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20: Análisis de laboratorio de la respuesta inmune - Biología

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Miniatura: Se usaron anticuerpos ligados a enzimas contra CD8 para teñir las células CD8 en esta preparación de médula ósea usando un cromógeno. (crédito: modificación del trabajo de Yamashita M, Fujii Y, Ozaki K, Urano Y, Iwasa M, Nakamura S, Fujii S, Abe M, Sato Y, Yoshino T).


Modelos de pez cebra de la respuesta inmune: asumiendo el mentón

El pez cebra está demostrando ser un nuevo modelo experimental extremadamente versátil para desentrañar los misterios de la inmunidad innata y tiene una promesa considerable como sistema para la identificación de moduladores novedosos de este proceso biológico crucial. Sin embargo, un factor limitante de la velocidad es el estímulo mecánico necesario para inducir la respuesta inflamatoria. Un nuevo ensayo de inflamación inducida químicamente (ensayo 'ChIn') publicado en Biología BMC obvia este requisito y parece destinado a acelerar el progreso en el campo.


Artículo MÉTODOS

Rym Ben-Othman 1,2, Bing Cai 1, Aaron C. Liu 1, Natallia Varankovich 1, Daniel He 1, Travis M. Blimkie 3, Amy H. Lee 4, Erin E. Gill 3, Mark Novotny 5, Brian Aevermann 5, Sibyl Drissler 6, Casey P. Shannon 7, Sarah McCann 1, Kim Marty 1, Gordean Bjornson 1, Rachel D. Edgar 8, David Tse Shen Lin 8, Nicole alegre 8, Julia Maclsaac 8, Nelly Amenyogbe 2, Queenie Chan 9, Alba Llibre 10, Joyce Collin 11, Elise Landais 11,12, Khoa Le 11,12, Samantha M. Reiss 13, Wayne C. Koff 14, Colin Havenar-Daughton 13, Manraj Heran 15, Bippan Sangha 15, David Walt 16, Mel Krajden 17, Shane Crotty 13, Devin Sok 11,12, Bryan Briney 11, Dennis R. Burton 11, Darragh Duffy 10, Leonard J. Foster 9, William W. Mohn 18, Michael S. Kobor 8, Scott J. Tebbutt 7,19, Ryan R. Brinkman 6,20, Richard H. Scheuermann 5,13, Robert E. W. Hancock 3, Tobias R. Kollmann 1,2 y Manish Sadarangani 1 *
  • 1 Centro de evaluación de vacunas, BC Children & # x2019s Hospital Research Institute, Vancouver, BC, Canadá
  • 2 Telethon Kids Institute, Universidad de Australia Occidental, Nedlands, WA, Australia
  • 3 Centro de Investigación de Enfermedades Microbianas e Inmunidad, Universidad de Columbia Británica, Vancouver, BC, Canadá
  • 4 Universidad Simon Fraser, Burnaby, BC, Canadá
  • 5 Departamento de Informática, Instituto J. Craig Venter (La Jolla), La Jolla, CA, Estados Unidos
  • 6 Terry Fox Laboratory, Vancouver, BC, Canadá
  • 7 Centro de excelencia para la prevención de la insuficiencia de órganos (PROOF) y Centro para la innovación del corazón y el pulmón, St. Paul's Hospital, Vancouver, BC, Canadá
  • 8 Centro de Medicina y Terapéutica Molecular, Departamento de Genética Médica, Universidad de Columbia Británica, Vancouver, BC, Canadá
  • 9 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Medicina, Universidad de Columbia Británica, Vancouver, BC, Canadá
  • 10 Laboratorio de Inmunología Traslacional, Institut Pasteur, París, Francia
  • 11 Departamento de Inmunología y Microbiología, The Scripps Research Institute, La Jolla, CA, Estados Unidos
  • 12 Centro de anticuerpos neutralizantes de IAVI, The Scripps Research Institute, La Jolla, CA, Estados Unidos
  • 13 Centro de Investigación de Vacunas y Enfermedades Infecciosas, Instituto de Inmunología de La Jolla (LJI), La Jolla, CA, Estados Unidos
  • 14 Human Vaccines Project, Nueva York, NY, Estados Unidos
  • 15 Departamento de Radiología, BC Children & # x2019s Hospital, Vancouver, BC, Canadá
  • 16 Instituto Wyss de la Universidad de Harvard, Departamento de Patología, Hospital Brigham and Women & # x2019s, Facultad de Medicina de Harvard, Boston, MA, Estados Unidos
  • 17 Centro para el Control de Enfermedades de la Columbia Británica, Vancouver, BC, Canadá
  • 18 Departamento de Microbiología e Inmunología, Instituto de Ciencias de la Vida, Universidad de Columbia Británica, Vancouver, BC, Canadá
  • 19 Departamento de Medicina, División de Medicina Respiratoria, Universidad de Columbia Británica, Vancouver, BC, Canadá
  • 20 Departamento de Genética Médica, Universidad de Columbia Británica, Vancouver, BC, Canadá

El diseño de vacunas convencionales se ha basado en enfoques de prueba y error, que en general han tenido éxito. Sin embargo, ha habido algunos fracasos importantes en el desarrollo de vacunas y todavía no tenemos vacunas autorizadas altamente efectivas para la tuberculosis, el VIH, el virus sincitial respiratorio y otras infecciones importantes de importancia mundial. Los enfoques en el diseño racional de vacunas se han visto limitados por nuestro conocimiento de la respuesta inmune a la vacunación a nivel molecular. Ahora existen herramientas para realizar análisis en profundidad utilizando enfoques de biología de sistemas, pero para que se realicen por completo, se requieren estudios en humanos con muestreo intensivo de sangre y tejidos. Los métodos que respaldan este muestreo intensivo deben desarrollarse y validarse según sea factible. Con este fin, describimos aquí un enfoque detallado que se aplicó en un estudio de 15 adultos sanos, que fueron inmunizados con la vacuna contra la hepatitis B. Muestreo incluido

350 ml de sangre, 12 muestras de microbioma y aspirados con aguja fina de ganglios linfáticos obtenidos durante un

Período de 7 meses, que permite un análisis completo de la respuesta inmune a nivel molecular, incluido el análisis de muestras de tejido y de células individuales. Se recolectaron muestras para el análisis de fenotipado inmunológico, sangre total y expresión de genes unicelulares, proteómica, lipidómica, epigenética, respuesta de sangre total a estímulos inmunes clave, respuestas de citocinas, in vitro Respuestas de linfocitos T, análisis del repertorio de anticuerpos y microbioma. La integración de datos se llevó a cabo utilizando diferentes enfoques & # x2014NetworkAnalyst y DIABLO. Nuestros resultados demuestran que estos estudios de muestreo intensivos son factibles en adultos sanos, y existen herramientas de integración de datos para analizar la gran cantidad de datos generados a partir de un enfoque de biología de sistemas multi-ómicos. Esto proporcionará la base para una mejor comprensión de la inmunidad inducida por vacunas y acelerará el futuro diseño racional de vacunas.


Introducción al análisis de laboratorio de la respuesta inmune

Muchas pruebas de laboratorio están diseñadas para confirmar un diagnóstico presuntivo mediante la detección de anticuerpos específicos contra un patógeno sospechoso. Desafortunadamente, muchas de estas pruebas requieren mucho tiempo y son caras. Sin embargo, eso está cambiando ahora con el desarrollo de nuevas tecnologías miniaturizadas que son rápidas y económicas. Por ejemplo, los investigadores de la Universidad de Columbia están desarrollando una tecnología & # 8220lab-on-a-chip & # 8221 que analizará una sola gota de sangre para detectar 15 enfermedades infecciosas diferentes, incluido el VIH y la sífilis, en cuestión de minutos. [1] La sangre se extrae a través de pequeños capilares hacia las cámaras de reacción donde los anticuerpos del paciente se mezclan con los reactivos. Un lector de chips que se conecta a un teléfono celular analiza los resultados y los envía al proveedor de atención médica del paciente. Actualmente, el dispositivo se está probando sobre el terreno en Ruanda para detectar enfermedades crónicas en mujeres embarazadas. Los investigadores estiman que los lectores de chips se venderán por alrededor de $ 100 y los chips individuales por $ 1. [2]

Figura 1. La tecnología Lab-on-a-chip permite miniaturizar los ensayos inmunológicos para que las pruebas se puedan realizar rápidamente con cantidades mínimas de reactivos costosos. Los chips contienen pequeños tubos de flujo para permitir el movimiento de fluidos por acción capilar, sitios de reacción con reactivos incrustados y salida de datos a través de sensores electrónicos. (crédito: modificación del trabajo de Maggie Bartlett, NHGRI)

  1. Chin, Curtis D. et al., "Dispositivo móvil para el diagnóstico de enfermedades y el seguimiento de datos en entornos con recursos limitados", Química Clínica 59, no. 4 (2013): 629-40. & crarr
  2. Evarts, H., "Fast, Low-Cost Device Uses the Cloud to Speed ​​Up Testing for HIV and More", 24 de enero de 2013. Consultado el 14 de julio de 2016. http://engineering.columbia.edu/fast-low- costo-dispositivo-usos-nube-velocidad-diagnóstico-pruebas-vih-y-más. & crarr

Resultados

Secuenciación de ARN unicelular de organoides de colon e íleon infectados con SARS-CoV-2

Una fracción de los pacientes con COVID-19 muestran síntomas entéricos y se ha demostrado que el SARS-CoV-2 se replica en el tracto intestinal de los pacientes (Xiao et al, 2020) y en células epiteliales intestinales primarias humanas (Lamers et al, 2020 Zhou et al, 2020a Zang et al, 2020 Stanifer et al, 2020b). Para caracterizar las interacciones del SARS-CoV-2 con las células epiteliales intestinales humanas primarias (hIEC), se infectaron organoides intestinales humanos con el SARS-CoV-2. Para determinar si los organoides derivados de distintas partes del tracto intestinal muestran una susceptibilidad diferente, los organoides derivados del colon y del íleon se sembraron en dos dimensiones (2D, planos como monocapas en placas de cultivo) para acceder al lado apical de las células tal como estaba anteriormente se demostró que la infección por SARS-CoV-2 se produce principalmente a través del lado apical debido a la distribución polarizada de ACE2 (Zang et al, 2020). Para controlar que nuestros organoides sembrados en 2D se diferenciaran adecuadamente, seguimos la expresión de varias células madre y marcadores celulares diferenciados a lo largo del tiempo después de la eliminación de WNT y la disminución de las concentraciones de R-Spondin y Noggin (Fig EV1A). Descubrimos que los organoides podían diferenciarse adecuadamente en 2D, caracterizados por la pérdida del marcador de células madre y el aumento de la expresión de varios marcadores de células diferenciadas, lo cual es consistente con trabajos previos (Ettayebi et al, 2016 Kolawole et al, 2019 Ding et al, 2020 Stanifer et al, 2020b, 2020c Zang et al, 2020). Los organoides 2D diferenciados fueron infectados por SARS-CoV-2, y su respuesta se controló a lo largo del curso de la infección. A través de la visualización directa de organoides infectados, observamos que a partir de las 36 h después de la infección (hpi) las células comenzaban a morir y que a las 48 hpi la mayoría de las células estaban muertas (Fig. EV1B). Como consecuencia, limitamos nuestro análisis de infección a 24 h. Es de destacar que observamos que solo una pequeña fracción de las células estaban infectadas con SARS-CoV-2 incluso cuando se usaba una mayor cantidad de virus para la infección, lo que sugiere que solo una población discreta de organoides es permisiva para la infección. Para los organoides derivados del colon y del íleon, pudimos observar la presencia de células infectadas tan pronto como 4 h después de la infección (hpi) con el número de células infectadas aumentando durante el curso de la infección (Fig. EV1C y D). Esto se corroboró con un aumento del ARN viral intracelular y la liberación de de novo partículas de virus infecciosos a lo largo del tiempo (Fig. EV1E y F), lo que demuestra la replicación eficaz del virus y la propagación de la infección en organoides de colon e íleon. Para caracterizar cómo responden las hIEC a la infección por SARS-CoV-2, monitoreamos la producción de IFN tipo I (IFNβ1) y los IFN de tipo III (IFNλ1 y IFNλ2-3) tiempo extraordinario. El SARS-CoV-2 no indujo una producción significativa de IFNβ1 en los organoides del íleon o del colon, excepto por una ligera regulación al alza de IFNβ1 expresión en organoides de colon a las 24 hpi (Fig. EV1G). Por el contrario, para IFNλ2-3, se observó una fuerte regulación al alza en los organoides de colon e íleon tras la infección por SARS-CoV-2 (Fig. EV1I). Curiosamente, similar a IFNβ1, IFNλ1 no se reguló positivamente en respuesta a la infección (Fig. EV1H). Tomados en conjunto, estos resultados muestran que una fracción (alrededor del 7-10% 24 hpi, Fig EV1D) de las células epiteliales intestinales humanas apoya la infección, la replicación y la replicación del SARS-CoV-2. de novo producción de partículas de virus infecciosos y que la infección está asociada con la regulación positiva de los IFN de tipo III (IFNλ2-3).

Figura EV1. Los organoides derivados del íleon y el colon apoyan la replicación y la propagación del SARS-CoV-2 Los organoides derivados del íleon y el colon se sembraron en 2D

  • A. Se añadió a las células medio de diferenciación 48 h después de la siembra y se controló el cambio en la diferenciación en los puntos de tiempo indicados utilizando q-RT-PCR para marcadores de células madre, células de Paneth, células caliciformes y enterocitos. (norte = 3 réplicas biológicas).
  • B. Se infectaron cultivos de organoides sembrados en 2D con SARS-CoV-2 y se controló la cantidad de células a lo largo del tiempo mediante microscopía. (norte = 3).
  • C – I. Se infectaron cultivos de organoides sembrados en 2D con SARS-CoV-2 y se ensayó la infección. (C) A las 4, 8, 12, 16 y 24 hpi, las muestras se fijaron y analizaron por inmunofluorescencia para la proteína SARS-CoV-2 N (rojo) y dsRNA (verde) y los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). norte = Se realizaron 3 réplicas biológicas del mismo donante, se muestran imágenes representativas. Barra de escala = 100 um. (D) Cuantificación de C. norte = 3 réplicas biológicas. (E) En los momentos indicados, se extrajo ARN y se controló la cantidad de replicación del virus mediante q-RT-PCR. norte = Se realizaron 3 réplicas biológicas del mismo donante. (F). En los puntos de tiempo indicados, se recogieron los sobrenadantes y se titularon las cantidades de virus infecciosos de novo producidos en células Vero vírgenes. norte = Se realizaron 4 réplicas biológicas. (SOLDADO AMERICANO). En los puntos de tiempo indicados, se extrajo ARN y se analizó la regulación al alza de IFNβ1, INFλ1 e IFNλ2 / 3 mediante q-RT-PCR. norte = Se realizaron 3 réplicas biológicas del mismo donante.

Información de datos: (A-F) La barra de error indica la desviación estándar. PAG fue determinado por no emparejado t-prueba.

Determinación del tropismo de células epiteliales intestinales del SARS-CoV-2

Los organoides intestinales humanos están compuestos por múltiples tipos de células que recapitulan parcialmente la complejidad celular del epitelio intestinal humano. Aunque está claro que el SARS-CoV-2 infecta el epitelio intestinal humano, qué tipos de células específicas están infectadas por el virus, cómo la infección afecta el panorama transcripcional de cada tipo de célula individual y cómo responden las células transeúntes a la infección viral sigue siendo desconocido. Para caracterizar las interacciones del SARS-CoV-2 con las hIEC a nivel transcripcional de una sola célula, se infectaron organoides derivados del colon y del íleon con el SARS-CoV-2 como se describe anteriormente y se sometieron a secuenciación de ARN unicelular (scRNAseq) (Fig 1A ). Se generaron suspensiones unicelulares y se realizó scRNAseq 3 'en seis condiciones biológicas (simulacro, 12 hpi y 24 hpi para organoides de colon e íleon). scRNAseq proporcionó perfiles transcripcionales amplios para alrededor de 2000 células por condición con 5,000 y 6,000 genes perfilados en promedio por célula para el colon y el íleon, respectivamente (Apéndice Fig. S1A-H para organoides de colon y Apéndice Fig. S1I-P para organoides de íleon).

Figura 1. Secuenciación unicelular de organoides humanos derivados del colon e íleon infectados con SARS-CoV-2

  1. Representación esquemática del flujo de trabajo experimental.
  2. Aproximación y proyección de múltiples uniformes (UMAP) incrustación de datos de RNA-Seq de una sola célula de organoides derivados de colon (paneles izquierdos) y derivados del íleon (paneles derechos) infectados con SARS-CoV-2 simulados y coloreados según el tipo de célula. Pequeños recuadros resaltan en el UMAP la célula de los organoides simulados e infectados a las 12 y 24 hpi (rojo) y el resto de las células (gris).
  3. Gráfico de puntos de los genes marcadores superiores para cada tipo de célula para organoides derivados del colon (izquierdo) y del íleon (derecho). El tamaño del punto representa el porcentaje de células que expresan el gen; el color representa la expresión relativa promedio en todo el tipo de célula.
  4. Gráfico de barras que muestra la proporción de cada tipo de célula en organoides simulados e infectados (12 y 24 hpi).

Para identificar los tipos de células presentes en nuestros organoides, usamos agrupamiento no supervisado y algoritmo de Aproximación y Proyección Uniforme de Colector (UMAP) para la visualización de nuestros datos scRNAseq (Fig. EV2A y F). El agrupamiento reveló la presencia de múltiples subpoblaciones celulares. Utilizando genes marcadores específicos de tipo celular expresados ​​diferencialmente (Figs.1C y EV2B y G) y marcadores de atlas unicelulares de tejidos intestinales humanos (Smillie et al, 2019) y de nuestros datos scRNAseq anotados de biopsias de íleon humano (preimpresión: Triana et al, 2020), pudimos identificar los principales tipos de células representados en estas poblaciones (Fig.1B). Identificamos ocho y nueve poblaciones principales de células en los organoides de colon e íleon, respectivamente (Fig. 1B). Se encontró que las células madre, las células amplificadoras transitorias (TA), los enterocitos, las células caliciformes y las enteroendocrinas estaban presentes en los organoides intestinales (Fig. 1B). Es importante destacar que, si bien la proporción de cada tipo de célula en nuestros organoides fue similar a la observada en otro informe (Fujii et al, 2018), encontramos que esta proporción no era completamente idéntica a la observada en los tejidos primarios (biopsias), lo que destaca la limitación de los organoides, aunque son el mejor modelo primario actual para imitar el intestino humano. Diferentes subpoblaciones de enterocitos en íleon y colon (CLCA4 +, ALDOB +, MUC13 +), se identificaron, a saber, enterocitos 1 (GUCA2A +, FABP6 +, CA4 +), enterocitos 2 (MMP7 +, MUC1 +, CXCL1 +) así como enterocitos 1 inmaduros y enterocitos 2 inmaduros, estos últimos probablemente representan células no completamente diferenciadas en enterocitos maduros. La presencia de dos poblaciones distintas de enterocitos y sus formas inmaduras relacionadas concuerda con informes anteriores (Smillie et al, 2019). Es importante destacar que la infección por SARS-CoV-2 no alteró el agrupamiento de células (Fig. 1B, paneles de inserción de UMAP a la izquierda). Para abordar la posible diferencia entre los tipos de células organoides simuladas e infectadas, calculamos la correlación de los perfiles transcripcionales promedio de clase entre los tipos de células de ambas condiciones (Fig. EV2D e I). Esto reveló una alta correlación general dentro de cada tipo de célula (r & gt 0,99). Además, la infección por SARS-CoV-2 no tuvo ningún impacto en las proporciones de los diferentes tipos de células presentes en los organoides del colon y del íleon (Fig. 1D), lo que nos permitió investigar el tropismo celular.

Figura EV2. Agrupación y anotación de organoides de colon e íleon

  • A. Incrustación de aproximación y proyección de colector uniforme (UMAP) de datos de RNA-Seq de una sola célula de organoides de íleon humano coloreados por los grupos no supervisados.
  • B. Mapa de calor de la expresión relativa de los tres genes marcadores principales de cada grupo.
  • C. UMAP coloreado por tipo de celda.
  • D. Mapa de calor que muestra las correlaciones de Pearson entre la expresión promedio de cada gen en los tipos de células entre muestras infectadas y simuladas.
  • E. Mapeo entre tipos de células de organoides y etiqueta de transferencia de tipos de células de tejido.
  • F – J. Igual que (A ‒ J) pero para organoides de íleon.

Para aumentar la sensibilidad y el rango dinámico en la detección del genoma del SARS-CoV-2 y genes seleccionados del huésped, utilizamos scRNAseq adicional dirigido (Schraivogel et al, 2020) realizado en las mismas muestras de organoides. La scRNAseq dirigida es más sensible para detectar genes de interés independientemente de su nivel de expresión y cuantifica la expresión génica con un rango dinámico más alto en comparación con la scRNAseq 3 'convencional (Schraivogel et al, 2020). Seleccionamos 12 genes, incluido el genoma del SARS-CoV-2, el receptor del SARS-CoV-2 ACE2, un gen estimulado por interferón (ISG15), y un panel de marcadores tipo hIEC que determinamos previamente mediante scRNAseq de biopsias de íleon y organoides (APOA4, CHGB, FABP6, FCGBP, LYZ, MKI67, OLFM4, SLC2A2, SMOC2 y SST) (preimpresión: Triana et al, 2020). Al observar la expresión relativa del genoma del SARS-CoV-2 en células simuladas frente a las infectadas (Fig. EV3A y B), la scRNAseq 3 ’clásica detectó el genoma viral en una proporción de células organoides (Fig. EV3A (panel izquierdo)

75% a 24 hpi), mientras se usaba el enfoque dirigido, se detectaron recuentos de SARS-CoV-2 en prácticamente todas las células de las muestras infectadas (Fig. EV3B). Al mismo tiempo, observamos que el número de recuentos de SARS-CoV-2 por célula aumentó durante el transcurso de la infección en la scRNAseq del transcriptoma completo y dirigido (Fig. EV3A y B, paneles de la derecha), de acuerdo con la replicación activa del virus en organoides monitoreados usando q-RT-PCR (Fig. EV1E). Dado que la tinción por inmunofluorescencia se realizó en paralelo a las muestras de scRNAseq y reveló que menos del 10% de las células estaban infectadas (Fig. EV1C y D) (Lamers et al, 2020 Stanifer et al, 2020b), la presencia del genoma del SARS-CoV-2 en todas las células probablemente no refleja la replicación viral activa, pero podría explicarse por la presencia de virus adheridos a la superficie de la célula o por partículas virales o ARN que flotan libremente. Esto también se confirma por la presencia de transcripciones virales en las gotitas vacías (Fig. EV3C y D). Aprovechando el alto rango dinámico proporcionado por la scRNAseq dirigida, definimos las células que tienen infección y replicación productivas como aquellas con recuentos de SARS-CoV-2 más altos que la línea de base, calculada como la expresión media de SARS-CoV-2 medida por scRNAseq dirigida en todas las gotas que contienen células (Fig. EV3C y D, paneles superiores). Las células con niveles de expresión de scRNAseq SARS-CoV-2 dirigidos por debajo del nivel de referencia estimado se definieron como células transeúntes no infectadas. Siguiendo este enfoque, podríamos corregir la presencia de ARN viral contaminante. Solo una pequeña fracción de células (Colon: 4.5% e Íleon: 5.3% a 24 hpi) se definió como compatible con la infección por SARS-CoV-2 (Fig. EV3C y D), lo cual es consistente con nuestra tinción de inmunofluorescencia de SARS-CoV-2- organoides infectados (Fig. EV1C y D) y otros informes (Lamers et al, 2020 Stanifer et al, 2020b). Además, evaluamos SoupX (Young & Behjati, 2020) como un método alternativo a las cantidades umbral del genoma del SARS-CoV-2 y poder determinar las células infectadas frente a las transeúntes. Sin embargo, al utilizar este enfoque, encontramos que las células pequeñas se enriquecieron en exceso para los recuentos virales, ya que SoupX utiliza el recuento total de transcripciones por célula para la eliminación de su fracción de contaminación predicha (Apéndice, Fig. S2). Por lo tanto, optamos por nuestra scRNAseq dirigida y enfoques de umbral basados ​​en la expresión media de SARS-CoV-2, ya que esto no sesga nuestros recuentos genómicos basados ​​en el tamaño de la célula y, lo más importante, se correlaciona con nuestra cuantificación del número de células infectadas mediante inmunofluorescencia.

Figura EV3. Identificación de células infectadas con SARS-CoV-2 utilizando conjuntos de datos de scRNAseq dirigidos

  • A, B. Proporción de células infectadas con SARS-CoV-2 para cada muestra y parcelas de violín que muestran expresión de SARS-CoV-2 para la scRNAseq 3 'de 10x genómica y para la scRNAseq dirigida para simulacros de infección y SARS-CoV-2- organoide de colon e íleon infectado a las 12 y 24 hpi.
  • C. (Paneles superiores) Expresión de SARS-CoV-2 como función del número de genes por gota de los conjuntos de datos de scRNAseq dirigidos de organoides de colon a las 12 y 24 hpi. Los tipos de gotas se colorean para las gotas que contienen células y las gotas vacías. La línea vertical representa el umbral para las gotas que contienen & lt 2.000 genes por célula. La línea horizontal representa el umbral utilizado para definir la línea de base de la infección a las 12 y 24 hpi. (Paneles inferiores) Incrustación de aproximación y proyección múltiple uniforme (UMAP) de los datos scRNAseq de organoides de colon infectados que representan células infectadas con SARS-CoV-2. (Izquierda) Expresión relativa de SARS-CoV-2 en conjuntos de datos no corregidos. (Derecha) Expresión relativa de SARS-CoV-2 en conjuntos de datos corregidos utilizando los umbrales determinados en los gráficos de puntos del panel superior.
  • D. Igual que (C) pero para los organoides de íleon.
  • E, F. (paneles superiores) Correlación de la expresión de cada gen en 10x genómica 3 ’scRNAseq contra su expresión en scRNAseq dirigida a través de condiciones. (Paneles inferiores) Expresión de SARS-CoV-2 en cada célula infectada en 10x genómica 3 ’scRNAseq contra scRNAseq dirigida. Colon (E) e íleon (F).

Comparando la scRNAseq dirigida y los enfoques convencionales de la scRNAseq 3 ', observamos una alta correlación entre los niveles de expresión estimados por estas tecnologías (paneles superiores Fig EV3E y F), con la scRNAseq dirigida que proporciona varios órdenes de magnitud de rango dinámico más alto, en comparación con el 3 convencional 'scRNAseq (paneles inferiores Fig EV3E y F). La alta correlación positiva entre los dos enfoques de secuenciación (excepto para SLCA2) sirve como un control de calidad que confirma que la scRNAseq dirigida podría cuantificar de manera robusta tanto genes virales como celulares.

Si bien el SARS-CoV-2 se pudo detectar en la mayoría de los tipos de células en organoides de colon e íleon (figura 2A), los enterocitos 2 inmaduros representaron consistentemente el principal tipo de célula dirigida al virus (figura 2B). La proporción de enterocitos inmaduros infectados 2 y el número de copias del genoma del SARS-CoV-2 por célula aumentaron durante el curso de la infección (Figura 2B), lo que es consistente tanto con el número creciente de células infectadas observado por inmunofluorescencia como con el aumento de copias del SARS. -Genoma de CoV-2 a lo largo del tiempo (Figs EV1C-E, EV3A y B). En los organoides derivados del íleon, también se encontró que las células TA en el linaje secretor estaban altamente infectadas por el SARS-CoV-2 (Fig 2B, panel derecho). Curiosamente, estas células se infectaron principalmente a las 24 hpi, lo que sugiere que son objetivos secundarios de la infección. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que los enterocitos 2 inmaduros son el objetivo principal de la infección por SARS-CoV-2 en hIEC tanto en el colon como en el íleon.

Figura 2. Tropismo celular del SARS-CoV-2 en organoides humanos derivados del colon y del íleon

  1. Visualización UMAP de los datos de scRNAseq de organoides derivados del íleon y del colon infectados con SARS-CoV-2 (izquierda) (derecha). Los triángulos representan las células infectadas y los colores representan la expresión normalizada dirigida corregida de SARS-CoV-2 determinada usando los datos de scRNAseq dirigido.
  2. Proporción de células infectadas con SARS-CoV-2 para cada tipo de célula y diagrama de caja correspondiente de los valores de expresión normalizados de SARS-CoV-2 para cada célula infectada en cada tipo de célula individual en muestras de organoides infectadas de colon (izquierda) e íleon (derecha) . Los datos están codificados por colores para simulacros, 12 y 24 hpi. Los cuadros representan el rango intercuartílico, la línea horizontal en el cuadro es la mediana y los bigotes representan 1,5 veces el rango intercuartílico. (Enterocito inmaduro de colon 2 12 h norte = 15 y 24 h norte = 47, TA secretora 12 h norte = 2 y 24 h norte = 4, TA 12 h norte = 7 y 24 h norte = 21, enterocito 2 12 h norte = 4 y 24 h norte = 11, enterocito inmaduro 1 12 h norte = 2 y 24 h norte = 7, células madre 12 h norte = 1 y 24 h norte = 3, Ciclismo TA 12 h norte = 3 y 24 h norte = 6, enterocito 1 12 h norte = 0 y 24 h norte = 4, Enterocito inmaduro de íleon 2 12 h norte = 31 y 24 h norte = 50, TA secretora 12 h norte = 1 y 24 h norte = 1, células enteroendocrinas 12 h norte = 3 y 24 h norte = 1, Ciclismo TA 12 h norte = 8 y 24 h norte = 15, TA 12 h norte = 5 y 24 h norte = 5, enterocito 1 12 h norte = 9 y 24 h norte = 4, enterocito inmaduro 1 12 h norte = 2 y 24 h norte = 8, células madre 12 h norte = 2 y 24 h norte = 1).
  3. Gráficos de puntos de determinantes de entrada conocidos entre tipos de células. El tamaño del punto representa el porcentaje de células que expresan el gen; el color representa la expresión relativa promedio en todo el tipo de célula. Los datos provienen de organoides de colon (izquierda) e íleon (derecha) con infección simulada.

Tropismo celular del SARS-CoV-2 y asociación con la expresión de ACE2 y TMPRSS2

Se sabe que la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) y la proteasa celular de tipo II transmembrana serina proteasa 2 (TMPRSS2) son los principales determinantes de la infección por SARS-CoV-2. El ACE2 es el receptor celular de la entrada viral mediadora del SARS-CoV-2 (Hoffmann et al, 2020). TMPRSS2 es una proteasa celular que procesa la proteína pico (S) del SARS-CoV-2, que es un paso esencial para la fusión de la envoltura viral con la membrana del huésped y la liberación de contenido viral en el citosol de las células. La scRNAseq combinada convencional y dirigida nos permitió investigar el vínculo entre el número de copias del genoma del SARS-CoV-2 y la expresión de ACE2 de una manera específica del tipo de célula. A diferencia de lo que esperábamos, los enterocitos inmaduros 2, el principal sitio de infección por SARS-CoV-2 en organoides de colon e íleon (Fig.2A y B), no eran las células que mostraban los niveles más altos de ACE2 (Fig. EV4A y B). Análisis de ACE2 Los niveles de expresión en todos los tipos de células revelaron que las células con niveles relativamente altos de ACE2 (p.ej., enterocitos 1) no fueron susceptibles a la infección por SARS-CoV-2 (Fig. 2B y C). De manera similar, encontramos que la infección por SARS-CoV-2 no está asociada con la expresión del homólogo estructural del receptor. AS, un receptor candidato para la base del SARS-CoV-2 (BSG, también conocido como CD147), así como las proteasas celulares furina, catepsina L1 (CTSL), aminopeptidasa ANPEP y DPP4 (Receptores MERS-CoV) (Fig 2C). De lo contrario, TMPRSS2 se encontró que estaba altamente expresado en enterocitos inmaduros 2 (Fig. 2C). En resumen, aunque ACE2 es un receptor reconocido para el SARS-CoV-2, no encontramos asociación entre ACE2 niveles de expresión y mayor susceptibilidad a la infección a nivel unicelular o entre tipos detectados de hIEC.

Figura EV4. Expresión de SARS-CoV-2 y ACE2 en organoides derivados del colon y del íleon

  1. Aproximación múltiple uniforme y proyección (UMAP) incrustación de los datos scRNAseq de organoides de colon infectados a las 12 y 24 hpi, coloreados por la expresión normalizada dirigida corregida de SAR-Cov-2. Colon (izquierda) e Ileum (derecha).
  2. Igual que (A) pero para la expresión relativa de ACE2 y TMPRSS2 para simulacros de infección.
  3. Recuentos totales de transcripción en cada tipo de célula para células infectadas de forma simulada e infectadas con SARS-CoV-2 y transeúntes en organoides de colon e íleon a las 12 hpi y 24 hpi. Los recuadros representan el rango intercuartílico, la línea horizontal en el recuadro es la mediana y los bigotes representan 1,5 veces el rango intercuartil (Colon Enterocyte 1 Mock Non-Infected norte = 326, 12 h espectador norte = 481, 24 h Infectados norte = Espectador de 4 y 24 h norte = 375, simulacro de TA en bicicleta no infectado norte = 273, 12 h infectados norte = 3, 12 h espectador norte = 361, 24 h Infectados norte = Espectador 6 y 24 h norte = 420, enterocito inmaduro 1 simulacro no infectado norte = 414, 12 h infectados norte = 2, 12 h espectador norte = 571, 24 h Infectados norte = Espectador de 7 y 24 h norte = 448, Enterocito 2 simulado no infectado norte = 402, 12 h infectados norte = 4, 12 h espectador norte = 350, 24 h Infectado norte = 11 y 24 h espectador norte = 245, TA simulacro no infectado norte = 244, 12 h infectados norte = 7, 12 h espectador norte = 324, 24 h Infectados norte = 21 y 24 h espectador norte = 293, células madre simuladas no infectadas norte = 268, 12 h infectados norte = 1, 12 h espectador norte = 324, 24 h Infectados norte = Espectador de 3 y 24 h norte = 207, enterocito inmaduro 2 simulacro no infectado norte = 208, 12 h infectados norte = 15, 12 h espectador norte = 152, 24 h Infectados norte = 47 y 24 h espectador norte = 169, TA secretora simulada no infectada norte = 36, 12 h Infectados norte = 2, 12 h espectador norte = 53, 24 h Infectados norte = Espectador de 4 y 24 h norte = 67. Enterocito inmaduro de íleon 2 Mock_Non-Infected norte = 459, 12 h_Infectado norte = 31, 12 h_Bystander norte = 476, 24 h_Infectado norte = 50 y 24 h_Bystander norte = 332, células madre simuladas no infectadas norte = 248, 12 h_Infectado norte = 2, 12 h_Bystander norte = 310, 24 h_Infectado norte = 1 y 24 h_Bystander norte = 166, TA Mock_Non-Infected norte = 272, 12 h_Infectado norte = 5, 12 h_Bystander norte = 269, 24 h_Infectado norte = 5 y 24 h_Bystander norte = 144, Enterocito inmaduro 1 Mock_N no infectado norte = 465, 12 h_Infectado norte = 2, 12 h_Bystander norte = 616, 24 h_Infectado norte = 8 y 24 h_Bystander norte = 282, Ciclismo TA Mock_Non-Infectado norte = 320, 12 h_Infectado norte = 8, 12 h_Bystander norte = 464,24 h_Infectados norte = 15 y 24 h_Bystander norte = 393, Enterocito 1 Mock_Non-Infected norte = 253, 12 h_Infectados norte = 9, 12 h_Bystander norte = 370, 24 h_Infectado norte = 4 y 24 h_Bystander norte = 138, células caliciformes simuladas no infectadas norte = 36, 12 h_Bystander norte = 60 y 24 h_Bystander norte = 31, TA secretora Mock_Non-Infected norte = 19, 12 h_Infectado norte = 1, 12 h_Bystander norte = 80, 24 h_Infectado norte = 1 y 24 h_Bystander norte = 10, células enteroendocrinas Mock_Non-Infected norte = 35, 12 h_Infectado norte = 3, 12 h_Bystander norte = 38, 24 h_Infectado norte = 1 y 24 h_Bystander norte = 26).

La infección por SARS-CoV-2 induce una regulación a la baja de ACE2 expresión en organoides intestinales

ACE2 Se ha informado que actúa como un gen estimulado por interferón (ISG), lo que da como resultado un mayor nivel de expresión tras la infección viral y la estimulación con interferón de las células epiteliales nasales y pulmonares (Ziegler et al, 2020). De manera similar, en pacientes con COVID-19, se demostró que la expresión de ACE2 estaba regulada al alza en las células epiteliales pulmonares en comparación con los pacientes de control (Chua et al, 2020). Para investigar si la expresión de ACE2 u otros receptores putativos y proteasas celulares clave se regula al alza con la infección por SARS-CoV-2 o con la respuesta inmune mediada por el SARS-CoV-2 en las hIEC primarias, comparamos sus niveles de expresión en células infectadas de forma simulada. vs. tanto células transeúntes infectadas con SARS-CoV-2 como no infectadas. Aunque no observamos ninguna asociación entre ACE2 expresión en células no infectadas y su propensión a ser infectadas por SARS-CoV-2 (Figs.2B y C, y EV4A y B), el análisis de expresión génica diferencial reveló que tras la infección por SARS-CoV-2 el ACE2 los niveles de expresión se regularon negativamente (Fig. 3A y B). En los organoides de colon, la regulación descendente visible de ACE2 La expresión se observó en las células infectadas, progresando de 12 hpi a 24 hpi, en comparación con las células infectadas de forma simulada (Fig. 3B, panel izquierdo). Es importante destacar que no hay diferencia significativa de ACE2 Se observó expresión en las células transeúntes (Fig. 3B). En organoides derivados del íleon, ACE2 la expresión también se reguló negativamente en las células infectadas. Sin embargo, a diferencia de los organoides de colon, ACE2 La expresión en las células transeúntes de los organoides de íleon también se reguló negativamente en comparación con las células infectadas de forma simulada (Fig. 3B, paneles de la derecha). Es importante destacar que se encontró que la expresión de ACE2 se correlacionó negativamente con la presencia del genoma viral (Fig. 3C y D). La regulación a la baja de ACE2 La expresión no solo se observó en los enterocitos inmaduros 2 que se identificaron como el sitio principal de infección por SARS-CoV-2 (Fig 2B), sino que también se observó en la mayoría de los otros tipos de células presentes en los organoides derivados del íleon durante el curso del SARS- Infección por CoV-2 (Fig 3E). Es poco probable que esto sea un producto de la represión transcripcional global ya que la tasa de detección de genes no cambia entre condiciones (Fig. EV4C). Niveles de expresión de los otros receptores putativos del SARS-CoV-2 y de proteasas celulares clave (p. Ej. TMPRSS2, furin y CTSL) también se encontró que estaban reducidas tanto en las células infectadas como en las transeúntes en los organoides derivados del íleon en comparación con las células infectadas simuladamente (Fig. 3B, panel derecho). Curiosamente, al considerar los organoides derivados del colon, se encontró que los niveles de expresión de estos genes celulares aumentaron ligeramente a las 12 hpi y disminuyeron a las 24 hpi (Fig. 3B, panel izquierdo). En conjunto, estos datos sugieren que ACE2 la expresión está regulada a la baja en las hIEC derivadas de colon e íleon tras la infección por SARS-CoV-2, pero con diferencias fundamentales entre las células transeúntes y las infectadas. Estas diferencias en la regulación a la baja inducida por el SARS-CoV-2 de ACE2 entre el colon y el íleon resaltan que las interacciones huésped / patógeno y los mecanismos de patogénesis pueden ser distintos entre diferentes secciones del tracto gastrointestinal. Para validar esta observación, realizamos fluorescencia multiplex de una sola molécula en el lugar hibridación (FISH) en organoides infectados con SARS-CoV-2. A las 12 y 24 hpi, los organoides se fijaron y evaluaron utilizando sondas específicas de transcripción dirigidas contra el genoma del SARS-CoV-2 y ACE2. El análisis de microscopía de fluorescencia confirmó que las células infectadas muestran niveles de expresión más bajos de ACE2 tanto a 12 hpi como a 24 hpi (Fig. 3F, flecha blanca). Cuantificación de los niveles de expresión relativa del genoma del SARS-CoV-2 y ACE2 Las transcripciones en las imágenes de ARN FISH a nivel unicelular nuevamente confirmaron una correlación negativa entre SARS-COV-2 y ACE2 (Figura 3G). En conjunto, nuestros datos sugieren fuertemente que los niveles de expresión de ACE2 disminución de las hIEC tanto en el colon como en el íleon tras la infección por SARS-CoV-2.

Figura 3. Regulación a la baja de ACE2 tras la infección por SARS-CoV-2

  1. Gráficos volcánicos de genes que se expresan diferencialmente en células infectadas en relación con células infectadas simuladas a las 12 hpi y 24 hpi en los organoides de íleon. La significancia estadística (-log10 del ajuste PAG-valor) se muestra en función del cambio de pliegue log2. Se utilizaron pruebas MAST para generar PAG-valores, se utilizó la corrección de hipótesis múltiples de Bonferroni para calcular Valores de FDR. Los puntos marcados en todos los paneles son nombres de genes de genes seleccionados expresados ​​diferencialmente entre las dos poblaciones comparadas.
  2. Gráficos de puntos que muestran los cambios de expresión de determinantes de entrada conocidos de SARS-CoV-2 para células tanto infectadas como transeúntes durante el curso de la infección (simulacro, 12 y 24 hpi) en organoides de colon (izquierda) e íleon (derecha). El tamaño del punto representa el porcentaje de células que expresan el gen; el color representa la expresión relativa promedio en el tipo de célula excluyendo los ceros.
  3. Correlación de Pearson de los valores de expresión génica con la cantidad de genoma del SARS-CoV-2 (eje y) frente al cambio máximo log2 veces (eje x) a través de las condiciones. Esta gráfica se genera comparando 12 y 24 hpi con una simulación. Los 5 principales genes altamente correlacionados y anticorrelacionados y los determinantes de entrada conocidos del SARS-CoV-2 están resaltados en azul.
  4. Correlación de la expresión del SARS-CoV-2 con ACE2 expresión en todos los tipos de células infectadas de los organoides de íleon a las 24 hpi. (norte = 146) El área gris representa el error estándar de la línea ajustada.
  5. Valores de expresión normalizados logarítmicos a escala global de ACE2 en cada tipo de célula para células infectadas de forma simulada e infectadas con SARS-CoV-2 en organoides de íleon a las 12 hpi y 24 hpi. Los cuadros representan el rango intercuartílico, la línea horizontal en el cuadro es la mediana y los bigotes representan 1,5 veces el rango intercuartílico (Enterocito inmaduro 2 Mock norte = 377, 12 h norte = 390 y 24 h norte = 270, Células madre simuladas norte = 184, 12 h norte = 219 y 24 h norte = 115, TA simulado norte = 248, 12 h norte = 241 y 24 h norte = 128, enterocito inmaduro 1 simulacro norte = 452, 12 h norte = 559 y 24 h norte = 280, simulacro de TA de ciclismo norte = 187, 12 h norte = 240 y 24 h norte = 214, Enterocito 1 simulado norte = 249, 12 h norte = 374 y 24 h norte = 140, Mock de células caliciformes norte = 12, 12 h norte = 24 y 24 h norte = 5, simulacro de TA secretora norte = 7, 12 h norte = 59 y 24 h norte = 2, Mock de células enteroendocrinas norte = 26, 12 h norte = 30 y 24 h norte = 15).
  6. Multicine en el lugar Hibridación de ARN de ACE2 y SARS-CoV-2 de organoides de íleon 2D infectados y simulados a las 12 hpi y 24 hpi. Las flechas blancas apuntan a las células infectadas con SARS-CoV-2. Se muestra una imagen representativa.
  7. Correlación de la expresión relativa SARS-CoV-2 y ACE2 para las células infectadas del multiplex en el lugar Hibridación de ARN mostrada en (F). Cada punto representa una celda.

El SARS-CoV-2 induce una respuesta proinflamatoria en las hIEC

Para evaluar la respuesta de las hIEC a la infección por SARS-CoV-2, realizamos un análisis de expresión génica comparativo entre organoides infectados y simulados. Para los organoides infectados, se consideraron por separado las células infectadas (aquellas con genoma de SARS-CoV-2 detectado) y las células transeúntes (aquellas sin genoma de SARS-CoV-2). En los organoides de colon, ya a las 12 hpi, las hIEC muestran una fuerte respuesta de NFκB y TNF a la infección, y esta respuesta se vuelve aún más pronunciada a las 24 hpi (Fig. EV5A y B). Al comparar las células simuladas con las transeúntes, notamos que a las 24 hpi, la respuesta de las células transeúntes siguió principalmente a una respuesta inmune mediada por IFN caracterizada por la presencia de múltiples ISG (Fig. EV5C y D). Esta observación sugiere que las células infectadas generan una respuesta proinflamatoria, mientras que las células espectadoras probablemente responden al IFN secretado de manera paracrina. Esto está respaldado por el análisis de expresión génica diferencial de las células transeúntes frente a las infectadas, que muestra que las células infectadas tienen una respuesta mediada por NFκB y TNF más fuerte en comparación con las células transeúntes (Fig. EV5E y F). Se encontraron resultados similares en organoides derivados del íleon infectados con SARS-CoV-2 (Fig. EV5G-L). Curiosamente, a las 24 hpi, algunos genes estimulados por interferón (ISG) (p.ej., IFIT1-3, MX1, CXCL10, IRF1) también estaban reguladas positivamente en las células infectadas, pero en mucho menor grado en comparación con las células transeúntes (Fig. EV5G-J). Además, aunque se encontró que las células infectadas en los organoides derivados del íleon generan una respuesta mediada por NFκB / TNF similar en comparación con los organoides derivados del colon (Fig. EV5B y H), las células transeúntes derivadas del íleon tuvieron una respuesta mediada por IFN más fuerte que puede ser visto por la mayor expresión global de ISG en los organoides de íleon en comparación con los organoides de colon tras la infección por SARS-CoV-2 (Fig. EV5D y J). Juntos, estos análisis comparativos de expresión génica revelaron que tras la infección por SARS-CoV-2 de células epiteliales intestinales humanas, se generan respuestas proinflamatorias fuertes y mediadas por IFN.

Figura EV5. Respuesta diferencial de las células infectadas y transeúntes a la infección por SARS-CoV-2

  • A – F. Gráficos de volcán que muestran los genes que se expresan diferencialmente tras la infección de organoides del colon por SARS-CoV-2. (A, B) células infectadas frente a células infectadas simuladas a las 12 hpi (A) y 24 hpi (B), (C, D) células transeúntes frente a células infectadas simuladas a las 12 hpi (C) y 24 hpi (D), y (E, F) células infectadas frente a transeúntes a las 12 hpi (E) y 24 hpi (F). La significancia estadística (-log10 ajustado PAG-valor) se muestra en función del cambio de pliegue log2. Se utilizaron pruebas MAST para generar PAG-valores, se utilizó la corrección de hipótesis múltiples de Bonferroni para calcular Valores de FDR. Los puntos marcados en azul en todos los paneles son nombres de genes de genes seleccionados expresados ​​diferencialmente entre las dos poblaciones comparadas. Los puntos marcados en rojo en todos los paneles son genes correspondientes al interferón si se detectan.
  • G – L. Igual que (A – F) pero para los organoides de íleon.

Respuesta inmune específica del tipo de célula en células infectadas frente a transeúntes

Teniendo en cuenta las diferencias en la susceptibilidad de los diferentes tipos de hIEC al SARS-CoV-2, con enterocitos inmaduros 2 que constituyen el sitio principal de infección del SARS-CoV-2 (Fig 2), comparamos la respuesta de cada tipo de célula individual con Infección por SARS-CoV-2. De manera similar al análisis de todos los tipos de células tomados en conjunto (Fig. EV5), el análisis de expresión génica diferencial de enterocitos inmaduros infectados derivados del colon 2 reveló una fuerte respuesta mediada por NFκB / TNF, mientras que los enterocitos inmaduros 2 transeúntes muestran principalmente una respuesta mediada por IFN (Fig. 4A – C y Apéndice Fig. S3A). De manera similar, en los organoides derivados del íleon, los enterocitos inmaduros infectados 2 también mostraron una fuerte respuesta mediada por NFκB / TNF (Fig. 4F y H, y Fig. S3B del Apéndice) mientras que las células espectadoras se caracterizaron por su respuesta a los IFN secretados que conducen a la expresión de ISG (Fig. 4G y Apéndice Fig S3B).

Figura 4. Respuesta inmune innata intrínseca generada por enterocitos inmaduros 2 tras la infección por SARS-CoV-2

  • C.A. Gráficos de volcán que muestran los genes que se expresan diferencialmente en los enterocitos inmaduros 2 tras la infección por SARS-CoV-2 de los organoides del colon. (A) infectado vs. simulacros de células infectadas, (B) espectador vs. células infectadas simuladas y (C) infectadas vs. células transeúntes. La significancia estadística (-log10 ajustado PAG-valor) se muestra en función del cambio de pliegue log2. Se utilizaron pruebas MAST para generar PAG-valores, se utilizó la corrección de hipótesis múltiples de Bonferroni para calcular Valores de FDR. Los puntos marcados en azul en todos los paneles son nombres de genes de genes seleccionados expresados ​​diferencialmente entre las dos poblaciones comparadas. Los puntos marcados en rojo en todos los paneles son genes correspondientes al interferón si se detectan.
  • D. Gráfico de puntos de los 42 genes más expresados ​​diferencialmente tras la infección por SARS-CoV-2 en células simuladas, infectadas y transeúntes a las 12 y 24 hpi. El tamaño del punto representa el porcentaje de células que expresan el gen; el color representa la expresión relativa promedio en todo el tipo de célula.
  • E. Igual que en (D) pero para los 30 principales ISG expresados ​​de manera más diferencial.
  • F – J. Igual que (A – E) pero para organoides de íleon. Los puntos marcados en azul en todos los paneles son nombres de genes de genes seleccionados expresados ​​diferencialmente entre las dos poblaciones comparadas. Los puntos marcados en rojo en todos los paneles son genes correspondientes al interferón si se detectan.

El análisis de la vía confirmó que la respuesta de los espectadores fue principalmente una respuesta relacionada con el IFN, mientras que la respuesta de las células infectadas fue principalmente proinflamatoria (Figura S4 del Apéndice). Comparación de la respuesta transcripcional a la infección por SARS-CoV-2 en personas infectadas vs. Los enterocitos 2 inmaduros transeúntes confirmaron además que las células infectadas montan una fuerte respuesta proinflamatoria caracterizada por la regulación al alza de NFκB y TNF (Fig. 4C y D, y H e I). El análisis de los 30 principales ISG expresados ​​diferencialmente en organoides derivados de colon muestra claramente que a las 24 hpi, las células transeúntes responden al IFN regulando al alza la expresión de un gran panel de ISG (figura 4E). Se observaron hallazgos similares en enterocitos 2 inmaduros de organoides de íleon, aunque también se encontró que las células infectadas expresan más ISG en comparación con sus contrapartes derivadas del colon. Es importante destacar que tanto en los organoides de colon como de íleon, los transeúntes mostraron niveles más altos de expresión para todos los ISG considerados en comparación con las células infectadas (Fig. 4E y J). Estos resultados son consistentes con la observación de que los organoides derivados del íleon son más inmuno-sensibles en comparación con los organoides derivados del colon (Fig. EV5D y J). Juntos, estos datos muestran que tras la infección por SARS-CoV-2, las células infectadas montan una fuerte respuesta proinflamatoria mediada por NFκB / TNF y muestran una producción limitada de ISG, mientras que las células espectadoras montan una fuerte respuesta mediada por IFN a través de una expresión fuertemente regulada al alza de un amplio panel de ISG.

Para determinar si la respuesta inmune caracterizada de NFκB / TNF-alto e IFN-bajo es específica para los enterocitos inmaduros 2, también examinamos individualmente cada tipo de célula infectada. Si bien es difícil sacar una conclusión sólida sobre cómo se comportan las células infectadas para todos los tipos de células debido a su baja permisividad a la infección por SARS-CoV-2 (número bajo de células infectadas) y al bajo nivel de transcripciones virales, podemos observar que las células infectadas muestran un fuerte respuesta mediada por NFκB / TNF (Apéndice Figs. S5-S8). Curiosamente, observamos que las células transeúntes de diferentes tipos de células producen diferentes patrones de ISG (Apéndice Figs S5-S8). Dado que nuestro análisis scRNAseq dirigido reveló la presencia de ARN viral de fondo en las muestras (Fig. EV3), preguntamos si la respuesta inmune observada se está transmitiendo en cascada a las células transeúntes a través del interferón tipo III secretado por las células infectadas o si es causada por la acción directa de no -replica de partículas virales en células transeúntes. Para abordar esto, se infectaron organoides de colon e íleon con SARS-CoV-2 vivo o inactivado por UV. Los resultados revelaron que tras la infección con SARS-CoV-2 vivo se produjeron tanto IFN como ISG (Apéndice Fig. S9). Por el contrario, la exposición de organoides al SARS-CoV-2 inactivado por UV no condujo a la replicación del virus y las células no produjeron tanto IFN como ISG (Apéndice Fig. S9). Esto demuestra que la replicación activa es necesaria para la respuesta inmune descrita y nos permitió descartar la exposición a partículas virales no replicantes como causa de esta respuesta. En conjunto, nuestros resultados muestran que las células infectadas y transeúntes responden de manera diferente a la infección por SARS-CoV-2 donde las células infectadas montan una respuesta mediada por NFκB / TNF mientras que las células transeúntes montan una respuesta mediada por IFN.

Actividad de señalización en células infectadas frente a transeúntes

Para caracterizar la señalización que sustenta la respuesta inmune distinta de las células infectadas y transeúntes tras la infección por SARS-CoV-2, inferimos la actividad de señalización de la ruta a partir de los datos de scRNAseq con PROGENy (Fig. 5A y B). Para los organoides de colon e íleon, las células infectadas muestran una fuerte activación de las rutas MAPK, NFκB y TNFα. De acuerdo con el análisis de enriquecimiento (Apéndice Fig. S3), se encontró que estas vías estaban menos activadas en las células transeúntes con puntuaciones más altas en el íleon en comparación con el colon (Fig. 5A y B). Curiosamente y de acuerdo con nuestros análisis de expresión génica diferencial (Figs. 4 y EV5 y Fig. S3 del Apéndice), se encontró que la vía de señalización JAK-STAT se activaba principalmente en las células transeúntes (Fig. 5A y B). Para dilucidar aún más la actividad de señalización a nivel de una sola célula, generamos mapas de difusión de todas las células individuales basados ​​en la expresión scRNAseq de genes relacionados con el interferón (Fig. 5C y D). Tanto en el íleon como en el colon, observamos una clara bifurcación de todas las células en dos ramas distintas, una rama que representa principalmente células infectadas y otra rama que representa principalmente células transeúntes. El cálculo de las actividades de los factores de transcripción (TFA) basado en la expresión génica de su objetivo puede proporcionar una medida más sólida del efecto de los factores de transcripción (TF) en comparación con solo la expresión génica. Por lo tanto, calculamos el TFA de factores de transcripción seleccionados para todas las células individuales usando SCENIC y mapeamos las actividades inferidas en los mapas de difusión de una sola célula (Fig. 5C y D, recuadros de la derecha). Encontramos que los factores de transcripción STAT1 e IRF1 se activaron principalmente en las células transeúntes (ramificación a lo largo de DC1) mientras que JUN se activó en las células infectadas (ramificación a lo largo de DC2) (Fig. 5C y D, paneles de la izquierda). Al extender este análisis a los factores de transcripción cuyo patrón de actividad está altamente correlacionado con DC1 o DC2, se reveló que, globalmente, los factores de transcripción que son críticos para la señalización mediada por IFN (es decir. el complejo ISGF3: STAT1 / STAT2 / IRF9 e IRF1) son muy activos en las células transeúntes (Fig. 5E y F). De manera similar, el factor de transcripción variante de ETS 7 (ETV7), que es un ISG que actúa como un regulador negativo de la señalización mediada por IFN (preimpresión: Froggatt et al, 2019) y el Gene 1 de respuesta de crecimiento temprano (EGR1) que mejora la señalización de IFN de tipo I (Zhu et al, 2018) también se activaron en células transeúntes (Fig.5E y F). La regulación al alza de las vías dependientes de EGR1 y JUN fue consistente con los hallazgos del trabajo anterior que investigaba la infección por SARS-CoV-2 del pulmón humano y las líneas celulares del epitelio intestinal Calu-3 y Caco-2 (preimpresión: Wyler et al, 2020 ).

Figura 5. Actividad de señalización diferencial de infectados vs. células transeúntes tras la infección por SARS-CoV-2

  • A, B. Mapas de calor de la actividad de señalización de la vía relativa escalada inferida por PROGENy para los organoides de (A) colon y (B) íleon.
  • C, D. Incrustaciones de mapas de difusión que muestran células simuladas, transeúntes e infectadas (paneles grandes) y actividades para factores de transcripción seleccionados STAT1, IRF1 y JUN (paneles pequeños) para organoides de colon (C) e íleon (D). Las escalas de color de las cajas representan valores de puntuación absolutos en unidades arbitrarias.
  • E, F. Mapas de calor de las actividades de los factores de transcripción a lo largo de trayectorias en bifurcación de los mapas de difusión correspondientes para los organoides de (E) colon y (F) íleon. Las anotaciones de la parte superior de la columna representan el estado de infección de cada célula (infectada, transeúnte y simulada). Las dimensiones DC1 y DC2 representan los dos primeros autovectores de la matriz de transición de Markov y se calcularon por separado para organoides de colon o íleon. Las escalas de color de las cajas representan valores absolutos de puntuación en unidades arbitrarias.

El SARS-CoV-2 inhibe la expresión de ISG mediada por IFN

Para validar que la respuesta mediada por IFN es específica de las células transeúntes, se infectaron organoides derivados del íleon con SARS-CoV-2. A las 12 y 24 hpi, se realizó FISH de ARN de molécula única utilizando sondas específicas para el genoma del SARS-CoV-2 y para ISG15 que se encontró altamente regulada al alza después de la infección y tiene el -log10 más alto PAG-valor en el análisis diferencial que compara las células transeúntes frente a las células infectadas de forma simulada (Fig. 4G). Las imágenes de microscopía revelaron que las células transeúntes (no infectadas) eran de hecho positivas para ISG15 (Figura 6A). Curiosamente, se encontró que las células infectadas con SARS-CoV-2 expresan poco o nada ISG15 (Fig. 6A, flechas blancas). La cuantificación confirmó que las células que mostraban la expresión más alta de ISG15 eran negativas para el genoma del SARS-CoV-2 (figura 6B). Estos resultados apoyan el modelo de que las células transeúntes responden a la infección por SARS-CoV-2 montando una respuesta mediada por IFN. Por otro lado, como se muestra mediante el uso de scRNAseq (Fig 4) y RNA FISH (Fig 6A), las células infectadas no generan una respuesta mediada por IFN (expresión baja o nula de ISG), lo que sugiere que las células infectadas son refractarias a IFN. Para abordar si la infección por SARS-CoV-2 puede afectar la señalización mediada por IFN, monitoreamos directamente la producción de ISG en respuesta al tratamiento con IFN en células infectadas o no infectadas. Sin embargo, aunque es bien sabido que los ISG se elaboran de una manera dependiente de JAK-STAT aguas abajo de los receptores de IFN, existe una evidencia creciente de que un subconjunto de ISG se puede hacer aguas abajo de IRF3 después del reconocimiento viral por los PRR. Para aliviar esta producción de ISG mediada por IRF3 no deseada, generamos una línea celular intestinal humana (T84) desprovista de IRF3. Infección del IRF3 KO T84 no dio como resultado la producción de ISG según lo monitoreado por q-RT-PCR de ISG15 (Figura 6D). IRF3 Las células KO T84 se infectaron de forma simulada o se infectaron con SARS-CoV-2, a las 24 hpi las células se trataron con IFN y 12 h después del tratamiento se evaluó la producción de ISG15 mediante q-RT-PCR y se normalizó al gen de mantenimiento (TBP) (Figura 6C). Los resultados muestran que las células IRF3 KO T84 infectadas de forma simulada respondieron al IFN, lo que demuestra que el agotamiento genético de IRF3 no altera la señalización mediada por IFN (Fig. 6D). Curiosamente, en las células IRF3 KO T84 infectadas con SARS-CoV-2, la producción de ISG15 tras el tratamiento con IFN se redujo significativamente (Fig. 6D). Para confirmar que esta inducción alterada de ISG15 tras el tratamiento con IFN era específica de la infección por SARS-CoV-2, se infectaron células IRF3 KO T84 con astrovirus a una MOI de 3 para lograr la infección completa (Fig. 6E). A diferencia de la infección por SARS-CoV-2, la infección de IRF3 Las células KO T84 por astrovirus no dañaron la señalización mediada por IFN como una regulación positiva similar de ISG15 se observó tanto en células infectadas de forma simulada como en células infectadas con astrovirus tras el tratamiento con IFN (Fig. 6D). En un segundo enfoque de validación, para demostrar completamente que solo las células infectadas tienen una señalización mediada por IFN alterada, desarrollamos un ensayo basado en un reportero fluorescente de la expresión de ISG (Fig. 6F). Para ello, generamos una línea celular T84 transducida con un reportero hecho de la región promotora del ISG. MX1 impulsando la expresión de la proteína fluorescente mCherry. Mx1 se sabe que se fabrica estrictamente cadena abajo del receptor de IFN de una manera dependiente de JAK-STAT pero no cadena abajo de IRF3. Tras el tratamiento con IFN, alrededor del 30-40% de las células que expresan este informador respondieron y se volvieron fluorescentes (Fig. 6G). Después de la infección con SARS-CoV-2 con una multiplicidad de infección (MOI) de 3, se encontró que la mayoría de las células estaban infectadas (Fig. 6G). Sin embargo, cuando las células se trataron 24 hpi con IFN, la mayoría de las células infectadas no respondieron al IFN y muy pocas se volvieron doble positivas tanto para el virus como para el virus. MX1 mCherry conducida (Fig 6G, panel izquierdo). Para controlar que las células transeúntes no infectadas pudieran responder a IFN y expresar mCherry, repetimos este experimento pero usando un MOI de 1 para la infección por SARS-CoV-2. Se encontró que aproximadamente el 40% de las células estaban infectadas. La suplementación con IFN afectó principalmente a las células no infectadas, como puede verse en el aumento de células positivas a MX1 y sin cambios en el número de células positivas dobles (tanto infectadas como positivas para MX1) (Fig. 6G, panel derecho).

Figura 6. La infección por SARS-CoV-2 altera la señalización mediada por interferón

  1. Los organoides derivados del íleon humano se sembraron en 2D en portaobjetos de cámara iBIDi. Se fijaron células de 12 y 24 hpi y la cantidad de células infectadas con SARS-CoV-2 (rojo) y la inducción de ISG15 (blanco) se analizó mediante FISH de ARN de molécula única. Los núcleos se visualizaron con DAPI (azul). Las flechas blancas indican células positivas para SARS-CoV-2. norte = 3 muestras biológicas. Se muestra una imagen representativa. Barra de escala = 100 um.
  2. Cuantificación de la intensidad de fluorescencia media de las muestras en (A). Cada punto representa una celda.
  3. Esquema que representa la infección y la adición de interferón para evaluar la inducción de ISG15 después de la infección por SARS-CoV-2 y astrovirus.
  4. T84 IRF3 las células knockout se infectaron con SARS-CoV-2 o astrovirus humano 1 a una MOI = 3. 24 hpi, las células se incubaron en presencia o ausencia de 2.000 UI / ml de IFNβ1. 12 h después del tratamiento se extrajo ARN y se indujo ISG15 se analizó mediante q-RT-PCR y se normalizó al gen de mantenimiento TBP. norte = 3 réplicas biológicas. La barra de error indica la desviación estándar. Las estadísticas se determinaron mediante la prueba t para datos no apareados.
  5. Se infectaron células knockout T84 IRF3 con SARS-CoV-2 o astrovirus humano 1 a una MOI = 3. 24 hpi, las células se fijaron y se tiñeron para la proteína N del SARS-CoV-2 o para la proteína de la cápside del astrovirus 1 humano (HAstV1). norte = 3 réplicas biológicas. Se muestra una imagen representativa. Barra de escala = 100 um.
  6. Esquema que representa las células que expresan mcherry T84 MX1 y su respuesta a la infección por IFN o SARS-CoV-2.
  7. T84 MX1 mcherry fueron infectados con SARS-CoV-2 en un MOI = 3 o MOI = 1. Se incubaron células de 24 hpi en presencia o ausencia de 2.000 UI / ml de IFNβ1. 12 h después del tratamiento, las células se fijaron y se tiñeron para la proteína N del SARS-CoV-2.Se cuantificó el número de células MX1 positivas, SARS-CoV-2 positivas y doble positivas. norte = Se realizaron 3 réplicas biológicas. La barra de error indica la desviación estándar.

En conjunto, nuestros resultados proporcionan una fuerte evidencia de que tras la infección con células intestinales humanas primarias de SARS-CoV-2 generan una fuerte respuesta mediada por NFκB / TNF y producen IFN. Este IFN actúa de manera paracrina sobre las células transeúntes que conduce a la regulación positiva de los genes estimulados por IFN. Es importante destacar que la infección por SARS-CoV-2 hace que las células infectadas sean refractarias al IFN, ya que muestran poco o ningún aumento en la actividad de las vías de señalización JAK-STAT y no regulan positivamente la expresión génica estimulada por IFN.


Biología

Descripción del programa
Estudiar Biología en AUM podría llevarlo a descubrir un nuevo gen, educar al público sobre enfermedades infecciosas o vacunar a todos los perros en su refugio local contra la rabia. Ya sea que su interés esté en la genética, la salud pública o tener éxito en la escuela de medicina, odontología o veterinaria, las concentraciones en el Departamento de Biología y Ciencias Ambientales de AUM le permiten perseguir sus intereses. El grado de Biología de AUM ofrece concentraciones en Biología general, Ciencias de la Salud, Biología Molecular, y Salud pública y microbiología. Un título en Biología puede conducir a una variedad de trabajos en laboratorios de investigación, gobierno o empresas privadas.

Puntos de orgullo

  • Los estudiantes que buscan ingresar a programas profesionales de salud (como escuelas de medicina, odontología, veterinaria o farmacia) trabajan con un asesor académico de tiempo completo dedicado exclusivamente a estos estudiantes.
  • En 2015, se aceptó el 90 por ciento de los estudiantes de AUM que trabajaron con ese asesor y se postularon a la escuela de medicina, odontología o veterinaria.
  • Casi el 20 por ciento de los estudiantes investiga con un miembro de la facultad y muchos publican artículos y viajan a conferencias.
  • Actualmente, los profesores cuentan con subvenciones de la National Science Foundation, el Departamento de Energía de EE. UU. Y el Departamento de Educación del Estado de Alabama.
  • Los estudiantes pueden realizar investigaciones en el Laboratorio de Investigación de Bioprocesamiento y Biocombustibles del departamento o en el Instituto de Investigación Geoespacial.
  • Los estudiantes pueden tomar cursos de biología marina en el Dauphin Island Sea Lab en el Golfo de México.
  • Los estudiantes pueden tomar semestres en el extranjero en Costa Rica y Sudáfrica.
  • Las oportunidades de estudios de verano en el extranjero, como las de Galápagos, se ofrecen anualmente o semestralmente.

Pon tu título a trabajar

Nota: Si bien los salarios varían según varios factores, incluido su nivel de experiencia, educación y capacitación, y geografía e industria, aquí hay una muestra del crecimiento laboral y los salarios futuros en esta área.

Se proyecta que el crecimiento del empleo en todas las ocupaciones de la vida, las ciencias físicas y las ciencias sociales será del 7 por ciento entre 2014 y 2014, aproximadamente el promedio de todas las ocupaciones. El salario medio anual más reciente para las ocupaciones de la vida, las ciencias físicas y las ciencias sociales fue de $ 61,450, más alto que el salario medio anual para todas las ocupaciones.

Datos de muestra de la Oficina de Trabajo y Estadísticas de EE. UU.
TrabajoPago medioCrecimiento del empleo hasta 2024
Científico Médico$ 79,930 por año9% (9.000 puestos de trabajo más)
Técnico biológico$ 41,290 por año5% (4.100 empleos más)
Técnico en ciencias forenses$ 55,360 por año27% (3.800 empleos más)

Para más información

Warhawks altísimos

Mira lo que están haciendo nuestros antiguos alumnos:

  • El Dr. Rick Bright es Director interino de la División de Influenza, Autoridad de Investigación y Desarrollo Biomédico Avanzado, Oficina del Subsecretario de Preparación y Respuesta, Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE. UU.
  • Kaori Knights dirige el laboratorio de citometría de flujo en la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Estatal de Kansas.
  • Jeremy Gallman es capitán del Cuerpo Veterinario de los Estados Unidos.
  • Greg Vison trabajó en el Departamento de Gestión Ambiental de Alabama y ahora es pescador profesional.

Reseña del programa

Los listados de cursos a continuación son una representación de lo que requiere este programa académico. Para obtener una revisión completa de este programa en detalle, consulte nuestro catálogo oficial en línea Y consulte con un asesor académico. Esta lista no incluye los cursos del plan de estudios básico requeridos para todas las especialidades y es posible que no incluya información específica del programa, como los estándares de admisión, retención y terminación.
El muestreo de cursos específico para la especialización en Biología incluye:


Laboratorio Verdin

Comprender los reguladores epigenéticos del proceso de envejecimiento.

VERDIN LAB

Enfoque de laboratorio

El laboratorio de Verdin estudia la relación entre el envejecimiento y el sistema inmunológico. El envejecimiento está asociado con defectos en el sistema inmunológico adaptativo y con un estado de activación crónica del sistema inmunológico innato (inflamación crónica).

Estudiamos cómo el envejecimiento inmunológico está regulado por la nutrición. Hemos demostrado cómo los cambios en la abundancia relativa de metabolitos celulares clave como NAD +, acetilcoenzima A y el cuerpo cetónico beta-hidroxibutirato fluctúan bajo diferentes condiciones nutricionales (obesidad, restricción calórica, ayuno, alimentación con restricción de tiempo, dieta cetogénica) y cómo esto influye en las respuestas inmunitarias. Estamos trabajando en enzimas clave reguladas por estos metabolitos. Estos incluyen sirtuinas (NAD +), histonas acetiltransferasas (acetilcoenzima A) e histonas desacetilasas (HDAC).

Utilizamos sistemas de modelos de gusanos, ratones y humanos (incluidas las células madre y las iPSC) para definir cómo los nutrientes influyen en las respuestas inmunitarias durante el envejecimiento. También estamos estudiando cómo la infección por VIH induce un estado de inflamación crónica y activación inmunitaria y cómo esto induce un envejecimiento acelerado en pacientes infectados por el VIH.

Por que importa

Creemos que la inflamación crónica representa un factor unificador clave que sustenta el desarrollo de las enfermedades crónicas del envejecimiento, incluida la neurodegeneración (Parkinson y Alzheimer), cáncer, diabetes tipo 2 y aterosclerosis (ataque cardíaco y accidente cerebrovascular). Estamos intrigados por las posibles conexiones entre la senescencia, el intestino permeable y la activación inmune innata. Una mejor comprensión de los mecanismos que conducen a la inflamación crónica asociada con el envejecimiento debería proporcionar nuevos objetivos terapéuticos y posibles intervenciones contra el envejecimiento humano.

La ciencia muestra que, si bien el envejecimiento cronológico es inevitable, el envejecimiento biológico es maleable. Hay una parte de ella contra la que puedes luchar, y nos estamos acercando cada vez más a ganar esa pelea.

DETALLES DE LABORATORIO

El laboratorio de Verdin se complace en reconocer el generoso apoyo de los siguientes patrocinadores principales:

El Dr. Verdin es el presidente y director ejecutivo del Instituto Buck de Investigación sobre el Envejecimiento. Originario de Bélgica, el Dr. Verdin recibió su Doctorado en Medicina (MD) de la Universidad de Lieja y completó una formación clínica y de investigación adicional en la Facultad de Medicina de Harvard. Ha ocupado cargos docentes en la Universidad de Bruselas, los Institutos Nacionales de Salud (NIH) y el Instituto Picower de Investigación Médica. El Dr. Verdin también es profesor de medicina en la Universidad de California, San Francisco.

El Dr. Verdin estudia cómo el metabolismo, la dieta y las moléculas pequeñas regulan la actividad de las HDAC y las sirtuinas y, por lo tanto, el proceso de envejecimiento y sus enfermedades asociadas, incluida la enfermedad de Alzheimer. Ha publicado más de 210 artículos científicos y tiene más de 15 patentes. Es un científico muy citado (1 por ciento superior) y ha sido reconocido por su investigación con un Premio Glenn de Investigación en Mecanismos Biológicos del Envejecimiento y una beca de alto nivel de la Fundación Médica Ellison. Es miembro electo de varias organizaciones científicas, incluida la Asociación Estadounidense para el Avance de la Ciencia, la Sociedad Estadounidense de Investigación Clínica y la Asociación de Médicos Estadounidenses. También es miembro del consejo asesor del Instituto Nacional sobre el Abuso de Drogas de los Institutos Nacionales de Salud.

El Dr. Verdin tiene una amplia experiencia trabajando con empresas de biotecnología. Es uno de los fundadores de Acylin (comprado por Abbvie). Formó parte de las juntas asesoras científicas de Elixir, Sirtris (comprado por GSK), Calico (Google) y Nokia, y también se desempeñó como asesor de Sofinnova Ventures. El Dr. Verdin también ha trabajado durante varios años como consultor de Novartis, GSK, J&J, Altana, Roche, Pfizer y otras empresas de biotecnología.

Cristina creció en Rumania. Obtuvo su licenciatura en genética de la Universidad de Manchester, Reino Unido. Su tesis se centró en el descubrimiento de mutaciones genéticas novedosas que causan el síndrome de Gorlin, un síndrome de cáncer hereditario. Durante sus estudios, completó una pasantía de un año en la Universidad de Nevada, Reno, donde examinó las interacciones proteína-proteína y la fosforilación de proteínas involucradas en la regulación de la contractilidad del músculo liso del estómago. Se incorporó al laboratorio de Verdin en junio de 2020.

Nicolas obtuvo su doctorado en inmunología de la Universidad de Emory. Allí, utilizó un modelo de infección viral crónica para investigar el papel de la dosis viral inicial y las señales inflamatorias tempranas en la configuración de la calidad y magnitud de las respuestas de las células T específicas del virus. Su investigación posterior abarcó temas tan diversos como la biología del cáncer, la autoinmunidad, la tecnología de anticuerpos recombinantes y el papel de la estructura de la cromatina en la respuesta al daño del ADN. Después de un breve período en el mundo académico, Nicolas se unió al laboratorio de Verdin en el verano de 2019 para estudiar los mecanismos que establecen y mantienen la latencia del VIH. Además, investigará los mecanismos que contribuyen al fenotipo de envejecimiento acelerado de los pacientes infectados por el VIH. Cuando no está en el laboratorio, a Nicolas le gusta correr senderos y explorar las carreteras secundarias de California desde el asiento de una motocicleta.

Olga obtuvo su licenciatura y maestría en bioquímica de la Universidad Nacional Taras Shevchenko de Kiev en Ucrania. Luego se mudó a Alemania para estudiar Biomedicina Regenerativa en el DFG-Center for Regenerative Therapies Dresden (CRTD). Realizó su trabajo de tesis de maestría en los EE. UU. En la Universidad de Florida y trabajó allí durante un año después de graduarse de TU Dresden. En Florida, dominó la técnica de microdisección por captura láser (LCMT) y estableció un protocolo de tinción adecuado para el aislamiento de ARN de islotes pancreáticos humanos de pacientes con diabetes tipo 1 para análisis de microarrays. Regresó a Europa para realizar su doctorado en la unidad de investigación más grande de Francia, el Instituto de Genética y Biología Molecular y Celular (IGBMC) afiliada a la Universidad de Estrasburgo. Allí estudió las vías de señalización que regulan la dinámica mitocondrial durante la progresión mitótica. Su pasión por la biología mitocondrial la llevó al laboratorio de Eric Verdin. En The Buck, estudia cómo el metabolismo y la función mitocondriales afectan el proceso de envejecimiento en humanos y ratones. Le gusta la jardinería, la fotografía, los juegos de la NBA y el diseño de interiores.

El Dr. Boutoual creció en Agadir, Marruecos. Se unió al laboratorio Verdin en octubre de 2018, luego de su doctorado en biología molecular y celular de la Universidad de Abdelmalek Essaadi, facultad de Ciencias, Tetuán, Marruecos. Rachid completó la mayoría de sus estudios para su Ph.D. trabajo en el laboratorio de la Dra. Maria Eugenia Armengod en el Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia, España. Su tesis doctoral se centró en la comprensión de los mecanismos moleculares de las enfermedades mitocondriales asociadas con defectos en la modificación postranscripcional de los ARNt mitocondriales catalizados por las proteínas TRMU, MTO1 y GTPBP3. Actualmente, Rachid está interesado en el papel de las sirtuinas mitocondriales, la acilación de proteínas y la regulación epigenética en el envejecimiento. Si el tiempo lo permite, le gusta practicar deportes, especialmente fútbol y nadar, dar largos paseos por la playa y, por supuesto, como es nuevo en San Francisco, disfruta explorando esta ciudad.

El Dr. Covarrubias está explorando actualmente los vínculos entre la inflamación y el envejecimiento. Se unió al laboratorio de Verdin en la primavera de 2016 después de obtener su doctorado en el programa de ciencias biológicas de la Escuela de Salud Pública de Harvard. Tiene un interés particular en cómo el sistema inmunológico innato utiliza los nutrientes. Llegó al laboratorio de Verdin porque fue uno de los primeros en demostrar que los cambios endógenos en los metabolitos pueden afectar la función de los genes, y su proyecto en el laboratorio se centra en comprender cómo los metabolitos impactan en el sistema inmunológico innato durante el envejecimiento. Anthony creció en Los Ángeles y obtuvo su licenciatura en bioquímica de UCLA. Después de graduarse en Harvard, se alegra de estar de regreso en la costa oeste. ¡Es nuevo en San Francisco y disfruta explorando la ciudad, visitando cervecerías y animando a los Dodgers cuando están en la ciudad!

Andrew creció en Long Beach, California, y obtuvo su licenciatura en biología celular molecular de la Universidad Estatal de California en Long Beach. En su laboratorio de pregrado, investigó aspectos estructurales de la proteína asociada a vesículas que interactúa con Gα, una proteína de señalización que desempeña un papel en la regulación de la migración celular y la promoción de la supervivencia celular. Anthony se unió al laboratorio de Verdin en mayo de 2018. Está interesado en los factores que regulan el tamaño y la longevidad del nucleolo. Fuera del laboratorio, le gusta leer, comer en nuevos restaurantes y aprender nuevas canciones con el ukelele.

Alessia obtuvo su doctorado en bioquímica en la Universidad de Génova en Italia, donde estudió el papel de Sirtuin 6 en el cáncer ductal pancreático y las generaciones extracelulares de precursores NAD + por ectoenzimas en diferentes líneas celulares cancerosas. En 2013, se trasladó a la Facultad de Medicina de la Universidad de Washington en San Luis, donde trabajó en la caracterización de un novedoso transportador de mononucleótidos de nicotinamida (NMN). En noviembre de 2019, Alessia se unió al laboratorio del Dr. Verdin para centrarse en los mecanismos celulares y moleculares del envejecimiento. Fuera del laboratorio, Alessia disfruta viajar y comprar en los mercados de pulgas.

El Dr. Kasler realizó su trabajo de licenciatura en biología en la Universidad de Duke y obtuvo su doctorado en inmunología de la Universidad de California, Berkeley, trabajando en la regulación de la muerte celular en el desarrollo de células T en el laboratorio del Dr. Astar Winoto. Desde que se incorporó al laboratorio de Verdin, su principal área de enfoque ha sido dilucidar la inmunobiología de la histona desacetilasa 7 (HDAC7), un regulador epigenético con un papel esencial en el mantenimiento de la auto-tolerancia inmune. Con otros miembros del grupo de inmunología, está trabajando para definir los mecanismos moleculares mediante los cuales la exportación nuclear dependiente de TCR de HDAC7 media tanto en la selección tímica negativa como en la diferenciación de poblaciones de células T de tipo innato seleccionadas por agonistas. Al comprender el importante papel de HDAC7 en el desarrollo de células T, espera obtener nuevos conocimientos sobre la regulación de la auto-tolerancia inmune y también identificar nuevas vías moleculares que pueden ser dirigidas en enfermedades autoinmunes. Cuando no está empujando hacia atrás la frontera del conocimiento humano un minipreparación a la vez, le gusta cocinar comida fabulosa para sus amigos y familiares, caminar por los muchos paisajes espléndidos que rodean el Área de la Bahía y jugar a ser un granjero suburbano.

El Dr. Kim es originario de Corea del Sur. Después de obtener una licenciatura y una maestría en la Universidad de Sogang, se mudó a los Estados Unidos para realizar un doctorado en el campo de la microbiología celular. En la Universidad de Illinois en Urbana-Champaign, trabajó en el laboratorio del Dr. Steven Blanke para estudiar la infección humana con Helicobacter pylori, que descubrió que manipula el metabolismo del huésped, lo que resulta en un cambio metabólico global de un estado biosintético a un estado catabólico. A medida que envejecía, su profundo interés en el metabolismo humano se extendió hasta la biología del envejecimiento y finalmente lo llevó al Instituto Buck. Desde que se unió al laboratorio de Verdin en febrero de 2019, se esfuerza por comprender cómo los niveles de NAD +, un metabolito central involucrado en la producción de energía y la vida útil, se regulan sistémicamente, utilizando modelos in vitro e in vivo. Fuera del laboratorio, se le puede encontrar explorando la hermosa naturaleza del norte de California o mimando a sus mascotas erizo.

El Dr. Ashok Kumaar se graduó como Topper con Maestría en Bioquímica y Biotecnología de la Universidad de Annamalai, India. Obtuvo una beca de investigación nacional competitiva de 5 años para obtener su doctorado en la Universidad de Anna, India. Su investigación se centró en el desarrollo de métodos analíticos y la ingeniería de cepas de levadura para la producción de proteínas y enzimas terapéuticas. Antes de unirse a Buck, trabajó como investigadora en la Universidad Estatal de Washington desarrollando métodos de espectrometría de masas para cuantificar fármacos de moléculas pequeñas y estudiando las interacciones entre la reparación del ADN y las proteínas acompañantes. Su interés en los enfoques de espectrometría de masas para estudiar los cambios metabolómicos y proteómicos durante el envejecimiento la llevó al Buck en 2020.

El Dr. Yong-ho se unió al Buck en febrero de 2020, luego de completar su doctorado en medicina interna en la Universidad de Yonsei, Corea del Sur en 2014. De 2015 a 2019, trabajó como profesor asistente en el departamento de endocrinología en el Hospital Severance, Yonsei. Facultad de Medicina de la Universidad. Ha estudiado sobre autofagia e inflamasomas para dilucidar el mecanismo de la esteatohepatitis no alcohólica. Su investigación actual se centra en comprender los roles de la inflamación y el metabolismo en el envejecimiento y las enfermedades relacionadas con el envejecimiento.

Anne creció en Frederick, Maryland y se mudó a California en 2016 para asistir a Saint Mary’s College of CA. Se graduó con una licenciatura en bioquímica en la primavera de 2020. Después de graduarse, Anne se unió al laboratorio de Verdin como estudiante de maestría en la Universidad Dominicana. Su investigación se centra en el desarrollo de un nuevo modelo de ratón para el envejecimiento acelerado basado en mitocondrias disfuncionales.

El Dr. Matsui se incorporó al laboratorio de Verdin en julio de 2020. Durante su doctorado, realizó un análisis de transcriptoma de células infectadas de forma latente con VIH-1 en el Departamento de Hematología y Oncología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Kyoto en Japón. Continuará estudiando el mecanismo molecular que establece y mantiene la latencia del VIH. Además, está interesado en la relación entre la infección por VIH y el fenotipo de envejecimiento acelerado de los pacientes infectados por el VIH. Fuera del laboratorio, le gusta conducir su automóvil y jugar con sus hijos.

Jazmin recibió su licenciatura en Biología Molecular de la Universidad Estatal de Sonoma en 2018. Durante su tiempo allí, estudió la importancia de la supervivencia de las células B en el linfoma no Hodgkin. Ella usó EMSA para estudiar las interacciones del factor de activación de células B (BAFF) y sus relaciones exclusivas con la maduración y supervivencia de las células B. En el laboratorio de Verdin, su trabajo se centra en medir la esperanza de vida replicativa de Saccharomyces Cerevisiae mediante micro disección.

La Dra. Panda se unió al Buck en febrero de 2018, después de su doctorado en química y biología química de la Universidad de Cornell, Ithaca, Nueva York. Después de haber crecido en la calurosa y húmeda Kolkata, India, y haber realizado sus estudios de posgrado en el norte del estado de Nueva York, donde había nieve durante 8 meses del año, ¡tiene sentimientos encontrados sobre el clima del Área de la Bahía! La Dra. Panda está interesada en aplicar sus habilidades de química analítica para estudiar la regulación de las acilaciones postraduccionales de proteínas por metabolitos endógenos y sus funciones de señalización. En su tiempo libre, le gusta probar nuevas recetas de tarta de queso, jugar con perros y gatos y hablar de trivia de Harry Potter y la Tierra Media con quien quiera escuchar.

La Dra. Perrone se unió al laboratorio de Verdin en enero de 2017. Obtuvo su doctorado en biomedicina en la Universidad de Padua en Italia, estudiando dianas terapéuticas innovadoras a nivel proviral del VIH.En el laboratorio de Verdin, su interés original por la biología del VIH se encuentra con su nuevo y apasionante interés por el envejecimiento. Ella está trabajando para investigar y dilucidar los mecanismos que vinculan la infección por VIH y el envejecimiento, ya que cada vez hay más evidencia que respalda el envejecimiento acelerado de los pacientes VIH positivos. La ciencia no es su única gran pasión. A Rosalba le encanta expresarse a través de las artes creativas, principalmente con la danza del vientre. También ama todo lo que proviene de su país de origen, Italia, especialmente la buena comida y la música. Su primer objetivo en la vida es ser siempre apasionada, curiosa y feliz. Su lema es: "¡Decídete a ser el sol!"

El Dr. Leandro se incorporó al Laboratorio Verdin en febrero de 2021. Obtuvo su doctorado en fisiología y farmacología en la Universidad Federal de Minas Gerais (UFMG) en Brasil, estudiando los efectos de los péptidos potenciadores de bradicinina en el modelo de isquemia de las patas traseras en animales diabéticos. Además, trabajó en la Universidad de Duke y la Universidad de California en San Francisco (UCSF) estudiando los mecanismos y posibles tratamientos para las enfermedades cerebrovasculares en el cerebro. A Leandro le encantan los deportes en general, pero el fútbol, ​​en particular, es su pasión. La música y la filosofía también forman parte de sus pasatiempos.

Daria recibió su licenciatura en bioquímica de la Universidad de Arizona. Su tesis se centró en G-Quadruplex, una estructura secundaria natural en el ADN. Después de graduarse, trabajó como técnica de laboratorio en el Hospital General de Massachusetts, utilizando muestras de pacientes para estudiar posibles tratamientos contra el cáncer de pulmón. En su tiempo libre le gusta hacer snowboard, escalar y pintar.

El Dr. Tiwari completó su maestría en biotecnología en la Universidad Madurai Kamraj y obtuvo su doctorado en inmunología del Instituto Nacional de Inmunología, Nueva Delhi, India en 2014, donde trabajó en la influencia del transporte vesicular alterado en la respuesta de las células B beige. Desde entonces, ha trabajado en múltiples proyectos que involucran universidades e industrias ayudándolas a educar, diseñar y analizar datos experimentales que involucran citometría de flujo multicolor. Se unió al laboratorio de Verdin en septiembre de 2019 y su trabajo incluye brindar apoyo a una amplia gama de proyectos en la biología del envejecimiento, tanto clasificando células como ayudando con inmunofenotipificación y otros tipos de análisis que involucran citometría de flujo, así como trabajando en el papel de modificaciones de cromatina, en particular acetilación de histonas, en el envejecimiento inmunológico y las enfermedades autoinmunes. En su tiempo libre le gusta ir de excursión o andar en bicicleta con sus compañeros de trabajo.

El Dr. Walter creció en el sur de Francia y recibió una maestría de la Ecole Polytechnique de París. Su trabajo de doctorado en el Institut Curie de París se centró en la regulación de elementos transponibles durante el desarrollo embrionario. Marius se unió al laboratorio de Verdin en septiembre de 2016 y ha estado trabajando en el uso de pantallas genéticas CRISPR para descubrir nuevos mecanismos que regulan el establecimiento de la latencia del VIH. También está desarrollando nuevas estrategias terapéuticas contra los virus del herpes y se ha interesado particularmente en el citomegalovirus. Cuando no está en el laboratorio, se puede encontrar a Marius escalando, esquiando, montando bicicleta o viajando con mochila en varias partes de California. Su dieta consiste casi exclusivamente en aguacate, Pringles y clementinas.

El Dr. Zhang creció en Tongling, China, y se unió al laboratorio de Verdin en septiembre de 2017. Tiene una licenciatura en medicina clínica y un doctorado en bioquímica y biología molecular de la Academia China de Ciencias Médicas y el Peking Union Medical College. Actualmente está interesado en la regulación epigenética del metabolismo y el envejecimiento. A Ran le gusta ir de excursión y cocinar.

La Dra. Zhang se unió al laboratorio de Verdin en febrero de 2020. Obtuvo su doctorado en bioquímica y biología molecular en el Instituto de Biofísica de la Academia China de Ciencias, donde estudió los detalles de la interacción entre Ero1a y PDI, que son dos ER- localizaron proteínas responsables del plegamiento de proteínas oxidativas, e investigaron la supresión del cáncer de cuello uterino dirigiéndose a la interacción Ero1a-PDI. También estudió la función y el mecanismo de la S-nitrosalización, una modificación postraduccional de Ero1a. En su tiempo libre le gusta viajar y leer.


Análisis y modelado de la discriminación del ligando TLR y control de las respuestas inflamatorias de los macrófagos

Un segundo enfoque principal del LBS es parte de los estudios integrados del LBS que involucran respuestas de macrófagos a ligandos TLR. Sobre la base del éxito pasado en el modelado computacional de la señalización del receptor de células T, el LBS ha realizado análisis detallados de células individuales de la señalización de macrófagos y la producción de mediadores inflamatorios en respuesta a ligandos TLR únicos y combinados. Estos estudios han revelado que los macrófagos muestran una combinación de respuestas analógicas en términos de activación de NF-κB pero respuestas digitales para las vías MAPK. Las distintas formas de estas dosis-respuesta proporcionan un sistema de señalización que permite el cebado de los loci de genes inflamatorios sin la producción de los productos proteicos de estos genes a niveles bajos de participación de TLR típicos del estado estacionario en un huésped no infectado, pero respuestas robustas si el El umbral digital para las respuestas de ERK se supera a medida que se replica un patógeno. El modelado matemático junto con la Sección de Biología Computacional de LSB utilizando el software Simmune sugiere un papel clave para las fosfatasas en el control de esta red de señalización, y estas enzimas se han relacionado en estudios de GWAS con diversas enfermedades inflamatorias, lo que sugiere que la desregulación de la sensibilidad de la red en términos del punto de cambio para la producción de mediadores, podría ser un factor contribuyente clave en estas enfermedades. Los estudios en curso están explorando esta posibilidad utilizando muestras humanas genotipadas. Se están realizando más trabajos sobre inmunología humana en conjunto con el Centro Trans-NIH de Inmunología, Inflamación y Autoinmunidad Humanas (CHI).

El Dr. Germain recibió su Sc.B. y Sc.M. de la Universidad de Brown en 1970 y su M.D. y Ph.D. de la Escuela de Medicina de Harvard y la Universidad de Harvard en 1976. De 1976 a 1982, se desempeñó como instructor, profesor asistente y profesor asociado de patología en la Escuela de Medicina de Harvard. De 1982 a 1987, trabajó como investigador principal en el Laboratorio de Inmunología (LI). En 1987, fue nombrado jefe de la Sección de Biología de Linfocitos. En 1994, el Dr. Germain fue nombrado subdirector de LI. En 2006, se convirtió en director del Programa NIAID en Inmunología de Sistemas y Modelado de Enfermedades Infecciosas, que se convirtió en el Laboratorio de Biología de Sistemas en 2011 y para el cual se desempeña como jefe de laboratorio. También es jefe interino de LI y director asociado del Centro Trans-NIH de Inmunología Humana, Inflamación y Autoinmunidad (CHI). Desde que recibió su doctorado, ha dirigido un laboratorio que investiga la inmunobiología básica. Él y sus colegas han hecho contribuciones clave a nuestra comprensión de las relaciones estructura-función de la molécula del MHC de clase II, la biología celular del procesamiento de antígenos y la base molecular del reconocimiento de células T.

Más recientemente, su laboratorio ha explorado la relación entre la organización del tejido inmunológico y el control de la inmunidad estudiado utilizando dinámicas y estáticas. en el lugar métodos microscópicos que su laboratorio ayudó a desarrollar. Su grupo también lleva a cabo investigaciones en el modelado cuantitativo de circuitos de señalización inmunológica y en la aplicación más amplia de los métodos de biología de sistemas a cuestiones inmunológicas. Ha publicado más de 300 artículos de investigación académica y reseñas y es miembro de los consejos editoriales de muchas revistas científicas.

Entre sus numerosos honores, fue elegido miembro asociado (extranjero) de EMBO (2008), elegido miembro de la Academia Nacional de Medicina (2013) y de la Academia Nacional de Ciencias (2016), recibió el Premio a la Carrera Meritoria de la American Association of Immunologists (2015), fue elegido como mentor destacado del NIAID en 2016 y ha sido designado investigador distinguido de los NIH. Ha capacitado a más de 70 becarios postdoctorales, muchos de los cuales ocupan puestos académicos y administrativos de alto nivel en las principales universidades y escuelas de medicina.


El nuevo estándar para Biomarcadores funcionales unicelulares

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Habilidad sin precedentes

IsoLight es la única tecnología capaz de detectar subconjuntos funcionales unicelulares altamente potentes y medir la verdadera secreción de citocinas de cada célula. Nuestro propietario y patentado "Código de barras proteómico"IsoCode Chip, nombrada la innovación número uno de los científicos, detecta más de 30 citocinas por célula. Puede ejecutar más de 1000 celdas en un solo chip, lo que le brinda la capacidad sin precedentes de Revelar las diferencias funcionales del fenotipo de cada célula inmunitaria..

Completamente automatizado

Cargue hasta 8 chips IsoCode en el sistema IsoLight para un flujo de trabajo de extremo a extremo completamente automatizado y sin intervención. Todos los pasos de lavado y análisis celular asociados con las plataformas ELISA están automatizados, minimizando el riesgo de error humano. Con fluidos avanzados e imágenes de precisión, las células individuales vivas se detectan automáticamente dentro de una incubadora a bordo, lo que le ayuda obtenga respuestas en días, no en semanas.

Perspectivas prácticas

La intuitiva interfaz de usuario de botón pulsador del software IsoSpeak permite a los investigadores visualizar, identificar y utilizar automáticamente datos de perfiles de citocinas funcionales y directos de células individuales. Dé sentido a los datos complejos de una sola celda con visualizaciones significativas generadas automáticamente para usted. Conecte los puntos y obtenga respuestas más rápido, con información y estadísticas detalladas sobre la potencia y durabilidad celular, todo al alcance de su mano.

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Cómo funciona nuestra biología única

Nuestra biología funcional puede detectar con precisión qué secretan células T individuales por primera vez, en lugar de estimaciones. Estos subconjuntos celulares únicos se representan como las células azules altamente polifuncionales (células que secretan dos o más citocinas) en la parte superior derecha del gráfico.

Las muestras con múltiples subconjuntos de estas células tienen una alta fuerza polifuncional, que se ha correlacionado con el resultado.

Panel inmunitario adaptable de una sola célula de 32 plex

La capacidad de capturar el rango de citocinas relevantes de cada célula inmunitaria representa una capacidad única de multiplexación de proteínas secretadas. El mecanismo de los efectos clínicos y de la citotoxicidad puede estar fuertemente mediado por citocinas (proteínas funcionales a través de las cuales las células inmunes envían y reciben señales).

Estratificar la respuesta del donante / paciente por firma de citocina celular

El análisis de componentes principales de topología de activación polifuncional (PAT-PCA) es un mapa de alta dimensión que muestra qué células secretan múltiples citocinas por célula y las agrupa en los grupos funcionales correspondientes.

Los subgrupos dominantes aparecerán en los gráficos PAT-PCA, que representan subconjuntos multifuncionales significativos que impulsan la respuesta general.

Las muestras con una respuesta más alta dominan el gráfico. Las diferencias entre donantes se destacan a través de la ubicación de sus subconjuntos polifuncionales en el gráfico.

Correlaciones grupales de bioprocesamiento por células polifuncionales potentes

Un mapa de calor polifuncional es una visualización que compara la frecuencia a la que la muestra secreta varios grupos funcionales y polifuncionales. Utilice mapas de calor de heterogeneidad para descubrir las subpoblaciones de células críticas que existen solo en la condición / grupo de interés.

Descubra las diferencias de potencia de los productos celulares con firmas de citocinas PSI

El índice de fuerza polifuncional unicelular (PSI) agrega todas las secreciones multidimensionales unicelulares de una muestra en un solo índice. La lectura combina la polifuncionalidad de una muestra (frecuencia de células que secretan múltiples citocinas) con las intensidades de señal para cada una de las células a través de las citocinas secretadas de la muestra. El índice mostrado está codificado por colores para mostrar la contribución de diferentes categorías de citocinas (por ejemplo, citocinas efectoras frente a citocinas estimulantes).

La PSI es la métrica más novedosa y reveladora para medir la potencia de diferentes tipos de células inmunitarias, lo que ayuda a los principales investigadores a acelerar sus programas de inmunoterapia desde el descubrimiento hasta la predicción de la respuesta.


20: Análisis de laboratorio de la respuesta inmune - Biología

Anisha Datta

La inmunoterapia se ha mostrado muy prometedora como terapéutica contra el cáncer; sin embargo, su eficacia se limita a un subconjunto de pacientes, lo que requiere un estudio más detallado de los mecanismos en juego. Un mecanismo de particular interés es el reclutamiento e infiltración de células T en el tumor, ya que los estudios han demostrado que los tumores que han sido infiltrados por estas células inmunitarias adaptativas responden positivamente a las inmunoterapias en comparación con los tumores que no tienen infiltración de células T. Dado que existe una interrelación entre las células inmunes innatas y las células inmunitarias adaptativas, en el sentido de que las primeras ayudan a cebar y activar a las últimas, ha habido un gran interés en los factores que contribuyen y determinan si las células inmunitarias innatas llevan a cabo esta función vital. Mi proyecto se centra en una familia de receptores de tirosina quinasas conocidos como receptores TAM, y estoy estudiando específicamente Axl. Los estudios han demostrado que dirigirse a Axl y bloquearlo para que no lleve a cabo sus funciones produce un estado inmunoestimulador en las células inmunitarias innatas y disminuye la agresión y la invasión en las células cancerosas. Por lo tanto, es probable que las terapias anti-Axl puedan tener sinergia con las inmunoterapias. Mi trabajo tiene como objetivo comprender cómo el tratamiento anti-Axl altera el panorama inmunológico tumoral, lo que permite una mejor comprensión de las inmunoterapias con las que se sinergizaría y de qué pacientes se beneficiarían más de tal combinación.

Christine Davis

Mi interés de investigación es el uso de métodos de generación de datos de alto rendimiento, grandes conjuntos de datos y modelos computacionales para investigar el impacto, la progresión y los biomarcadores de enfermedades infecciosas. Estoy particularmente interesado en la variación intrínseca en la respuesta inmune dentro de las poblaciones, además de las diferencias entre la gravedad de la enfermedad. Actualmente, estoy investigando la respuesta inmune y los mecanismos de protección para la tuberculosis.

Maddie Dery

Los anticuerpos IgA juegan un papel multifacético en el sistema inmunológico. En presencia de patógenos, se forman complejos inmunes IgA que pueden desencadenar una respuesta inflamatoria. Esta respuesta es deseable en el tratamiento de enfermedades infecciosas y cáncer, pero también se ha relacionado con muchas enfermedades autoinmunes cuando se vuelve hiperactiva, potencialmente debido al reclutamiento excesivo de neutrófilos. Mi investigación tiene como objetivo comprender mejor qué factores controlan la naturaleza de la respuesta inmune IgA utilizando ensayos de alto rendimiento para medir las funciones efectoras mediadas por neutrófilos con el objetivo de informar el desarrollo de terapias para enfermedades autoinmunes y cáncer.

Me interesa comprender la heterogeneidad de la respuesta de diferentes tipos de células y diferentes pacientes a las enfermedades inflamatorias e infecciosas. Actualmente, estoy analizando cómo las diferentes mutaciones impactan el entorno inmunológico en el cáncer colorrectal mediante la secuenciación de ARN unicelular. En el futuro, también estudiaré los correlatos de la protección en la tuberculosis mediante el uso de un enfoque multiómico y el desarrollo de modelos computacionales.

Análisis de biología de sistemas de los mecanismos inmunitarios en enfermedades neurodegenerativas

Si bien la patología amiloide y tau son características definitorias de la enfermedad de Alzheimer (EA), no se correlacionan sólidamente con la gravedad de la enfermedad. No obstante, la desregulación de amiloide y tau son características clave en la mayoría de los modelos de ratones con EA utilizados para la evaluación preclínica de terapias. Para abordar esta limitación, estoy aplicando un marco computacional desarrollado en el laboratorio para la traducción entre especies de relaciones moleculares / fenotípicas, adoptando un enfoque basado en el consenso en diversos modelos de ratón que recapitulan diferentes aspectos bioquímicos y celulares de la EA humana. Específicamente, este proyecto tiene como objetivo identificar las características de las firmas transcriptómicas del modelo de ratón con EA que predicen los resultados de enfermedades humanas a través de una regresión de componentes principales. La identificación de firmas traducibles podría proporcionar un marco para la selección racional de múltiples modelos de ratón para pruebas preclínicas.

Además, estoy siguiendo un subconjunto de firmas traducibles identificadas computacionalmente relacionadas con la vía de señalización del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y la respuesta de angiogénesis. Estoy usando un marco de modelado mecanicista combinado con experimentos cuantitativos para comprender los cambios subcelulares relacionados con firmas traducibles predichas con un enfoque inicial en la señalización y la interrupción del tráfico en las neuronas.

Krista Pullen

Las vacunas son una de las intervenciones médicas más rentables para combatir las enfermedades infecciosas. Dicho esto, aún no se han desarrollado vacunas eficaces para algunas de las enfermedades más mortales, como el VIH / SIDA, la malaria y la influenza. Actualmente, el desarrollo de vacunas está limitado por nuestro conocimiento de los correlatos de la inmunidad contra la infección. Estoy interesado en utilizar técnicas de aprendizaje automático para revelar funciones efectoras de anticuerpos y células inmunes que predicen la protección contra enfermedades. Esta información puede conducir a una mejor comprensión de los mecanismos de la enfermedad y permitirnos diseñar de manera racional vacunas más efectivas.

Lauren Stopfer

Las mutaciones en la vía RAS-RAF-MEK-ERK (MAPK) ocurren comúnmente en pacientes con melanoma, y ​​las mutaciones NRAS y BRAF ocurren en

20% y 40% de los pacientes respectivamente. Como resultado, gran parte del enfoque terapéutico se ha centrado en los inhibidores de MAPK, aunque a menudo surge resistencia. Para investigar estos mecanismos de resistencia, nuestro objetivo es combinar la espectrometría de masas fosfoproteómica y los enfoques de modelado computacional para investigar la relación entre la señalización celular y el desprendimiento de tirosina quinasa del receptor en respuesta a los inhibidores de MEK tanto en líneas celulares mutantes RAS como en modelos PDX. Examinaremos la dinámica temporal de esta interacción en la segunda escala para comprender la respuesta celular inmediata, junto con una escala de tiempo más larga de días a semanas para cuantificar la respuesta adaptativa. Una mejor comprensión de la respuesta a los inhibidores de MEK puede informar nuevas combinaciones de fármacos para el tratamiento de melanomas mutantes RAS.

Estoy muy interesado en aplicar técnicas de aprendizaje automático junto con métodos experimentales más tradicionales para obtener información sobre los problemas arraigados en la biología y la medicina. En particular, actualmente estoy interesado en estudiar las redes altamente complejas de interacciones que involucran a las células inmunes en un contexto patológico, para desarrollar una comprensión más profunda de los mecanismos por los cuales el sistema inmunológico controla y evoluciona los correlatos de protección contra enfermedades. Los nuevos conocimientos descubiertos por este proceso podrían guiar el desarrollo de terapias dirigidas contra la amenaza de larga data que representan enfermedades como la tuberculosis y el VIH / SIDA. Por el momento, estos esfuerzos enfrentan desafíos en la forma de la escala de las redes involucradas y la frecuente falta de traducibilidad directa de los conocimientos descubiertos en modelos animales al contexto humano.En un futuro cercano, espero aprovechar el aprendizaje automático para encontrar y predecir relaciones en el interactoma que podrían no ser inmediatamente obvias, intuitivas o fácilmente evaluables, y al hacerlo, construir hipótesis que luego puedan probarse experimentalmente, identificar características animales que son predictivo de los resultados de enfermedades humanas, y desarrollar una comprensión más profunda de los componentes a nivel de sistemas que sustentan la progresión hacia dichos resultados.

Tomer Zohar

Me interesa cómo evolucionan los sistemas inmunológicos durante las respuestas a las enfermedades y otras perturbaciones, y qué determina las diferencias en los resultados. Específicamente, investigo las discrepancias en la inmunidad innata y la función de los anticuerpos entre diferentes cohortes de pacientes / poblaciones en diferentes puntos de tiempo utilizando una miríada de ensayos de alto nivel y análisis computacionales.

Lauren Baugh (Asociado postdoctoral)

La endometriosis es la presencia de endometrio fuera del útero. Se ha estimado que esta enfermedad dolorosa y debilitante afecta a alrededor del 10% de todas las mujeres, pero ha sido poco estudiada. En el contexto de un hidrogel 3D, sistema de modelo de enfermedad desarrollado en colaboración con el laboratorio de Linda Griffith, podemos estudiar las respuestas de las células primarias de los pacientes con y sin endometriosis. Mediante la recopilación de datos tanto proteómicos como transcriptómicos, podemos estudiar tanto la interacción de célula a célula como las interacciones de célula a matriz extracelular. Con estos enfoques, nuestro objetivo es desarrollar un mejor sentido de los mecanismos de la enfermedad de la endometriosis y buscar nuevos enfoques de diagnóstico.

Brian Joughin (científico investigador del Instituto Koch)

Interpretación mecanicista de datos fosfoproteómicos.

Estoy interesado en formas de utilizar información de acceso público para ayudar en la interpretación mecanicista de datos fosfoproteómicos (por ejemplo, especificación de masas). De manera más general, estoy disponible para colaborar con investigadores del Programa de Biología Integrativa del Cáncer del MIT que deseen ayuda para convertir sus datos en modelos.

Avlant Nilsson (Asociado postdoctoral)

El propósito de mi investigación es permitir terapias contra enfermedades diseñadas por computadora. Actualmente, el desarrollo de fármacos se ve desafiado por la complejidad de la señalización intracelular. Esto podría superarse mediante modelos informáticos que predicen las respuestas celulares; sin embargo, los modelos actuales tienen un alcance, generalizabilidad y facilidad de parametrización limitados. Estoy desarrollando un método, basado en redes neuronales artificiales, para modelar la integración de señales celulares a nivel mecanicista. El modelo integra datos de células que se estimulan con muchas combinaciones de ligandos. Estoy particularmente interesado en usarlo para comprender mejor el papel de los macrófagos en el cáncer y la tuberculosis.

Chuangqi Wang (Asociado postdoctoral)

Análisis de correlación entre tasa de supervivencia y genómica de patógenos en enfermedades infecciosas.

Estoy interesado en desarrollar métodos computacionales y estadísticos para revelar mecanismos ocultos en muestras heterogéneas de pacientes utilizando genética, genómica e imágenes. Mi investigación actual se basa en la aplicación de métodos de aprendizaje automático en las secuencias del genoma de patógenos y la transcriptómica unicelular para identificar las características patogénicas que podrían predecir mejor el estado de supervivencia de las personas con enfermedades infecciosas (como tuberculosis, VIH y Ébola).


Ver el vídeo: UNIDAD 20: 1. Sistema Inmune. Clasificación y respuesta inflamatoria. TECNICATURAS (Agosto 2022).