante en el desarrollo y la progresión de la aterosclerosis en la diabetes.

Aterosclerosis diabética acelerada: el papel de RAGE

Como consecuencia del desarrollo del modelo estreptozotocina-apo E - / - de aterosclerosis compleja acelerada en diabetes murina, se probó el impacto del bloqueo de RAGE. En los primeros estudios, se utilizó el RAGE soluble en murino (sRAGE), los dos tercios extracelulares del receptor que funciona para unirse al ligando y, por lo tanto, bloquear la interacción y la activación del RAGE de la superficie celular. Se administró 32 RAGE soluble una vez al día por vía intraperitoneal a ratones apo E - / - diabéticos, comenzando inmediatamente en el momento en que se desarrolló la hiperglucemia. En comparación con los ratones diabéticos que recibieron seroalbúmina de ratón (MSA), los ratones diabéticos apo E - / - tratados con sRAGE mostraron una supresión dependiente de la dosis de la aterosclerosis acelerada (Figura 1a y 1b, respectivamente). Además de la disminución del área de la lesión aterosclerótica, la complejidad de la lesión disminuyó en los ratones diabéticos tratados con sRAGE. 30 Esta faceta del impacto del bloqueo de RAGE sugirió que el antagonismo de este eje tenía el potencial de suprimir la progresión de la lesión y, posiblemente, el desarrollo de placas inestables altamente inflamadas.

Es importante destacar que el tratamiento de ratones diabéticos con sRAGE no afectó el grado de hiperglucemia o el nivel de insulinemia en comparación con los ratones diabéticos tratados con albúmina de suero murino. El colesterol total y los triglicéridos tampoco se vieron afectados por el tratamiento con sRAGE, y la composición de las partículas lipídicas tampoco se modificó en los ratones apoE - / - tratados con sRAGE diabéticos en comparación con los ratones que recibieron seroalbúmina murina. 30 Estos datos sugirieron que los efectos beneficiosos del bloqueo de RAGE eran tanto independientes de la glucemia como de los lípidos, lo que indica que los factores exclusivos del entorno diabético se modulaban favorablemente. En este contexto, especulamos que la hiperglucemia y la hiperlipidemia alimentan la generación de AGE, por lo que sRAGE ejerce su impacto aguas abajo de los factores de riesgo tradicionales.

De acuerdo con esta premisa, los niveles de AGE en plasma y riñón en ratones diabéticos se suprimieron a niveles observados en animales no diabéticos mediante la administración de sRAGE de una manera dependiente de la dosis. Se observaron resultados similares en el examen de los AGE en plasma. 30 Estos hallazgos apoyan la afirmación de que los desencadenantes de la formación de AGE también podrían ser suprimidos por el bloqueo de RAGE. Para comenzar a abordar esto, se aisló LDL de ratones tratados con sRAGE y tratados con albúmina de suero murino. La susceptibilidad a la oxidación inducida por cobre de LDL 33 recuperada de ratones apoE - / - diabéticos tratados con sRAGE disminuyó en comparación con los ratones diabéticos tratados con albúmina de suero murino, según lo evaluado por el tiempo medio de demora hasta la formación de dienos conjugados. 30

Bloqueo de RAGE: Intervención tardía

Para determinar el impacto potencial del bloqueo de RAGE en lesiones ateroscleróticas establecidas, se utilizó el modelo apo E - / - de diabetes inducida por estreptozotocina. 34 Los ratones se volvieron diabéticos con estreptozotocina a la edad de 6 semanas y no se trataron hasta las 14 semanas. A la edad de 14 semanas, ciertos ratones diabéticos apo E - / - fueron sacrificados para establecer el área / complejidad de la lesión aterosclerótica “de referencia”.La inducción de diabetes se asoció con un aumento del área de la lesión aterosclerótica en comparación con los controles no diabéticos a la edad de 14 y 20 semanas (Figura 2b y 2a y 2d y 2c, respectivamente). En ratones diabéticos tratados con sRAGE desde las edades de 14 a 20 semanas, el área de la lesión aterosclerótica se redujo significativamente en comparación con los ratones tratados con albúmina de suero murino (Figura 2e y 2d, respectivamente). Las secciones transversales teñidas con rojo aceite de la aorta a través del seno aórtico revelaron que, en comparación con los ratones no diabéticos, los ratones diabéticos mostraban lesiones ateroscleróticas más grandes y extensas a las 14 semanas (Figura 2f y 2g, respectivamente) y a las 20 semanas (Figura 2h y 2i , respectivamente). En ratones diabéticos tratados con sRAGE, las lesiones ateroscleróticas fueron más pequeñas que las observadas en ratones diabéticos tratados con vehículo a la edad de 20 semanas (Figura 2j y 2i, respectivamente).

Figura 2. El bloqueo de RAGE suprime la aterosclerosis acelerada en ratones diabéticos apo E - / -: intervención tardía. Los ratones Apo E - / - se volvieron hiperglucémicos usando estreptozotocina o se trataron con tampón de citrato a la edad de 6 semanas. A la edad de 14 semanas, los ratones fueron tratados con sRAGE, 100 μg por día, o albúmina de suero murino (MSA). Los ratones se sacrificaron a la edad de 20 semanas y las aortas se disecaron y fotografiaron (aae). En otros estudios, se prepararon secciones de la raíz aórtica y se tiñeron con aceite rojo O (faj). Barra de escala: de la a a la e, 0,3 cm de la faj, 125 μm.

Se realizó un análisis morfométrico cuantitativo y se confirmó que los ratones diabéticos tratados con sRAGE a las 20 semanas mostraron una disminución significativa en el área media de la lesión aterosclerótica en comparación con los animales diabéticos tratados con albúmina de suero murino (Figura 3a). Aunque el área media de la lesión aumentó en los ratones diabéticos a las 20 semanas frente a las 14 semanas, el área media de la lesión en los ratones diabéticos tratados con sRAGE a las 20 semanas no fue significativamente diferente de la observada en los ratones diabéticos a las 14 semanas (Figura 3a). 34 Además, a la edad de 20 semanas, el área media de la lesión en ratones diabéticos tratados con sRAGE se redujo significativamente en comparación con las lesiones en animales no diabéticos de la misma edad (Figura 3a). 34

Figura 3. El bloqueo de RAGE suprime la aterosclerosis establecida en ratones diabéticos apo E - / -: área de lesión y complejidad. Se determinó la cuantificación del área media de la lesión aterosclerótica (a) y el número medio de lesiones complejas por sección (b).

Además, examinamos la complejidad de la lesión (como se define, tapas fibrosas, tapas de colesterol o necrosis de la lesión) 30 en estos animales. En ratones diabéticos tratados con sRAGE desde las 14 semanas hasta las 20 semanas, el número medio de lesiones complejas se redujo significativamente en comparación con los animales diabéticos tratados con albúmina sérica murina, y la complejidad de la lesión no fue significativamente diferente en los ratones diabéticos tratados con sRAGE a las 20 semanas en comparación con ratones diabéticos a la edad de 14 semanas (Figura 3b). 34 Se observó una tendencia hacia una menor complejidad de la lesión en los ratones diabéticos tratados con sRAGE a las 20 semanas de edad en comparación con los animales no diabéticos de la misma edad, aunque los resultados no alcanzaron significación estadística (Figura 3b). 34 En paralelo con la estabilización del área y la complejidad de la lesión aterosclerótica, el bloqueo de RAGE se asoció con una disminución de la expresión vascular de la molécula de adhesión celular vascular-1, el péptido quimioatrayente de monocitos JE-1, la ciclooxigenasa-2, los epítopos de nitrotirosina, la metaloproteinasa de matriz-9 (antígeno y actividad) y epítopos de factor tisular (Figura 3b). 34

Además de las vías bioquímicas y moleculares vinculadas a la aterosclerosis, examinamos el contenido de colágeno dentro de las placas ateroscleróticas mediante tinción con rojo de Picrosirius y microscopía de luz polarizada. La diabetes se asoció con un aumento significativo en la extensión de colágeno por lesión en ratones diabéticos frente a controles no diabéticos a las 20 semanas de edad. En presencia de bloqueo de RAGE, se observó una disminución significativa en el contenido de colágeno por lesión en comparación con la observada en ratones diabéticos tratados con albúmina de suero murino. 34 El grado de deposición de colágeno en ratones diabéticos tratados con sRAGE no fue significativamente diferente al observado en animales no diabéticos de la misma edad o ratones diabéticos a la edad de 14 semanas. 34 Proponemos que en la diabetes, el aumento en el número de células de músculo liso y el contenido de colágeno en las placas ateroscleróticas diabéticas, el aumento significativo en el número de fagocitos mononucleares y la notable mejora de los mecanismos proinflamatorios dentro de las lesiones inclina el equilibrio entre la inflamación y la estabilidad de la lesión. Además, especialmente en las lesiones diabéticas, el aumento de la expresión / actividad de la metaloproteinasa de la matriz y la generación de antígeno del factor tisular dentro de las placas aumenta la probabilidad de progresión e inestabilidad de la placa.

Ciertamente, estos conceptos requieren más pruebas en distintas especies, como cerdos o primates no humanos, para abordar el papel potencial del bloqueo de RAGE en la supresión de la inestabilidad de la placa.

Diabetes y aterosclerosis: otros modelos para probar el impacto de RAGE

Es importante señalar que los efectos del bloqueo de RAGE sobre la aterosclerosis no se limitaron a los ratones apo E - / -. Se utilizó un modelo murino adicional para desencadenar hipercolesterolemia basal sobre la cual superponer el estrés hiperglucémico. Cuando los ratones deficientes en el receptor de LDL se volvieron diabéticos y se alimentaron con una dieta de pienso normal, no enriquecido en grasa, se produjo un aumento del área de la lesión aterosclerótica. Con la administración de sRAGE, se atenuó la aterosclerosis acelerada. 35 Estos hallazgos contradecían el trabajo de Reavan et al. Estos investigadores encontraron que la inducción de diabetes por estreptozotocina en ratones receptores de LDL - / - alimentados con una dieta alta en grasas durante un período de tiempo prolongado no resultó en una aceleración de la aterosclerosis. 36 Postulamos que las diferencias entre los resultados de estos 2 estudios pueden atribuirse, al menos en parte, a la premisa de que en la raíz aórtica, el grado de aterosclerosis que se puede lograr es finito. Por lo tanto, especialmente durante ciclos prolongados en ratones alimentados con dieta occidental, las diferencias entre los grupos diabéticos y no diabéticos pueden volverse menos evidentes a medida que la aterosclerosis en los animales no diabéticos continúa progresando.

Además, recientemente ampliamos estos conceptos a modelos murinos de diabetes tipo 2 resistente a la insulina. Para lograr esto, criamos ratones apo E - / - en el fondo db / db. Estos animales, deficientes en la señalización del receptor de leptina, muestran una notable hiperinsulinemia, hiperglucemia y obesidad. En comparación con los compañeros de camada apo E - / - no diabéticos, los ratones apo E - / - / db / db mostraron un aumento de la aterosclerosis, que disminuyó con la administración diaria de sRAGE. 37

Ratones con diabetes, aterosclerosis e hiperlipidemia: efecto de distintas intervenciones

Otros investigadores también han utilizado los modelos murinos de ratones diabéticos apo E y receptores de LDL inducidos por estreptozotocina para probar el impacto de distintas vías e intervenciones. Por ejemplo, Lin et al demostraron que la restricción dietética de glicotoxinas proporciona protección antiaterogénica en ratones apo E - / - tratados con estreptozotocina. Estos hallazgos brindan más apoyo a la hipótesis AGE en la lesión vascular. En el grupo de ratones diabéticos apo E - / - restringidos por AGE, la inmunohistoquímica reveló una disminución de la acumulación de AGE y receptores de AGE, incluido RAGE, en paralelo con un número reducido de células inflamatorias y expresión del factor tisular, la molécula de adhesión celular 1 vascular y la EJ. -Péptido quimioatrayente de monocitos-1 en las lesiones vasculares. 38 Levi et al han demostrado que el tratamiento de ratones receptores de LDL diabéticos - / - con agonistas gamma activados por proliferadores de peroxisomas como rosiglitazona atenúa la aterosclerosis en estos animales, sin afectar los niveles de glucosa en sangre. 39 El papel de la enzima convertidora de angiotensina fue estudiado por Candido et al.Estos investigadores demostraron que la administración de perindopril durante 20 semanas previno la aterosclerosis asociada a la diabetes en paralelo con una expresión aórtica reducida de la enzima convertidora de angiotensina, factor de crecimiento del tejido conectivo y adhesión de células vasculares. sobreexpresión de la molécula-1. 40 En otros estudios, Tse et al probaron el impacto del 17 β-estradiol en ratones machos diabéticos apo E - / - y demostraron que el tratamiento crónico con 17 β-estradiol redujo el área de la lesión en múltiples segmentos vasculares de estos ratones, en paralelo con una disminución glucosa en sangre y niveles de triglicéridos. 41

Por tanto, tomados en conjunto, tales modelos de ratón de aterosclerosis diabética proporcionan una plantilla para la disección de vías moleculares vinculadas a la patogénesis de las complicaciones macrovasculares de la diabetes y, también, el impacto potencial de las intervenciones terapéuticas.

La diabetes y el problema de la reestenosis

Los estudios epidemiológicos indican que en sujetos humanos con diabetes, la reestenosis exagerada suele acompañar a la lesión arterial aguda, como la inducida por la angioplastia terapéutica. 42-44 Los estudios demostraron además que la colocación de stents en el vaso tratado no ofrece una protección completa contra la reestenosis y los eventos coronarios. 42,43 Incluso con el desarrollo reciente de los stents recubiertos de sirolimus, todavía no está claro si los sujetos diabéticos se beneficiarán por completo de esta nueva terapia. 45–47

Para analizar los eventos bioquímicos y moleculares relacionados con la reestenosis mejorada en sujetos humanos diabéticos, primero fue necesario establecer modelos animales para abordar fácilmente estos conceptos.

Estudios en ratas

Los primeros estudios con ratas diabéticas se realizaron en ratas Zucker obesas que mostraban diabetes tipo 2 resistente a la insulina. 48 Curiosamente, en comparación con la inducción de diabetes (tipo 1) en ratas Sprague-Dawley por estreptozotocina en las que no se exageró la hiperplasia de la neoíntima, Park et al demostraron que las ratas Zucker obesas sometidas a lesión por balón carotídeo mostraron un aumento de & gt2 veces en el área de la neoíntima en comparación con con ratas delgadas Zucker (no diabéticas) el día 21 después de la lesión. 48 En la íntima de estos animales, la proliferación celular aumentó notablemente, comenzando en el día 3 y persistiendo hasta el día 14. Este modelo animal se usó luego para probar el papel del bloqueo de RAGE. La administración de sRAGE se inició justo antes de la lesión arterial y se continuó durante la primera semana después de la lesión con balón. En comparación con el tratamiento con vehículo (albúmina), las ratas tratadas con sRAGE mostraron una disminución significativa en la expansión de la neoíntima. 49 Un hallazgo clave en este estudio fue la marcada reducción en la incorporación de bromodesoxiuridina en las células del músculo liso de la neoíntima en expansión en ratas tratadas con sRAGE. Estos experimentos sugirieron fuertemente que las células musculares lisas que expresan RAGE, al menos en parte, contribuyeron de manera importante a la expansión de la neoíntima mejorada asociada a la diabetes después de una lesión aguda.

Estudios en modelos murinos

Estos hallazgos sugirieron que era lógico analizar más a fondo el papel de RAGE en la lesión arterial. En modelos de rata, sin embargo, la incapacidad de utilizar enfoques transgénicos / knockout limitó este enfoque. Además, los estudios directos en modelos murinos facilitarían las pruebas de ratones genéticamente modificados con RAGE, apoyando así la premisa de que el objetivo principal de sRAGE era el receptor mismo. Por tanto, para utilizar modelos murinos, se indujo una lesión endotelial aguda de la arteria femoral según un modelo previamente establecido y validado. Se realizó una lesión inducida por alambre guía en la arteria femoral y se probó el impacto de la modificación tanto farmacológica como genética de RAGE. RAGE y sus ligandos, CML-AGE y S100 / calgranulinas, se regularon positivamente en la pared del vaso femoral después de la lesión, particularmente en las células del músculo liso. 51 El día 28 después de la lesión, se observó una disminución dependiente de la dosis en la relación íntima / media (I / M) en ratones tratados con sRAGE versus vehículo (albúmina de suero murino). 51 Es importante destacar que los ratones RAGE - / - homocigotos mostraron una relación I / M disminuida el día 28 después de la lesión en comparación con los animales de control de la camada sometidos a denudación arterial (Figura 4a a 4c). El número de células de músculo liso en proliferación se redujo significativamente en los ratones RAGE - / - frente a los controles. 51

Figura 4. Los ratones RAGE (0) homocigotos y los ratones transgénicos que expresan RAGE negativo dominante (DN) deficiente en señalización en células de músculo liso muestran una expansión neointimal disminuida como consecuencia de una lesión arterial aguda. Se sometieron ratones homocigóticos RAGE - / - (a ac) y ratones transgénicos que expresaban DN RAGE selectivamente en células de músculo liso (impulsadas por el promotor alfa SM22) (d) y compañeros de camada de tipo salvaje a lesión por alambre guía de la arteria femoral. La relación íntima / media se determinó el día 28 después de la lesión (a, d). La tinción elástica de Von Gieson se realizó en una sección de arteria femoral representativa de un ratón portador de RAGE (b) de tipo salvaje y un ratón RAGE - / - (c). Barra de escala: 50 μm.

Como los ratones RAGE - / - homocigotos no expresan RAGE en ningún tipo de célula, se usó una estrategia adicional para diseccionar específicamente el papel de RAGE de células de músculo liso en la modulación de la expansión neointimal en la lesión arterial aguda. Estudios anteriores demostraron que la deleción del dominio citosólico de RAGE impartía un efecto negativo dominante (DN) cuando se transfectaron células similares a fagocitos mononucleares o vasculares portadoras de RAGE de tipo salvaje con construcciones que codifican DN RAGE, un efecto DN sobre la incubación con RAGE ligandos como S100B o CML-AGE. 3,9 Debido a que las células de músculo liso eran las principales células que expresan RAGE en la neoíntima en expansión, 51 estos conceptos se probaron en ratones transgénicos que expresan DN RAGE específicamente en células de músculo liso impulsadas por el promotor SM22α. En comparación con los compañeros de camada de tipo salvaje, los ratones transgénicos SM22 DN RAGE sometidos a lesión arterial mostraron una disminución significativa en la relación I / M el día 28 (Figura 4d). Por lo tanto, estos experimentos proporcionaron más apoyo para los roles de RAGE en la expansión de la neoíntima. Además del bloqueo farmacológico de RAGE, los ratones RAGE modificados genéticamente (deleción o interrupción de la transducción de señales de las células del músculo liso) mostraron una disminución de la expansión de la neoíntima provocada por la lesión.

Sin embargo, una limitación de la inducción de lesión arterial en ratones C57BL / 6 es que hay poca evidencia de afluencia de células inflamatorias en la pared del vaso lesionado en animales de tipo salvaje. Para abordar este concepto, se indujo la lesión de la arteria femoral en ratones apo E - / - basándose en la premisa de que la perturbación vascular basal secundaria a hiperlipidemia aumentaría la respuesta a la lesión arterial, incluida la migración de células inflamatorias. Encontramos que las relaciones I / M eran más altas, lo que refleja una mayor expansión de la neoíntima en los vasos de los ratones apo E - / - 28 días después de la lesión frente a los ratones C57BL / 6 (relación I / M ≈2 veces más alta). 51 En ratones euglucémicos apo E - / -, la administración de sRAGE disminuyó la relación I / M el día 28. En paralelo, también se redujo el número de fagocitos mononucleares que infiltraban la arteria lesionada. 51 Por tanto, los ratones apo E - / - pueden proporcionar un sistema superior para probar el papel de las células del músculo liso y los fagocitos mononucleares RAGE en la respuesta a la lesión arterial aguda.

Además, estos estudios destacaron el papel de la señalización Jak / Stat dependiente de RAGE en las células del músculo liso. En los vasos femorales después de la lesión, aunque se observó un aumento de la fosforilación de ERK 1/2, proteína quinasa B (akt) y Jak2 / Stat3 frente al tratamiento simulado, sRAGE pareció ejercer solo sus efectos sobre la señalización de Jak2 / Stat3. 51

Diabetes y reestenosis: otros modelos e intervenciones distintas

También se han probado modelos de roedores diabéticos de lesión arterial para determinar el impacto de distintas intervenciones en la expansión de la neoíntima. Phillips et al utilizaron ratones apo E - / - alimentados con dieta occidental para demostrar que estos ratones desarrollan diabetes resistente a la insulina. La administración de rosiglitazona previno el desarrollo de hiperglucemia e hiperinsulinemia. 52 Paralelamente, la expansión de la neoíntima se redujo en un 65% después de la lesión arterial en ratones agonistas gamma activados por proliferadores de peroxisomas (rosiglitazona) versus apo E - / - alimentados con vehículo. Esta intervención también redujo la infiltración de macrófagos en la neoíntima en expansión. 52 Nótese que estos estudios contrastan con los de Levi et al 39 con respecto al efecto de la rosiglitazona sobre la hiperglucemia. Específicamente, en los estudios de Levi, los ratones apo E - / - se volvieron francamente diabéticos por una deficiencia relativa de insulina usando estreptozotocina 39 en los estudios de Phillips, la hiperglucemia fue inducida por la alimentación con la dieta occidental, lo que provocó resistencia a la insulina. 54

En otros estudios, Min et al administraron troglitazona a ratas grasas Otsuka Long-Evans Tokushima y encontraron que la proliferación de las células del músculo liso se redujo notablemente, en paralelo con la expansión de la neoíntima disminuida después de la lesión del balón carotídeo. 53 El papel de las glicotoxinas dietéticas (AGE) en la expansión de la neoíntima fue probado directamente en ratones apo E - / - por Lin et al. Los ratones se asignaron al azar a una dieta de AGE alta o baja (la última con un contenido de AGE 10 veces menor) y se sometieron a lesión de la arteria femoral. En paralelo con la expansión de la neoíntima disminuida en los ratones alimentados con dieta baja en AGE, el contenido de AGE se redujo en la pared del vaso lesionado. 54

La naturaleza compleja de los modelos murinos / roedores en la disección de la respuesta biológica a la lesión arterial superpuesta a la hiperglucemia crónica fue subrayada por los estudios de Stephenson et al. 55 Estos investigadores informaron que los ratones db / db mostraron una expansión de la neoíntima marcadamente disminuida como consecuencia de la lesión del alambre endoluminal de la arteria femoral en comparación con los controles de tipo salvaje. 55 Cuatro horas después de la lesión arterial aguda, la muerte del músculo liso medial se redujo en ratones db / db frente a los de tipo salvaje. Sin embargo, la proliferación de células de músculo liso no pareció diferir entre ratones db / db versus ratones de tipo salvaje. 55 Estos hallazgos sugieren un papel importante de la leptina en la modulación de las propiedades estimuladas de las células del músculo liso. Oda et al informaron que la leptina estimulaba la fosforilación y activación de la actividad de MAP quinasa y fosfatidilinositol 3-quinasa en células de músculo liso cultivadas, una consecuencia de las cuales era una mayor proliferación y migración de células de músculo liso. 56 En conjunto, estas consideraciones subrayan la complejidad de estos sistemas modelo y sugieren que las pruebas preclínicas de nuevas dianas terapéuticas en la reestenosis requieren en última instancia el uso de especies como cerdos, conejos o primates no humanos antes de probarlas en sujetos humanos. 57,58

Conclusiones

El objetivo final de nuestros estudios es determinar el papel potencial del bloqueo de RAGE como estrategia terapéutica en las complicaciones macrovasculares de la diabetes. Por lo tanto, el desarrollo de modelos clave para probar el papel del receptor de una manera específica en el tiempo y en la célula ha proporcionado una plantilla para la disección en profundidad del papel de RAGE en la patología vascular. El hallazgo de que el bloqueo de RAGE proporciona beneficios en ratones que padecen diabetes tanto deficiente como resistente a la insulina respalda aún más el papel de este receptor en los estados hiperglucémicos. Estas consideraciones subrayan el concepto de que los productos de los efectos posteriores de la glucosa alta y el estrés oxidativo generan especies que son ligandos de transducción de señales del receptor.

Es importante enfatizar que los mecanismos dependientes de RAGE en la estimulación vascular no se limitan a la diabetes. Como la vasculatura en las placas ateroscleróticas euglucémicas también es susceptible al estrés oxidativo, la inflamación y, por lo tanto, la generación de AGE, aunque en menor grado, era lógico probar el impacto del bloqueo de RAGE.Por lo tanto, no fue sorprendente que la administración de sRAGE a ratones euglucémicos apo E - / - de 14 a 20 semanas de edad atenuó el área y la complejidad de la lesión aterosclerótica, sin un impacto en los niveles de lípidos. 34

En conclusión, estos hallazgos subrayan la utilidad de los modelos de roedores, y en particular de ratones, en la disección de los mecanismos que vinculan el RAGE con la aterosclerosis acelerada y la reestenosis, particularmente en la diabetes. Impulsados ​​por datos convincentes en modelos animales, proponemos que la prueba del bloqueo de RAGE en un enfoque de múltiples objetivos en la diabetes puede conducir a una reducción exitosa de las complicaciones macrovasculares de la diabetes tipo 1 y 2. Los ensayos clínicos para abordar estos problemas en seres humanos están en el horizonte.


REGULACIÓN DE RAGE POR MODULACIÓN DE PREMONTAJE

Como se describió anteriormente, se requiere el premontaje de RAGE para la activación y la señalización aguas abajo. La formación de multímeros se ve favorecida por las altas concentraciones superficiales de RAGE en la superficie celular. Los datos disponibles ayudaron a desarrollar un modelo para el inicio de la cascada de señales mediante la interacción RAGE / ligando. Sin embargo, solo hay datos raros sobre el mecanismo que detiene la señal. Existe evidencia de que varios mecanismos controlan la concentración de superficie de RAGE competente en señal, y algunos mecanismos potenciales se describen a continuación.

La internalización del receptor después de la activación es un mecanismo bien conocido para detener la señalización de un complejo receptor / ligando activo. La internalización de las proteínas S100, que se unen a RAGE en estructuras granulares, ya ha sido observada por Hsieh et al. [156]. La inmunofluorescencia y la tinción histoquímica de diferentes tipos de células revelaron RAGE en la membrana citoplasmática e intracelularmente, en estructuras vesiculares o granulares [56, 157–162]. Más tarde, se demostró que el complejo RAGE / S100B se internaliza a través de balsas de lípidos [163, 164]. Asimismo, el complejo RAGE / AGE se internalizó y se monitorizó en estructuras vesiculares [165] (Fig. 3, inferior).

Por otro lado, la concentración superficial de un receptor puede aumentarse inmediatamente mediante la fusión de vesículas que contienen el receptor con la membrana citoplasmática. La endocitosis y el reciclaje de receptores se describen para una gran cantidad de receptores y son un proceso estrictamente regulado. La desregulación del tráfico de receptores puede provocar trastornos graves, incluido el cáncer [166-168]. La evidencia de la exposición de RAGE mediada por vesículas en la superficie endotelial proviene de estudios de Frommhold et al. [63, 64]. Los autores observaron que ante un estímulo proinflamatorio, RAGE se presenta a los pocos minutos en el endotelio, actuando como un contrarreceptor para los leucocitos que desencadenan la adhesión y la transmigración. La aparición casi inmediata de RAGE en la superficie indica que no se ha producido una síntesis de novo de RAGE, sino que RAGE se movilizó desde las reservas internas. Tal transporte de RAGE a la superficie está de acuerdo con la observación de estructuras vesiculares intracelulares que albergan RAGE. Dichas vesículas podrían dirigirse a la membrana citoplasmática y fusionarse allí, lo que da como resultado un rápido aumento de la concentración superficial de RAGE.

Otra opción para modular la señalización de RAGE es la producción y secreción de especies de RAGE solubles (esRAGE, sRAGE) mediante corte y empalme alternativo o desprendimiento de receptores. Al igual que el receptor de longitud completa, el RAGE soluble puede unirse a ligandos de RAGE y bloquear la señalización de RAGE de forma eficaz. En la mayoría de los estudios, se asume que el RAGE soluble actúa como un receptor señuelo, compitiendo con el RAGE completo por los ligandos. Los niveles de especies de RAGE soluble deben controlarse estrictamente, ya que los cambios en el nivel de RAGE soluble están asociados con diabetes, trastornos cardiovasculares y ciertos tipos de cáncer [148, 169, 170].

Sin embargo, los niveles de RAGE soluble siguen siendo bastante bajos en comparación con RAGE de longitud completa [145], lo que plantea la cuestión de cómo las bajas cantidades de RAGE soluble extracelular podrían competir eficazmente con RAGE de longitud completa. Proponemos que el RAGE soluble no actúa como un competidor simple, sino que atenúa la activación del RAGE de longitud completa al alterar el premontaje del receptor en la superficie celular. Se ha demostrado que las interacciones RAGE-RAGE ocurren a través del dominio V y C1, lo que permite que sRAGE interactúe con RAGE de longitud completa unido a la membrana. Los heteromultímeros resultantes no serían competentes en señalización, ya que sRAGE carece del dominio citoplásmico. Este modelo está corroborado por estudios que utilizan un mutante de deleción de RAGE que contiene la hélice transmembrana pero carece del dominio citoplásmico. Se ha demostrado que esta variante de RAGE ejerce un efecto negativo dominante sobre la señalización de RAGE. La coexpresión de este mutante de deleción citoplásmica con RAGE de longitud completa podría anular la señalización de RAGE, aunque están presentes moléculas receptoras intactas. Este fenotipo dominante negativo se explica fácilmente por la formación de heterodímeros no funcionales entre la forma truncada y completa de RAGE. Es razonable suponer que el RAGE soluble, desprovisto de membrana y dominio citoplásmico, forma heteromultímeros incompetentes de señalización similares con RAGE de longitud completa (Fig. 3, inferior).

Otras dos variantes de corte y empalme alternativas expresadas a niveles observables muestran deleciones o inserciones en el dominio de unión al ligando extracelular y, por lo tanto, no son capaces de unirse a ligandos RAGE [148]. Dado que las interacciones RAGE homofílicas están mediadas así como a través del dominio C1, es muy probable que estas variantes aún puedan formar heterodímeros con RAGE de longitud completa. En consecuencia, estos multímeros del receptor pueden no activarse, ya que los ligandos se unen solo a una fracción de las moléculas unidas a la membrana y no logran estabilizar un complejo competente en señal.


Discusión

Se obtuvieron tres hallazgos importantes en el presente estudio. Primero, RAGE, S100A8 y S100A9 se sobreexpresaron en IPAH y HPAH-PASMC en ausencia de cualquier estímulo de crecimiento externo. En segundo lugar, PDGF-BB aumentó la expresión de RAGE en IPAH y HPAH-PASMC. En tercer lugar, AS-1, un inhibidor de la señalización de RAGE, inhibió significativamente el sobrecrecimiento en condiciones de ausencia de estimulación del crecimiento y proliferación de IPAH y HPAH-PASMC estimulada por PDGF. RAGE juega un papel importante en el aumento inadecuado de PAH-PASMC, y su inhibición puede ser una nueva estrategia terapéutica para la PAH.

Varios investigadores han informado de que los niveles de expresión de RAGE aumentaron en suero o plasma, arterias pulmonares pequeñas y PASMC de pacientes con HAP [9, 19, 20]. Aquí, mostramos que RAGE se sobreexpresa en PASMC no solo de pacientes con HAPI sino también de pacientes con HAPH, incluidos pacientes con BMPR2 mutación y SMAD9 mutación. Por lo tanto, RAGE es un factor de exacerbación común en la HAP. En cuanto a los ligandos para RAGE, Greenway et al. comunicaron que S100A4 / Mts1 se expresaba en células de músculo liso de lesiones que mostraban formación de neoíntima y con mayor intensidad en vasos con neoíntima oclusiva y lesiones plexiformes de pacientes con hipertensión pulmonar secundaria a cardiopatía congénita [21]. Meloche y col. informó de que la activación de RAGE por S100A4 disminuyó la expresión de BMPR2 en PASMC humanas [9]. Demostramos que S100A8 y A9 también estaban sobreexpresados ​​en IPAH y HPAH-PASMC. Anteriormente informamos que S100A8 / A9 indujo la fosforilación de RAGE y condujo a la activación de diversos efectores de señal como Rac1, Akt, p38, JNK, IKK y NFkB en células HEK293 y 293-hMD2-CD14 [6]. Se necesitan más estudios para aclarar el papel preciso de S100A8 y A9 en la patogenia de la HAP.

Anteriormente informamos que la estimulación de PDGF-BB provocó una mayor tasa de crecimiento de PASMC cultivadas de pacientes con IPAH que la de las células de control [3, 10]. Aquí mostramos que PDGF-BB también regulaba positivamente la expresión de RAGE en IPAH y HPAH-PASMC.

Recientemente hemos informado de que la proteína adaptadora que contiene el dominio del receptor Toll / IL-1 (TIR) ​​(TIRAP) transduce la señalización de RAGE y que la interacción funcional entre RAGE y TLR regula coordinadamente la inflamación, la respuesta inmune y otras funciones celulares [6]. Un mimético TIR / BB-Loop sintético de bajo peso molecular, AS-1, inhibe la señalización mediada por el dominio TIR [22]. AS-1 finalmente inhibe la señalización de RAGE. AS-1, un inhibidor de la señalización de RAGE, inhibió significativamente el crecimiento excesivo en condiciones de ausencia de estimulación del crecimiento y proliferación de IPAH y HPAH-PASMC estimulada por PDGF.

Este estudio se realizó en una pequeña población de pacientes. Por lo tanto, no pudimos realizar un análisis cuantitativo de la tinción. Ésta es una limitación del estudio. Se necesitan más estudios.

En conclusión, RAGE juega un papel crucial en el aumento inadecuado de PAH-PASMC. La inhibición de la señalización de RAGE puede ser una nueva estrategia terapéutica para la HAP.


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