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Interacciones de apilamiento de bases versus enlaces de hidrógeno

Interacciones de apilamiento de bases versus enlaces de hidrógeno



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¿Es correcto que el cambio hipercrómico en el ADN sea el resultado de la ruptura de los enlaces de hidrógeno de emparejamiento de bases, pero la desnaturalización real del dsDNA tiene más que ver con las interacciones de apilamiento de bases? ¿Por qué la separación de las hebras tiene algún efecto sobre el apilamiento de las bases? ¿Por qué las bases en ssDNA todavía no experimentarían interacciones de apilamiento?

Realmente agradezco cualquier ayuda con esto. ¡Gracias!


Para una referencia directa sobre la contribución de estas dos fuerzas, consulte aquí.

Si ayuda, piense en la doble hélice del dsDNA como una estructura más rígida que el ssDNA, que se desploma y generalmente es capaz de mucha libertad estérica que el dsDNA no tiene. Esta libertad significa que las bases de la columna vertebral del ssDNA pueden no estar siempre en la orientación correcta para apilarse, porque las dos hebras de la hélice no están forzando las bases juntas en esa orientación. "Por lo general, se considera que la doble hélice de ADN es una estructura relativamente rígida. Ciertamente, es mucho más rígida que las hebras simples que la componen". (vea la revisión para una discusión mucho más detallada de este tema)

Es cierto que el apilamiento de bases todavía ocurre en ssDNA, simplemente no se aplica de la misma manera. También parece ser algo específico de secuencia, y ocurre más en polipurinas que en polipirimidinas, posiblemente porque las purinas son moléculas más voluminosas con más impedimento estérico.

Para una conversación relacionada, vea aquí.


Sobre la caracterización de las interacciones entre proteínas y estructuras de guanina cuádruplex de ácidos nucleicos

Los cuádruplex de guanina (G4) son estructuras secundarias de ácidos nucleicos de cuatro hebras que se estabilizan mediante sistemas de enlaces de hidrógeno no canónicos entre las bases nitrogenadas, así como mediante interacciones extensivas de apilamiento de bases, o pi-pi. La formación de estas estructuras en el ADN genómico o en el ARN celular tiene el potencial de afectar la biología celular en muchas facetas, incluido el mantenimiento de los telómeros, la transcripción, el empalme alternativo y la traducción. En consecuencia, los G4 se han convertido en dianas terapéuticas y se han desarrollado varios compuestos de moléculas pequeñas que pueden unirse a tales estructuras, aunque se sabe poco acerca de cómo los G4 interactúan con sus compañeros de unión a proteínas nativas. Esta revisión se centra en el reconocimiento de G4 por proteínas y péptidos pequeños, comparando los modos de reconocimiento que se han observado hasta ahora. Se hará hincapié en la información que se ha obtenido a través de estructuras de RMN y cristalográficas de alta resolución de complejos G4 / péptido, así como investigaciones bioquímicas de especificidad de unión. Al comprender las características moleculares que conducen a la especificidad de la unión de G4 por proteínas nativas, estaremos mejor equipados para apuntar a interacciones proteína / G4 con fines terapéuticos.

1. Introducción

Los polímeros de ácidos nucleicos ricos en guaninas tienen el potencial de formar una estructura de cuatro hebras llamada guanina cuádruple (G4). Cuando cuatro guaninas están dispuestas en un plano, se estabilizan mediante enlaces de hidrógeno entre las caras Watson-Crick y Hoogsteen de guaninas adyacentes. Estas tétradas de guanina tienen una superficie extensa para el apilamiento de bases pi-pi con otras tétradas, lo que contribuye en gran medida a la estabilidad termodinámica de la estructura G4. Todas las guaninas G4 comparten esta característica central de las tétradas de guaninas apiladas, que es probablemente una característica común que contribuye al reconocimiento de las G4 por las proteínas. La formación de G4 depende de la presencia de cationes monovalentes que alivian la repulsión de la carga electrostática negativa del O6 de las guaninas concentradas en el centro de la tétrada. La colocación de cationes monovalentes (típicamente sodio o potasio) en el centro del G4, entre dos tétradas apiladas, alivia el efecto repulsivo del potencial electrostático negativo [1, 2].

Los G4 pueden tener una topología muy diferente en función de la orientación relativa del esqueleto del fosfodiéster que conecta los recorridos de las guaninas. Si todas las hebras son paralelas con respecto a la orientación 5 ′ y 3 ′ de los azúcares ribosa, las secciones de bucle entre las corridas de guanina deben conectarse desde la parte superior a la inferior del G4 en lo que se conoce como orientación de hélice (Figura 1 (a)). Los ángulos de enlace glicosídico en G4 paralelos suelen estar todos en el anti conformación, lo que hace que esta sea la orientación de hebra preferida para los ARN G4, ya que se adapta mejor al grupo hidroxilo 2 '. De manera similar, los ácidos nucleicos bloqueados (LNA) que usan enlaces metileno 2′-O, 4′-C para forzar un C3′-endo azúcar fruncido también favorecerá fuertemente a todos anti conformación de enlace glicosídico proporcionado por un G4s paralelo [3]. Por esta razón, se han utilizado LNA cuando se desea forzar una topología G4 paralela. Para hebras antiparalelas, los bucles se denominan laterales si se conectan hebras adyacentes y diagonales si se conectan hebras opuestas, estos crean una mezcla de syn y anti ángulos de enlace glicosídico y son las estructuras que se observan con mayor frecuencia en el ADN G4 [4] (Figura 1 (b)).

Al igual que otras estructuras secundarias de ácidos nucleicos, se pueden observar surcos distintos creados por el esqueleto de azúcar-fosfato en los modelos de llenado de espacio de las estructuras G4 (Figura 1 (c)). Estos surcos, así como la gran superficie de las tétradas en cada extremo del G4 y los propios bucles, representan los tres sitios de interacción factibles para los socios de unión a proteínas. Los bucles laterales y diagonales en antiparalelo G4 dejan las ranuras accesibles pero restringirían el acceso a la cara de la tétrada. Los bucles en forma de hélice, como se ve en el paralelo G4, pasan directamente sobre los surcos, lo que permite interacciones intramoleculares de las bases del bucle con los surcos, oscureciendo así los surcos pero dejando la cara de la tétrada más expuesta para la unión de proteínas o ligandos (Figura 1). Entre la miríada de ligandos de unión a G4 de molécula pequeña que se han sintetizado, se pueden encontrar ejemplos de ranuras de unión de ligandos, secuencias de bucle y caras de tétrada de G4. En algunos casos, se ha demostrado que la unión de estos ligandos estabiliza, desestabiliza e incluso altera la conformación del G4 [5-7]. No sería descabellado plantear la hipótesis de que a medida que aumente nuestro conocimiento de las interacciones proteína-G4, tendremos ejemplos de proteínas que hacen lo mismo.

Los análisis bioinformáticos del genoma humano identificaron algunos

350.000 sitios únicos, supuestos, de formación de G4 (PQS) [8] y métodos de secuenciación de alto rendimiento han identificado otros 450.000 [9]. Curiosamente, parece haber una presión evolutiva contra PQS en las regiones codificantes de proteínas y un enriquecimiento de PQS en otras regiones no codificantes en comparación con las secuencias de ADN generadas pseudoaleatoriamente. Este enriquecimiento de PQS en regiones no codificantes apoya la idea de que los G4 pueden ser elementos reguladores clave. Además, existe un enriquecimiento estadístico de PQS en las regiones promotoras de oncogenes, algunas de las cuales se ha confirmado su existencia in vivo mediante estudios de reticulación específicos de G4 [10] y otras investigaciones bioquímicas [11-14]. También ha quedado claro durante la última década que los G4 desempeñan un papel importante en el mantenimiento de la longitud de los telómeros [15-17] y la biogénesis de los ribosomas [18], que están desregulados en

80% de los cánceres [19]. Además, las repeticiones de expansión de las regiones ricas en guanina en el ARNm se han relacionado con dos formas comunes de trastornos neurológicos, el retraso mental del cromosoma X frágil [20] y la esclerosis lateral amiotrófica familiar (ELA) [21].

Existe cierta controversia sobre si G4 puede formar en vivo y aunque se ha realizado un esfuerzo significativo para probar esta cuestión de forma experimental, la observación de la estructura de los ácidos nucleicos en vivo es una tarea monumental que tiende a sesgar dependiendo del método utilizado para determinar la estructura. Un método que se utiliza para visualizar motivos únicos en las células es la inmunofluorescencia. El grupo Balasubramanian ha desarrollado anticuerpos para apuntar selectivamente tanto al ADN [22, 23] como al ARN G4 [24] y los utilizó con éxito para visualizar estas estructuras. en vivo. Además, se podría razonar que los efectos fisiológicos de las moléculas pequeñas específicas de cuádruplex en las células son evidencia de la formación de cuadrúplex. en vivo. En estos casos, se puede argumentar que el anticuerpo o molécula pequeña está simplemente induciendo la formación de G4 y que las estructuras no existen en ausencia de estas sondas o que la especificidad de los anticuerpos / fármacos ha cambiado en un contexto celular. y que ya no se unen a G4 sino que ejercen un efecto a través de interacciones con otras estructuras. Un estudio reciente que utiliza secuenciación de alto rendimiento y en vivo Las modificaciones químicas han indicado que los ARN G4 se despliegan globalmente en algunas líneas celulares de mamíferos [25]. Se puede hacer una crítica similar de que los químicos agregados para la modificación de ácidos nucleicos podrían estar alterando su estructura. en vivo o que la concentración de reactivo químico añadido da como resultado efectos inespecíficos. Independientemente de poder probar la existencia de G4 en vivo, muchas proteínas tienen dominios de unión específicos de G4 altamente conservados que probablemente no habrían persistido en eucariotas si no tuvieran función biológica. Una forma de probar este propósito es mediante la interrupción de la interacción proteína-G4.

Dirigirse a las interacciones de la proteína G4 con fármacos de molécula pequeña tiene potencial para tratar una multitud de enfermedades [17, 26, 27]. Actualmente existe uno de estos compuestos en ensayos clínicos para el tratamiento del cáncer, es decir, CX-3543 o Quarfloxin. Si bien se seleccionó originalmente por su interacción con MYC G4, se ha demostrado que CX-3543 se localiza en los nucleolos celulares donde inhibe la transcripción de Pol I al bloquear la interacción entre la nucleolina y G4 en el ADNr [18]. Además de ser dianas de terapias de moléculas pequeñas, los propios G4 se han empleado como agentes terapéuticos para dirigirse a proteínas específicas. Un ejemplo de ello son los aptámeros de ADN que se unen a la trombina que inhiben la agregación plaquetaria inducida por la trombina y la trombina unida al coágulo, que tienen potencial para su uso como anticoagulantes durante diversas cirugías y actualmente se encuentran en ensayos clínicos [28]. Aunque la trombina no es por naturaleza una proteína de unión a G4, los aptámeros de G4 muestran una notable afinidad y especificidad por regiones de trombina que normalmente interactúan con otras proteínas.

Para comprender mejor el mecanismo de los procesos celulares mediados por G4 y cómo las moléculas pequeñas interfieren con ellos, es imperativo comprender cómo las proteínas reconocen a sus compañeros de unión endógenos de G4. Si bien se han identificado y validado muchas proteínas de unión a G4 [29], hay relativamente poca información sobre cómo reconocen específicamente las G4. Los enfoques típicos para estudiar esto incluyen alterar algunas de las características del sustrato o de la proteína G4, evaluar posteriormente cómo estas mutaciones afectan la interacción e inferir de esto su papel en el reconocimiento de G4. Este método es relativamente simple y económico de realizar y puede proporcionar información útil; sin embargo, no siempre es trivial mostrar que tales mutaciones están mediando directamente la interacción y no afectando indirectamente la interacción al alterar la conformación de la especie mutada. La dispersión de rayos X de ángulo pequeño es una técnica basada en soluciones que se puede utilizar para determinar modelos de proteínas y ácidos nucleicos de baja resolución. Aunque no proporciona suficiente resolución para distinguir átomos individuales, puede proporcionar información sobre la forma y orientación de las especies en un complejo de ácido nucleico de proteína que puede ser complementario a otros datos obtenidos del análisis de mutaciones y / u otros métodos estructurales de mayor resolución como como cristalografía de rayos X y RMN. Si bien actualmente hay más de 250 estructuras de rayos X y RMN de alta resolución de G4 depositadas en el sitio web del Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB) y en la base de datos de ácidos nucleicos (NDB), comparativamente pocas estructuras de proteínas de alta resolución que interactúan con G4 se han detectado. resuelto. La interacción más estudiada es entre aptámeros de ADN que contienen G4 y trombina, sobre la que se han depositado varias estructuras (PDB: 1HAP, 1HAO, 3QLP, 4DII, 4DIH, 5CMX, 4I7Y, 4LZ1, 4LZ4, 5LUW, 5LUY, 5EW1, y 5EW2). Más recientemente, se ha resuelto la estructura de un péptido de la proteína prión unida por un aptámero de ARN G4 (2RSK, 2RU7). Actualmente, hasta donde sabemos, solo se han resuelto 3 estructuras de alta resolución que muestran interacciones G4-péptido que involucran proteínas que interactúan con G4 como parte de su función celular normal (2LA5, 5DE5 y 2N21). Aquí discutiremos los conocimientos adquiridos a partir de estas estructuras, así como algunos estudios clave de análisis mutacional y analizaremos los beneficios, así como los inconvenientes, de estos enfoques.

2. Unión de trombina por aptámeros de ADN G4

El desarrollo de aptámeros de ADN que se unen a la trombina por sus propiedades anticoagulantes ha estado en curso desde principios de la década de 1990, aunque la trombina no es naturalmente una proteína de unión a G4, el ADN de 15 bases G4 (TBA), desarrollado a través de SELEX, puede unirse estrechamente a la trombina e inhibir la fibrina. formación de coágulos [31, 32]. Esta secuencia de ácido nucleico forma un G4 antiparalelo con dos tétradas de guanina conectadas por tres bucles laterales: una cara del G4 está cubierta por dos bucles TT y la otra por un bucle TTA. Las estructuras iniciales de alta resolución de TBA (1HAP, 1HAO) mostraron que el sitio de unión del fibrinógeno de la trombina (exosito I) probablemente interactuaba con los bucles de TBA; sin embargo, debido a la falta de densidad de electrones en las regiones del bucle, no estaba claro si esta interacción fue con los bucles TT o bucle TTA [33]. 15 años más tarde, se produjeron 3 estructuras (3QLP, 4DII y 4DIH) en el laboratorio de Filomena Sica que definitivamente muestran los bucles TT actuando como una pinza que se unen a ambos lados de la región sobresaliente del exosito I utilizando múltiples contactos polares e hidrofóbicos [34 , 35].

Se han elaborado muchas variantes del aptámero que mejoran la estabilidad, la afinidad y la inhibición de la trombina. Uno de estos potentes aptámeros de trombina de segunda generación es el HD22-27mer [36] para el que se ha resuelto una estructura de rayos X de alta resolución (4IY7) del complejo aptámero-trombina [37] (Figura 2 (a)). HD22-27mer forma una estructura mixta duplex-G4 donde el duplex está directamente encadenado al G4. El HD22-27mer forma una topología pseudo-G4 inusual con cuatro bucles, donde el primer bucle conecta dos guaninas en la misma tétrada y los bucles restantes forman un patrón de bucle antiparalelo lateral más típico. El segundo y cuarto de estos bucles interactúan entre sí a través de enlaces de hidrógeno Watson-Crick A-T y cubren un lado del G4, mientras que el bucle intratetrad y el tercer bucle también forman enlaces de hidrógeno A-T y cubren el lado opuesto del G4. En contraste con la estructura de la trombina y la TBA, el reconocimiento de proteínas del HD22-27mer involucra la región bicatenaria extendida, así como una timina abultada y el núcleo pseudo-G4 y parece involucrar al exosito II y no al exosito I. G20 es el la última guanina antes de la región dúplex y forma tres contactos polares con la arginina 93, dos a través de los grupos hidroxilo ribosa y uno a través de su grupo fosfato. Los bucles 2 y 4 del G4 contribuyen a la estabilidad del complejo al formar múltiples interacciones hidrófobas con la trombina pero, a diferencia de la TBA, solo la timina 9 tiene múltiples contactos polares con el exosito II.

Recientemente, un aptámero de trombina de tercera generación de 31 nucleótidos, RE31, se cristalizó en un complejo con trombina [38] (Figura 2 (b)). Al igual que el HD22-27mer, RE31 tiene una región dúplex extendida, así como un G4 de dos tétradas. A diferencia del HD22-27mer, la región dúplex de RE31 exhibe un apilamiento continuo de bases con el G4 y la región dúplex no parece ser importante para la unión a la trombina. A pesar de la presencia de una unión dúplex G4, la unión de RE31 a la trombina es mucho más similar a la TBA que al HD22-27mer, ambas moléculas usan los bucles TT para interactuar con el exosito I a través de enlaces de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas.

A pesar de la persistencia de un G4 de dos tétradas en estos aptámeros de unión a trombina, no se observan interacciones con el núcleo de G4 en ninguna de las estructuras. En cambio, el sitio principal de interacción, que es común entre todas las estructuras mencionadas anteriormente, es con el segundo y cuarto bucle del G4. Mientras que TBA y RE31 utilizan principalmente contactos polares y algunas interacciones hidrofóbicas auxiliares para interactuar con el exosito I de la trombina, los bucles G4 del HD22-27mer utilizan principalmente interacciones hidrofóbicas para unir el exosito II. Este mecanismo común de unión a diferentes sitios de trombina sugiere que el G4 actúa como un andamio que presenta los bucles monocatenarios al bolsillo de unión de la proteína.

3. Interacción entre el motivo RGG y las estructuras G4

Se sabe que los motivos ricos en arginina y glicina desempeñan funciones funcionales en numerosos procesos fisiológicos, que suelen implicar interacciones de ácidos nucleicos, durante muchas décadas [39]. La glicina es la más flexible de las cadenas laterales de aminoácidos en términos de sus ángulos diedros accesibles, por lo que las secuencias ricas en glicina pueden muestrear una gran variedad de conformaciones, lo que les permite ser socios de unión muy promiscuos. La arginina es un aminoácido cargado positivamente con electrones pi deslocalizados. Esto permite interacciones electrostáticas favorables con la cadena principal de fosfato de los ácidos nucleicos, así como un posible apilamiento de bases con las bases nitrogenadas y enlaces de hidrógeno en hasta tres direcciones diferentes a través de su resto guanidinio. Muchas de las proteínas de unión a G4 actualmente conocidas tienen motivos RGG / RG [29, 39], algunos de los cuales han demostrado ser críticos para la unión y el reconocimiento de G4, incluido el traducido en sarcoma / fusionado en sarcoma (TLS / FUS) [ 40], nucleolina (NCL) [41], proteína del sarcoma de Ewing (EWS) [42], antígeno nuclear 1 EBNA1 del virus de Epstein Barr [43], DDX21 [44] y proteína de retraso mental X frágil (FMRP) [45].

Dado que la característica estructuralmente única más obvia de un G4 es la cara de la tétrada, uno podría esperar que la arginina de los motivos RGG contribuya a las interacciones de apilamiento de bases con las tétradas de guanina terminales. Sin embargo, solo hay evidencia indirecta de que la cara de la tétrada juega un papel en las interacciones mediadas por RGG. Se ha demostrado que muchos ligandos de unión a G4 de moléculas pequeñas interactúan estrechamente con la cara de la tétrada a través de interacciones de apilamiento pi-pi y se ha demostrado que dos de esas moléculas, BRACO-19 y CX-3543, interrumpen las interacciones con proteínas de unión a G4 (EBNA1 ) [43] y NCL [18], que contienen el motivo RGG.Si bien esto implica indirectamente la competencia con la proteína por la cara de la tétrada del G4, estos compuestos también se unen electrostáticamente a los surcos y bucles del G4 [46, 47] posiblemente previniendo las interacciones proteína-surco o reorientando la estructura del bucle para interrumpir la unión de proteínas en tal manera.

3.1. Reconocimiento de la columna vertebral de fosforibosa de los bucles G4 por dominios RGG / RG

Las investigaciones bioquímicas en el laboratorio de Takanori Oyoshi han revelado que los dominios RGG de las proteínas EWS y FUS / TLS son fundamentales para la unión de G4 y lo hacen a través de interacciones con la cadena principal de fosforibosa de las regiones del bucle [48-50]. El dominio RGG3 de la proteína EWS tiene una alta afinidad por el ARN específico y el ADN G4 que depende de las argininas de esta región [42]. Curiosamente, esta unión parece depender de la presencia de bucles de al menos 2 nucleótidos y se observa una mayor afinidad con bucles más largos [50]. Reemplazar las secuencias de bucle con esqueletos abásicos de desoxi-ribosa no afectó esta afinidad, lo que indica que la interacción fue con el esqueleto en sí y no con las bases de nucleótidos. En contraste, tanto la columna vertebral como las bases de los bucles TT en los TBA están involucrados en la unión de la trombina y, por lo tanto, el reemplazo de los residuos del bucle TT de los TBA con un esqueleto básico reduce la afinidad por la trombina, así como la orientación del aptámero en la superficie de la trombina [ 51–53]. Además, un G4 intermolecular con voladizos monocatenarios no demostró la misma afinidad, lo que indica que la estructura del esqueleto en los bucles G4 era importante para el reconocimiento por el dominio RGG3. Si bien la orientación inicial de la hebra de G4 no afectó a la unión, se demostró mediante dicroísmo circular que RGG3 convertía la topología del ADN G4 de antiparalelo a paralelo. Por tanto, parece que la estructura de la cadena principal de fosforribosa en la conformación de bucle de tipo hélice está siendo reconocida específicamente por el dominio RGG3 de EWS [50].

La mutación de los tres residuos de fenilalanina en el dominio RGG de FUS / TLS a tirosina elimina la unión al ADN G4 mientras conserva la afinidad por el ARN G4 [48]. Curiosamente, cuando los bucles de ADN G4 se reemplazaron con un esqueleto de fosforribosa abásico, se restauró la capacidad de unión. Esto indica que el residuo de tirosina reconoce específicamente el grupo hidroxilo 2 'de los azúcares ribosa en la región del bucle y no las tétradas de guanina. El ARN G4 sin bucles o bucles de ácido nucleico bloqueados (que oscurecen el hidroxilo 2 ') anula la unión, de acuerdo con la noción de que el reconocimiento del hidroxilo 2' es importante y descarta posibles diferencias causadas por la orientación de la hebra en el ADN G4. El truncamiento de la proteína para excluir dos residuos de tirosina en el dominio RGG nativo de TLS / FUS suprime la afinidad por el ARN, al tiempo que conserva la afinidad por el ADN, G4 [48]. El truncamiento de la sección que contiene tres fenilalaninas tiene el efecto contrario, manteniendo la afinidad por el ARN, mientras que pierde afinidad por el ADN, G4. Las mutaciones de estos residuos aromáticos en alanina eliminan toda afinidad por G4, lo que sugiere que sus interacciones no solo son importantes para la especificidad del azúcar ribosa, sino también críticas para el reconocimiento de G4 [49].

Estos estudios mutacionales con EWS y FUS / TLS demuestran que los dominios RGG, como en el caso de los aptámeros de unión a trombina, pueden reconocer los bucles de las estructuras G4. Ambos dominios RGG interactúan preferentemente con bucles más largos que contienen G4 en oposición a los que carecen de bucles. Además, los dominios RGG de EWS y FUS / TLS solo necesitan que el esqueleto de fosforibosa esté presente en los bucles para una afinidad total, mientras que la trombina interactúa tanto con el esqueleto como con las bases de los bucles de TBA. Esto indica que la unión de G4 por EWS y FUS / TLS no es específica de secuencia y que la posición de la columna vertebral de los bucles es probablemente clave para el reconocimiento específico por EWS y FUS / TLS.

3.2. Unión de G4 por el péptido RGGGGR de la proteína FMRP

Actualmente, las únicas estructuras de alta resolución de un motivo RGG que se une a G4 son ambas del laboratorio de Dinshaw Patel (2LA5, 5DE5) donde han estudiado la interacción entre el péptido de caja RGG de 26 aminoácidos de FMRP y 36 nucleótidos de la SC1 (factor de transcripción 19) ARN, que forma una estructura mixta de dúplex G4, mediante RMN [54] y cristalografía de rayos X [55] (Figura 3). Se ha demostrado previamente que este péptido corto conserva la especificidad y afinidad por las estructuras G4 y no por otro ARN con el que interactúa la proteína FMRP de longitud completa, lo que indica que es responsable del reconocimiento de G4 por FMRP [56]. Las discrepancias entre las estructuras se atribuyen a regiones flexibles dentro del péptido y bucles del ARN (Figura 3 (a)). La estructura muestra un G4 de orientación de hebra paralela con 3 tétradas de guanina y una tétrada de base mixta inusual (GUAU) antes de la unión dúplex. Si bien no hay interacciones directas con las tétradas de guanina, se ve que Arg15, que se mostró indispensable para la unión, exhibe una interacción de apilamiento catión-pi con A17, que es parte de la tétrada de bases mixtas. Además de esta interacción de apilamiento, se observa Arg15 en un enlace de hidrógeno con la cara Hoogsteen de G7, la primera base en la región bicatenaria (Figura 3 (b)). Arg10, otro residuo indispensable, descansa entre la primera y la segunda base de la región dúplex (C30 y G31) y exhibe una interacción catión-pi con C30 y forma múltiples enlaces de hidrógeno con G31 y la cadena principal de fosforribosa. Se ha demostrado que la mutación de estos dos primeros pares de bases reduce diez veces la afinidad del péptido por SC1 [56]. Las dos argininas que hacen contacto con estas bases actúan como un ancla en la base del G4 estabilizando la unión de ARN de cuatro a dos cadenas, una característica que fue ejemplificada por los experimentos de digestión de RNasa.

Las cuatro glicinas entre Arg10 y Arg15 forman un motivo de giro beta apretado y hacen muchos contactos importantes con el ARN. Gly11 parece ser indispensable (según las mutaciones realizadas en el péptido), ya que coordina los enlaces de hidrógeno desde su esqueleto NH y CO hasta el carbonilo de G4 y el NH2 grupo de C5 en la región dúplex. Gly14 hace el segundo contacto con la región G4 a través de un enlace de hidrógeno desde la amida de su cadena principal hasta el azúcar ribosa de la uridina en la tétrada mixta (Figura 3 (b)).

A diferencia de los aptámeros de unión a trombina y los dominios RGG de EWS y FUS / TLS, las interacciones SC1 RNA-FMRP no involucran las bases del bucle en todas las estructuras de alta resolución y el análisis mutacional muestra que las interacciones importantes son con la región dúplex adyacente a la G4 así como la tétrada de bases mixtas. A partir del modelo de llenado de espacio (Figura 3 (c)) parece que el péptido RGGGGR está ocupando un surco creado por la unión tetraplex a dúplex, por lo que su modo de reconocimiento parece ser una mezcla de llenado de espacio de van der Waals e interacciones específicas de secuencia mediadas por la colocación de argininas en esta cavidad.

4. Reconocimiento G4 de la Tetrad Face por el motivo específico DHX36

La proteína DHX36 es una enzima helicasa que tiene la capacidad de unirse y desenrollar ARN G4 con gran especificidad [57, 58]. Una región de 13 aminoácidos que es exclusiva de DHX36 se conserva evolutivamente entre eucariotas superiores y es necesaria y suficiente para la unión de G4s [59]. La dispersión de rayos X de ángulo pequeño de baja resolución ha demostrado que el motivo de reconocimiento G4 está orientado hacia la cara de la tétrada (Figura 4 (c)) [30, 60] y las mutaciones en la secuencia de bucle de un socio de unión G4 endógeno dieron como resultado una afinidad reducida, lo que indica que la conformación de bucle también puede ser importante para el reconocimiento de G4 por este motivo [61]. Una estructura de RMN de alta resolución del laboratorio de Anh Tuân Phan que muestra un pequeño péptido de 18 aminoácidos unido a un ADN sintético G4 TT (GGGT) x4 (2N21) apoya este modo de unión [62]. Vale la pena señalar que se ha observado un modo similar de unión entre un aptámero de ARN y un péptido de 16 aminoácidos del extremo N de la proteína priónica.

Dado que DHX36 tiene una preferencia significativa por la orientación de bucle paralelo frente a antiparalelo, las secuencias de bucle se limitaron a un único residuo de timina que promueve la formación de especies paralelas. La estructura muestra la disposición de bucle de tipo hélice típica de los G4 paralelos con el péptido formando una región de hélice alfa corta seguida de un giro que cubre toda la cara de la tétrada. Los dos residuos aromáticos (Trp13 y Tyr14) no hacen ningún contacto con el ADN, pero se supone que estabilizan la forma de L del péptido. Cuatro residuos, a saber, Gly9, Gly13, Ile12 y Ala17, se encuentran en la interfase tétrada-péptido lo suficientemente cerca como para permitir interacciones CH-pi (Figura 4 (a)).

Los residuos cargados positivamente Lys8, Arg10 y Lys19 están cada uno lo suficientemente cerca de las ranuras del G4 para formar interacciones electrostáticas que podrían ayudar a estabilizar la interacción observada (Figuras 4 (b) / 4 (d)) sin embargo, estudios previos de mutación han mostró que Lys8 y Arg10 son prescindibles en el contexto de la proteína de longitud completa [59]. El modo de unión observado explica la preferencia de DHX36 por los ARN G4, ya que los ARN G4 forman casi exclusivamente la orientación de la hebra paralela con bucles de tipo hélice, se espera que tengan caras de tétrada expuestas. La unión a una gran superficie hidrófoba expuesta como la cara de la tétrada proporciona un aumento significativo de la entropía a través de la desolvatación y, por lo tanto, es una interacción muy favorable. Los ADN G4 que tienen estructuras de bucle de tipo antiparalelo o híbrido pueden evitar esta penalización por entropía a través de interacciones entre las bases del bucle y la cara de la tétrada que llevan el esqueleto de azúcar-fosfato polar sobre la parte superior del G4 y protegen la cara de la tétrada hidrófoba.

Limitaciones de la cristalografía de rayos X y RMN. La cristalografía de rayos X y RMN son dos técnicas que tienen muchas fortalezas y limitaciones que se complementan y hacen del uso de ambas técnicas el método ideal para investigar estructuras biológicas de interés. Donde la cristalografía de rayos X proporcionará una imagen única de la estructura exacta en la red cristalina, la RMN mostrará muchos modelos de posibles estructuras que se ajustan igualmente bien a los datos. La RMN es una técnica basada en soluciones que puede visualizar la dinámica de las moléculas en una escala de tiempo fisiológica, mientras que la cristalografía de rayos X visualiza, por lo general, la forma más termodinámicamente estable de un sistema. Al analizar las estructuras de rayos X y RMN, es importante recordar que solo proporcionan una instantánea de un proceso dinámico, generalmente en condiciones no fisiológicas. Los conocimientos que se desprenden de estas instantáneas deben probarse con estudios mutacionales que utilicen la información de la estructura para probar su validez.

El principal escollo de la RMN para la biología estructural es la restricción de tamaño de la molécula que se investiga. Especialmente para las proteínas y los ácidos nucleicos, más allá de cierta longitud, hay muchas señales superpuestas de diferentes regiones de la biomolécula que dan como resultado picos amplios e indiscretos, lo que hace que la separación e identificación de qué señal proviene de qué átomo sea un desafío inmenso. Por lo tanto, a menudo, con este método solo se examinan péptidos pequeños. La desventaja de este enfoque es que no puede asegurarse de que el péptido pequeño no se pliegue como lo haría en el contexto de la proteína de longitud completa. Por ejemplo, el péptido de 18 aminoácidos de DHX36 tiene solo el 2% del tamaño de la proteína completa de 1008 aminoácidos. Si bien el péptido demuestra una afinidad significativa por el cuádruplex, la proteína de longitud completa se une mucho más estrechamente [59]. Por lo tanto, cualquier conocimiento estructural obtenido al examinar el péptido es, en el mejor de los casos, solo una parte del cuadro completo. Además, se ha observado a partir de las estructuras del complejo FMRP / Sc1 que el reconocimiento de G4 no es solo del G4 en sí mismo, sino de las regiones de unión y las regiones adyacentes de cadena doble o simple, por lo que también es preferible utilizar un oligonucleótido más grande que imite mejor Especies biológicas de ARN / ADN. El problema de hacerlo así es que tales complejos pueden exceder el límite de tamaño para las determinaciones estructurales por RMN y que tales complejos grandes normalmente son difíciles de cristalizar, requiriendo a menudo condiciones salinas no nativas o anticuerpos estabilizantes. La desventaja de tales enfoques de cristalización es la dificultad de demostrar la confiabilidad de cualquier estructura única obtenida en términos de relevancia fisiológica.

Una de las ventajas de los enfoques de RMN es la capacidad de identificar regiones desordenadas. Incluso sin experimentos de dispersión de relajación, la variabilidad en los modelos obtenidos por RMN puede indicar qué regiones están desordenadas. La cristalografía de rayos X, por otro lado, atrapa las regiones desordenadas en una única conformación estable que puede confundir la interpretación de los datos y causar resultados engañosos. Un ejemplo de esta captura de regiones flexibles está en la estructura de rayos X del dominio FMRP RGG y el ARN Sc1. Los datos de RMN del complejo, que se obtuvieron en primer lugar, tenían regiones de bucle mal definidas, lo que apuntaba a una flexibilidad conformacional. De manera fortuita, se capturaron dos conformaciones de bucle diferentes en una sola unidad asimétrica en la conformación cristalina, lo que respalda la idea de que la región de bucle muestrea múltiples conformaciones. Si hubiera habido solo un complejo en la celda unitaria, habría menos certeza en la dinámica de los nucleótidos de bucle.

Otra consideración para estudiar los G4 mediante técnicas de RMN o cristalografía es que requieren altas concentraciones de biomoléculas que pueden llevar a que se observen artefactos tanto en la red cristalina como en los datos de RMN. Por ejemplo, se observó la primera estructura de un G4 natural y una proteína en la misma celda unitaria de cristal para el Oxytrichia nova proteína de unión al extremo del telómero (OnTEBP). Se ha demostrado que OnTEBP se une a las repeticiones monocatenarias al final de los telómeros (TTTTGGGG en Oxytrichia nova) y protegerlos de los mecanismos de reparación de daños en el ADN que reconocen roturas en el dsDNA [65]. Horvath y Schultz [66] estaban estudiando la unión de la repetición monocatenaria (GGGGTTTTGGGG) a la región OnTEBP y al analizar sus datos de cristalografía de rayos X observaron difracción de un ADN cuádruple que parecía estar unido a OnTEBP (1JB7). Tres proteínas OnTEBP relacionadas con la simetría aparecieron en la célula unitaria, cada una unida al ssDNA y cada una contribuyendo a la unión de un solo ADN cuádruple formado a partir de un dímero de su sustrato monocatenario. Las interacciones con una proteína OnTEBP se produjeron con un surco principal en la columna vertebral G4 y presentaron enlaces electrostáticos y de hidrógeno a los grupos de azúcar desoxirribosa. Las otras dos proteínas OnTEBP se unieron a través de las secuencias de bucle TTTT a través de interacciones electrostáticas, enlaces de hidrógeno y pi-pi, así como interacciones de apilamiento de CH-pi. Los autores reconocieron en su artículo que las interacciones probablemente se debieron a interacciones de empaquetamiento de cristales y pueden no ser fisiológicamente relevantes, lo que sirve como un ejemplo de por qué uno debe tener cuidado al analizar datos que se adquirieron en condiciones no fisiológicas.

Condiciones como pH bajo, alto contenido de sal y alta concentración de muestra se utilizan a menudo para obtener mejores cristales de difracción o bandas de RMN más discretas. La Figura 1 ejemplifica la importancia de considerar cuidadosamente la solución en la que se obtiene la información estructural, así como el método para obtener dicha información. Se observan dos topologías completamente diferentes para la misma secuencia de ADN dependiendo de qué catión estabiliza el cuádruplex. La presencia de Na + estabiliza la forma antiparalela [67, 68] mientras que el K + permite la cristalización de la forma paralela [69].

5. Conclusiones

El análisis mutacional y los estudios de rayos X y RMN de alta resolución han proporcionado información invaluable sobre las estructuras de las moléculas biológicas, lo que a su vez ha expuesto el mecanismo molecular de muchos procesos biológicos importantes. Con estas relaciones estructura-función, podemos abordar racionalmente cómo alterar estos procesos y modificarlos para corregir patologías. Aunque el reconocimiento de G4 por las proteínas está lejos de entenderse, han surgido varias tendencias entre los datos recopilados hasta la fecha. Es evidente que la estructura de bucle de G4 y las regiones de unión adyacentes a ellos presentan un paisaje molecular único para el reconocimiento de proteínas. Hasta ahora, este parece ser el modo de reconocimiento más común. Los aptámeros de unión a trombina parecen unirse canónicamente a la trombina utilizando las bases de timina de dos bucles laterales como una pinza para engancharse a la trombina. Los dominios RGG de EWS y FUS / TLS también parecen interactuar principalmente con los bucles de G4; en este caso, el modo de reconocimiento probablemente se deba a la ubicación de la cadena principal de fosforribosa que conecta las hebras de G4, ya que se ha demostrado que las propias bases ser prescindible. En el caso de FMRP, el péptido RGGGGR estabiliza la transición de G4 a dúplex llenando la unión entre ellos con apilamiento de bases y enlaces de hidrógeno de tipo Hoogsteen con la región bicatenaria.

Las mutaciones realizadas en la proteína FUS / TLS y su sustrato G4 han demostrado que el reconocimiento preferencial del ARN sobre el ADN G4 puede estar mediado por interacciones 2'OH. Será interesante ver cómo otras proteínas de unión a G4 se ven afectadas por mutaciones como las que se realizan con la proteína FUS / TLS. Hasta ahora, DHX36 es la única proteína de unión a G4 que se ha demostrado que interactúa directamente con la cara abierta de la tétrada de guanina del G4 y esto explica satisfactoriamente su preferencia por los G4 de ARN, ya que las caras de los G4 antiparalelos suelen estar oscurecidas por los bucles. . Sin embargo, dado que gran parte de la afinidad por G4 se pierde cuando solo se examina el péptido motivo específico DHX36, es probable que existan otras interfaces de unión en G4 que contribuyan a la afinidad de unión de la proteína de longitud completa.

Actualmente, la mayoría de las moléculas pequeñas que se unen a G4 interactúan directamente con la cara de la tétrada de guanina. Obviamente, esto competiría directamente con la unión de DHX36, pero también se ha demostrado que previene la unión de otros dominios RGG que contienen proteínas de unión a G4, lo que dificulta la elucidación específica y mecanicista de sus efectos [18, 43, 47]. Un enfoque alternativo para diseñar compuestos que se unan a G4 sería diseñar compuestos que imiten su estructura de bucle única. Dado que el reconocimiento de bucles parece ser clave para la especificidad de muchas proteínas de unión a G4, la creación de moléculas pequeñas para competir con esta interacción puede resultar en compuestos más específicos que podrían usarse de una manera más específica para afectar las vías celulares.

Conflictos de interés

Los autores declaran que no existen conflictos de intereses con respecto a la publicación de este artículo.

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Derechos de autor

Copyright & # xa9 2017 Ewan K. S. McRae et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo la licencia de atribución de Creative Commons, que permite el uso, distribución y reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que el trabajo original se cite correctamente.


Introducción

La estructura de doble hélice del ADN juega un papel importante en las ciencias de la vida porque sirve no solo como portador de información genética, sino también como base estructural para los procesos biológicos de replicación y transcripción del ADN. Estas estructuras helicoidales están estabilizadas por los enlaces de hidrógeno de los pares de bases, así como por las interacciones de apilamiento entre dos pares de bases superpuestos adyacentes.Se ha dedicado un gran esfuerzo a explorar la información precisa sobre la fuerza de unión entre los pares de bases 1, 2, 3, 4. Sin embargo, las técnicas tradicionales se ven muy afectadas por el alto costo, la baja eficiencia y la baja resolución de fuerza.

Con la llegada del microscopio de fuerza atómica (AFM), se pudo lograr una resolución de fuerza sin precedentes en piconewton (pN). En las últimas dos décadas, AFM ha demostrado ser un medio excelente para la evaluación de las propiedades mecánicas del ADN 5,6,7,8,9,10,11,12,13. Sotavento et al. llevó a cabo un trabajo pionero de medición de la fuerza de unión del ADN dúplex utilizando AFM 6. Diseñaron un experimento inteligente en el que una secuencia de ADN (ACTG)5 podrían formar dúplex de longitudes definidas (20, 16 y 12 pb) y la fuerza adhesiva se centraron en 1,52, 1,11 y 0,82 nN, lo que representa la fuerza de ruptura de las interacciones entre cadenas entre un solo par de dúplex, respectivamente 6,13. Los experimentos de estiramiento de dúplex de ADN se adoptaron luego ampliamente para probar la fuerza de resolución de pN tras la ruptura del par de bases 6,10,11,12,14. En algunos de los primeros experimentos, se investigó el impacto del efecto de cribado electrostático en las longitudes dúplex 1 y la influencia del acoplamiento hidrodinámico entre el ADN y el fluido 14. Muchos grupos mostraron interés en la torsión almacenada dentro de la doble hélice 15,16,17. Además, algunos investigadores han demostrado la correlación entre el contenido medio de dG / dC de los dúplex de ADN y la fuerza medida de la fuerza de ruptura del par de bases 15,18,19. La medición de AFM podría incluso identificar la mutación de bases, lo que destacó la posible aplicación en la secuenciación del ADN y el diagnóstico de enfermedades genéticas 20,21.

A pesar del gran éxito logrado en la caracterización AFM de las propiedades mecánicas de los dúplex de ADN, los estudios previos que utilizan AFM han demostrado algunos resultados inconsistentes. Las fuerzas de ruptura de los dúplex de ADN se informaron en un rango relativamente amplio 5, 8, 9, 10, 11, 12, 20, 22, 23. Podría ser tan grande como 300 pN 23 y tan pequeño como 10 pN también 18. Estas discrepancias en la fuerza de ruptura de los dúplex de ADN crearon confusión. Además, al revisar cuidadosamente los datos publicados anteriormente, se encontró que las fuerzas de unión medidas en diferentes experimentos nunca se han comparado y la mayoría de los estudios anteriores se han centrado solo en la caracterización de los enlaces de hidrógeno que estabilizan lateralmente el ADN de doble hebra. Se ha sabido que las interacciones de apilamiento de bases contribuyen también a la estabilización del ADN 7 y las interacciones de apilamiento de bases demostraron la propiedad dependiente de la secuencia 24. Desafortunadamente, la interacción de apilamiento de bases se ha investigado mucho menos hasta ahora.

En este estudio, diseñamos dos modos de medición del campo de fuerza. Como se muestra en la Figura 1, en el modo de descompresión, el extremo 5 'de una hebra se une covalentemente a la punta en voladizo y el extremo 3' de la hebra complementaria se une al portaobjetos de vidrio. Después de que se forma un dúplex, mover la punta del voladizo hacia arriba desenrollará el dúplex. Por tanto, los pares de bases se separarán uno por uno y la fuerza de ruptura medida representará la fuerza del enlace de hidrógeno de un solo par de bases. Por el contrario, en el modo de estiramiento, el extremo 3 'de dos oligonucleótidos se ata covalentemente a la punta en voladizo y al portaobjetos de vidrio, respectivamente. Por lo tanto, a medida que la punta en voladizo se mueve hacia arriba, dos hebras de este dúplex se separarán tirando en direcciones opuestas. Por tanto, la fuerza de ruptura medida incluirá la interacción de enlaces de hidrógeno de pares de bases y la interacción de saqueo de bases entre pares de bases adyacentes. La comparación de estos dos tipos de fuerzas de ruptura nos permite distinguir la fuerza del enlace de hidrógeno, así como la interacción de apilamiento de la base. Para revelar la fuerza de ruptura con mayor precisión, inicialmente caracterizamos la dependencia de estas fuerzas de ruptura en los parámetros del experimento, incluida la concentración de Na +, el tiempo de retención en voladizo, la tasa de carga y la longitud de la cadena de ADN.

Diagrama esquemático del modo de descompresión y el modo de estiramiento utilizados para medir la fuerza de unión de los pares de bases.


Enlace de hidrógeno revisado: selección geométrica como un determinante principal de la replicación del ADN & # x02009fidelity

El hecho de que los enlaces de hidrógeno desempeñen un papel central en la formación de los pares de bases Watson & # x02013Crick (W & # x02013C) A & # x022c5T y G & # x022c5C es un paradigma fundamental que data del descubrimiento de la estructura del ADN en 1953. Además de la unión entre cadenas H, entre cadenas Las interacciones de apilamiento de bases y de apilamiento cruzado entre cadenas son importantes para mantener las bases en una estructura apilada a lo largo de la columna vertebral del ADN. En general, los enlaces H entre pares de bases W & # x02013C se consideran & # x0201cinformacionales & # x0201d mientras que las interacciones de apilamiento de bases se consideran & # x0201c no informativas & # x0201d simplemente estabilizando la doble hélice. En consecuencia, es una percepción común que los enlaces H que emparejan A con T y G con C son los principales responsables de la capacidad de las ADN polimerasas para sintetizar ADN con alta fidelidad.

El difluorotolueno, un análogo isostérico no polar de la timina (T), contiene átomos de flúor en lugar de oxígenos en el anillo de pirimidina y, por lo tanto, no puede formar enlaces H con A (1). Sin embargo, los pares de bases A & # x022c5F se forman casi tan bien como los pares A & # x022c5T por Escherichia coli ADN polimerasa I defectuosa en la corrección de pruebas (KF exo & # x02212), como Moran et al. (2) informe en este número de la Actas & # x0005blas estructuras químicas de F y T y los modelos de llenado de espacio de cada uno se muestran en Moran et al. (2), figura 1 & # x0005d. La observación de que KF exo & # x02212 no discrimina fuertemente contra los pares A & # x022c5F se aplica cuando F está presente como base de plantilla en el ADN (3) o como sustrato de dFTP (2). La conclusión aparentemente ineludible es que los enlaces H no son absolutamente necesarios para que la polimerasa forme pares de bases W & # x02013C de forma selectiva.

Estos resultados proporcionan un impulso para reconsiderar qué papel juegan realmente los enlaces H en la estabilización del ADN y la mejora de la fidelidad de la ADN polimerasa. Los pares de bases no coincidentes en un oligómero de ADN dúplex provocan marcadas reducciones en las temperaturas de fusión del ADN (4). La pérdida de enlaces H al reemplazar T con F tiene este tipo de efecto desestabilizador (2). Sin embargo, la noción de que los enlaces H por sí solos mantienen juntas las dos hebras de una doble hélice de ADN, que se encuentra en muchos libros de texto, parece inadecuada. Cuando se considera que los copolímeros dúplex alternos poli d (A, T) o poli d (G, C) tienen temperaturas de fusión en solución acuosa que difieren sustancialmente de sus respectivas contrapartes de homopolímeros poli dA & # x022c5poly dT o poli dG & # x022c5poly dC, se convierte en Está claro que las interacciones de apilamiento de bases tienen un efecto dependiente de secuencia importante, quizás dominante, sobre la estabilidad del dúplex.

Además, las diferencias de energía libre (& # x00394 & # x00394G 0) entre pares de bases emparejados y no emparejados deducidos de los datos de fusión están en un rango de aproximadamente 0,2 & # x020134.0 kcal & # x0002fmol (4 & # x020136), dependiendo de la identidad del par incorrecto, el contexto de la secuencia circundante y su ubicación cerca del centro o en el extremo del ADN. Estos valores de & # x00394 & # x00394G 0, medidos en solución, son insuficientes para dar cuenta de la alta fidelidad de inserción de nucleótidos de prácticamente todas las polimerasas, incluidas aquellas que parecen ser especialmente & # x0201 propensas a errores & # x0201d, como la eucariota Pol & # x003b2 ( 7) o transcriptasa inversa del VIH-1 (8 & # x0201310). Por ejemplo, & # x00394 & # x00394G 0 & # x022483.7 kcal & # x0002fmol medido para los pares de bases naturales A & # x022c5T versus A & # x022c5C (6) debería resultar en una frecuencia de inserción incorrecta A & # x022c5C de aproximadamente 2 & # x000d7 10 & # x022123. Sin embargo, las frecuencias de inserción incorrecta de dAMP & # x022c5C y dCMP & # x022c5A son típicamente de uno a dos órdenes de magnitud más bajas que eso (11).

El reconocimiento de que las diferencias de energía libre entre pares de bases son demasiado pequeñas para tener en cuenta completamente las selectividades de inserción de la polimerasa nos llevó a H. Echols y a mí a proponer un mecanismo de & # x0201c selección geométrica & # x0201d como un componente clave de la especificidad de inserción (12, 13). La idea es que es probable que las propiedades geométricas y electrostáticas del sitio activo de la polimerasa tengan una profunda influencia en las especificidades de inserción de nucleótidos. Esta influencia favorecería fuertemente la inserción de bases que tengan una geometría óptima, de modo que las distancias C1 & # x02032 y los ángulos de enlace se aproximen más a los de los pares de bases Watson & # x02013Crick. Por ejemplo, los pares erróneos G & # x022c5T, G & # x022c5A y C & # x022c5A tienen ángulos de enlace marcadamente diferentes que los pares A & # x022c5T y G & # x022c5C (Fig. & # X200B (Fig.1) 1) (14).

Propiedades geométricas de Watson & # x02013Crick y pares de bases no coincidentes. Esta cifra se basa en la cristalografía de rayos X de oligonucleótidos de ADN-B dúplex. La sorprendente identidad geométrica de los pares de bases de Watson & # x02013Crick A & # x022c5T y G & # x022c5C no se corresponde con la oscilación protonada A & # x022c5C y la oscilación anormal de la base de G & # x022c5T ni con los pares de bases de oscilación G & # x022c5T o G (anti) & # x022c5A (syn) falta de emparejamiento de base. & # x0005b Reproducido con permiso de la ref. 14 (copyright 1987, Springer, Heidelberg). & # X0005d

La observación de Moran et al. (2) que la inserción del análogo de base F opuesto a A se reduce sólo 40 veces en comparación con su compuesto parental isostérico T opuesto a A sugiere que la alineación geométrica del sustrato y las bases de la plantilla es un determinante principal de la fidelidad de la polimerasa. Este resultado se puede comparar con estudios anteriores utilizando el análogo de base 2-aminopurina (2AP), que forma pares de bases 2AP & # x022c5T con dos enlaces H en una geometría W & # x02013C adecuada y se reduce 7 veces en comparación con A & # x022c5T ( 15, 16). Por lo tanto, la ausencia de enlaces H en la incorporación de F opuesto a A disminuye la selectividad solo alrededor de 6 veces en relación con la incorporación de 2AP opuesto a T. x022c5C (oscilación protonada), G & # x022c5A (anti& # x02013syn) (Fig. & # X200B (Fig.1) 1) están mal insertadas con frecuencias del orden de 10 & # x022123 & # x0201310 & # x022126 (11), las restricciones geométricas impuestas en el sitio activo de la polimerasa pueden mejorar las selectividades en quizás tres órdenes de magnitud o más.

Hay al menos tres puntos de control posibles para la alineación geométrica adecuada durante la inserción de la base por polimerasas: unión de dNTP inicial (16, 17), selección posterior a la unión para la geometría correcta (12, 18) mediante un mecanismo de ajuste inducido (19 & # x0201321), y el paso químico de formación de fosfodiéster. Los datos anteriores sugieren que existen diferencias significativas en la medida en que las diferentes polimerasas utilizan cada uno de los puntos de control. Hemos sugerido que la notable fidelidad de inserción de bases de las ADN polimerasas se deriva de la aplicación secuencial de cada punto de control para proporcionar una sensibilidad exquisita a la geometría de Watson & # x02013Crick en el estado de transición para la formación de fosfodiéster (13).

Teniendo en cuenta las limitaciones geométricas impuestas por el sitio activo de la polimerasa junto con el entorno electrostático del sitio activo, puede ser posible relacionar la selectividad de inserción de polimerasa con las diferencias de energía libre en solución entre pares de bases emparejados y mal emparejados. Las medidas de & # x00394G 0 = & # x00394H 0 & # x02212 T & # x00394S 0 indican diferencias relativamente pequeñas entre pares de bases correctos e incorrectos a 37 & # x000b0C & # x00394 & # x00394G 0 está en un rango de 0,2 & # x020134 kcal & # x0002fmol , como se ha mencionado más arriba. Las diferencias son pequeñas porque & # x00394S 0 se correlaciona con & # x00394H 0 (5, 22), un fenómeno llamado entalpía & # x02013 compensación de entropía, que se observa en solución acuosa (23). Es decir, se necesita más energía para fundir pares de bases altamente estables y rígidamente restringidos que para fundir pares de bases menos estables y débilmente restringidos. Sin embargo, los pares de bases rígidos que tienen menos grados de libertad en la doble hélice ganarán más grados de libertad al fundirse, mientras que lo contrario es cierto para los pares de bases menos estables. Siempre que los cambios de entropía y entalpía sean proporcionales, & # x00394 & # x00394H 0 se reduce en T & # x00394 & # x00394S 0, lo que da como resultado un pequeño & # x00394 & # x00394G 0 (5).

¿Cómo podrían las polimerasas aumentar las diferencias de energía libre para lograr una alta discriminación? Quizás las restricciones geométricas impuestas sobre el sustrato y las bases de la plantilla en la hendidura activa de la polimerasa pueden suprimir & # x00394 & # x00394S lo suficiente como para acercar & # x00394 & # x00394G en magnitud mucho más a & # x00394 & # x00394H. Los valores típicos de & # x00394 & # x00394H 0 medidos en solución acuosa son, por sí mismos, casi lo suficientemente grandes para adaptarse a las fidelidades de inserción de la polimerasa (5). Entonces, en la medida en que el dNTP y las bases de la plantilla se enfrenten entre sí en un medio dieléctrico inferior que actúa para excluir parcialmente el agua, los valores de & # x00394 & # x00394H pueden ser incluso mayores que en el agua (24). Por lo tanto, un sitio activo de polimerasa que se adapta perfectamente a los pares de bases correctos mediante la selección geométrica y también reduce el agua en las proximidades del par de bases puede amplificar las diferencias de energía libre del par de bases al reducir las diferencias de entropía y aumentar las diferencias de entalpía en cantidades suficientes para explicar los nucleótidos. fidelidad de inserción.

Además de la discriminación durante la inserción de nucleótidos, la fidelidad en la replicación del ADN a menudo se ve reforzada por una actividad exonucleasa asociada. La corrección de exonucleasas aumenta la fidelidad en aproximadamente 40 a 200 veces (25), mostrando una selectividad significativamente menor que las polimerasas. Generalmente se cree que la exonucleasa se basa en la capacidad de fusión del terminal 3 para distinguir entre inserciones correctas e incorrectas (26, 27). Se razona que la polimerización y la corrección de pruebas son reacciones competitivas en un extremo del cebador 3 & # x02032, que requieren un extremo recocido o fundido, respectivamente (16, 17). La discriminación surge porque es más probable que el terminal 3 & # x02032 se hibride después de inserciones correctas, lo que favorece la polimerización, pero es mucho más probable que se derrita después de inserciones incorrectas, lo que favorece la escisión (16, 28). Es tentador preguntarse si podría estar ocurriendo un mecanismo de selección geométrica en el sitio activo de la exonucleasa, mejorando la escisión de pares de bases que no son de Watson & # x02013Crick más allá de lo que se esperaría basándose únicamente en las estabilidades relativas de los pares de bases en solución.

Cualitativamente, las diferencias en la estabilidad de los pares de bases parecen ser suficientes. La evidencia proviene de las mediciones de la cinética del estado preestablecido en la escisión de 2AP emparejados frente a T, C, A y G utilizando la ADN polimerasa del bacteriófago T4 (29). La velocidad de escisión de 2AP de un extremo del cebador 3 & # x02032 está inversamente correlacionada con la temperatura de fusión de los pares de bases 2AP & # x022c5N incrustados en un dúplex de ADN oligomérico. Por ejemplo, cuando está presente en el mismo contexto de secuencia, un par de bases & # x0201cstable & # x0201d 2AP & # x022c5T Watson & # x02013Crick se hidroliza mucho más lentamente que un par de bamboleo inestable 2AP & # x022c5C. Sin embargo, un terminal 2AP & # x022c5T en un entorno rico en A-T se hidroliza más rápidamente que 2AP & # x022c5C en un entorno rico en G-C. Por tanto, la especificidad de la exonucleasa parece estar más fuertemente ligada a la estabilidad del ADN que a la geometría del par de bases terminales.

Sin embargo, sería de gran interés utilizar polimerasas con dominio de la corrección de pruebas para medir la escisión de difluorotolueno. Basado en mediciones de desnaturalización térmica, Moran et al. (2) demuestre que F se empareja mal con todas las bases naturales. De manera significativa, la magnitud de la diferencia de energía libre entre los pares de bases F & # x022c5A y T & # x022c5A es 3.6 kcal & # x0002fmol, similar a la encontrada para los pares de bases C & # x022c5A versus T & # x022c5A (6). Si las actividades de corrección de pruebas se rigen principalmente por la estabilidad del cebador y no por la selección geométrica, entonces se esperaría que F se extirpara mucho más rápidamente que T frente a A y, además, la tasa de escisión de F podría ser la misma independientemente de las bases naturales con las que se encuentre. emparejado.

La superficie apenas se ha arañado en términos de comprensión de las interacciones entre las polimerasas y el ADN que determinan la fidelidad de la replicación. La magnitud y la ubicación de las mutaciones dependen de una interacción compleja entre las polimerasas, las exonucleasas de corrección de pruebas, los factores de procesividad y las propiedades de las secuencias de plantilla de cebador de ADN. Aunque se ha propuesto que los modelos incluyan parámetros cinéticos de estado estable de la polimerasa junto con el apilamiento de bases y el contexto de secuencia para explicar la fidelidad (11), los mecanismos moleculares precisos que gobiernan los puntos calientes y fríos mutagénicos siguen siendo oscuros. Diferentes polimerasas que copian el mismo ADN cebador-molde pueden exhibir frecuencias de mutación y espectros marcadamente diferentes. La capacidad de separar los efectos de la unión de H del apilamiento de bases promete nuevos avances en estas direcciones. El uso futuro del análogo de difluorotolueno T junto con un grupo anticipado de otros análogos de bases de enlace no H debería permitir una determinación precisa de los efectos del apilamiento de bases del vecino más cercano sobre las frecuencias de inserción incorrecta y las eficiencias de corrección de pruebas, y arrojar luz sobre las diferencias entre la polimerasa y los sitios activos de exonucleasa detectan la presencia de bases cebadores y molde cercanas.

Reconozco la contribución fundamental de Hatch Echols al reconocer la importancia de la selección geométrica en la determinación de la fidelidad de la polimerasa, y agradezco a D. Kuchnir Fygenson, John Petruska, Ken Breslauer y Sharon Wald Krauss por sus valiosas contribuciones intelectuales y sus generosos consejos. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (GM21422) y por el Laboratorio de Biología Molecular Hedco de la Universidad del Sur de California.


Abstracto

El apilamiento de bases es un determinante clave de las estructuras de ácidos nucleicos, pero el origen preciso de la fuerza impulsora termodinámica detrás del apilamiento de nucleobases permanece abierto. La energía libre de apilamiento bastante suave medida experimentalmente, aproximadamente una kcal / mol dependiendo de la identidad de las bases, es fisiológicamente significativa porque mientras que el apilamiento de bases confiere estabilidad al genoma en su forma de doble hélice, el dúplex también tiene que desenrollarse para poder ser replicado o transcrito. Una acumulación de energía libre que sea demasiado alta o demasiado baja sobreestabilizará o subestabilizará el genoma, lo que afectará el almacenamiento de información genética y también su recuperación. Si bien el origen molecular de la fuerza impulsora de apilamiento se ha atribuido a muchas fuentes diferentes, incluida la dispersión, la electrostática y el enlace de hidrógeno con solventes, aquí mostramos a través de una descomposición sistemática de la energía libre de apilamiento utilizando simulaciones por computadora a gran escala que la fuerza impulsora dominante estabiliza la base el apilamiento es entropía de disolvente no hidrófobo. Contrarrestando esto está la penalización entrópica conformacional en la columna vertebral de azúcar-fosfato contra el apilamiento, mientras que los enlaces de hidrógeno del solvente, las interacciones carga-carga y las fuerzas dispersivas producen sólo perturbaciones secundarias.Las fuerzas entrópicas solventes y las cepas conformacionales de la columna vertebral del ADN, por lo tanto, trabajan una contra la otra, lo que lleva a un compuesto muy suave que apila la energía libre de acuerdo con los experimentos.


Introducción

La conformación más común de un dúplex de ácido desoxirribonucleico (ADN) es una doble hélice derecha. La hélice existe en una serie de conformaciones canónicas, siendo las más comunes las formas A y B. La conformación en forma B se observa principalmente en solución acuosa. 1 La forma A del ADN se observa en ambientes con baja actividad de agua asociada con baja humedad relativa, o en soluciones con alto contenido de sal o alto contenido de etanol. 2 La diferencia entre las conformaciones de las formas A y B está dominada por tres contribuciones principales: (i) energías intrínsecas asociadas con la estructura de azúcar / fosfodiéster y el enlace glicosídico, (ii) interacciones ambientales, incluida la hidratación de surcos menores y mayores y (iii) las contribuciones de energía intrínseca asociadas con el apilamiento de la base. 3 & # x0201310

El apilamiento intrínseco de las bases de ácidos nucleicos surge principalmente de interacciones de dispersión, en lugar de interacciones electrostáticas, y por tanto, calcular con precisión la interacción de apilamiento es un desafío computacional significativo. Muchos estudios han documentado la necesidad de utilizar métodos de agrupamiento acoplado junto con conjuntos de bases grandes y difusos para obtener energías de interacción precisas entre moléculas aromáticas. 11 & # x0201315 Sin embargo, tales métodos son extremadamente intensivos en computación y consumen mucho tiempo y no son prácticos para sistemas más grandes.

La teoría de perturbación de segundo orden (MP2) es un método más manejable desde el punto de vista computacional para sistemas más grandes, pero se sabe que MP2 sobreestima la energía de interacción para las interacciones de apilamiento de bases. 11,16 Un método para mejorar los resultados de MP2 es utilizar el llamado enfoque 17 de escala de componente de espín (SCS), que usa diferentes factores de escala para las contribuciones del mismo espín y espín opuesto a la energía total. Para evaluar la precisión de esta técnica, Sherrill y sus colaboradores han comparado las curvas de energía potencial de clúster acoplado del conjunto de bases completas para varias interacciones prototípicas no unidas con las obtenidas utilizando SCS-MP2 y varios métodos funcionales de densidad. 18 En general, SCS-MP2 dio resultados razonables, que típicamente produjeron errores del orden de unas pocas décimas de 1 kcal mol & # x022121. Una comparación adicional de los resultados de SCS-MP2 a CCSD (T) para un conjunto de datos S22 revisado, que incluye un dímero de benceno desplazado en paralelo, un dímero de uracilo y un complejo apilado de adenina-timina, arrojó una desviación absoluta media entre el SCS-MP2 y el Resultados de energía CCSD (T) de 0,80 kcal / mol y la desviación cuadrática media fue de 0,96 kcal / mol. 19

El coste computacional de MP2 puede reducirse mediante el uso de la aproximación 20 de ajuste de densidad (DF) que acelera la evaluación de las dos integrales de electrones mediante la introducción de un conjunto de bases auxiliares. Es importante destacar que la aproximación DF, que también se conoce como el método de resolución de identidad (RI), no impacta significativamente las energías obtenidas en relación con el MP2 canónico. Para un dímero de timina-timina representativo, mientras que un cálculo de energía de un solo punto MP2 / aug-cc-pVTZ tarda aproximadamente 22 horas, el cálculo de DF-MP2 / aug-cc-pVTZ correspondiente tarda menos de 1 hora. El uso de ajuste de densidad junto con SCS debería proporcionar estimaciones satisfactorias de la energía de interacción de apilamiento de bases a un costo computacional razonable.

Además de la identificación y aplicación del modelo químico apropiado para el apilamiento de bases, así como para otras interacciones moleculares, otro factor a considerar es el tratamiento de los grados de libertad inter e intramoleculares de las propias bases. En la mayoría de los estudios hasta la fecha, las geometrías de monómero (es decir, base de ácido nucleico individual) se fijaron en geometrías experimentales, empíricas o de monómero QM optimizadas con los grados de libertad intermoleculares ajustados u optimizados en diversos grados. 16,21 & # x0201325 Estos estudios incluyen la optimización completa de un dímero de uracilo apilado para identificar puntos estacionarios 26 en una serie de estudios en los que las geometrías intermoleculares corresponden a orientaciones de apilamiento observadas experimentalmente de las formas A o B de ADN típicamente. 21,24,25,27 Este trabajo se ha ampliado para incluir un muestreo sistemático de torsión o balanceo. 28,29 Sin embargo, la orientación relativa de las bases apiladas puede variar ampliamente en el ADN. Esto incluye efectos dependientes de la secuencia, así como la orientación relativa de bases adyacentes en regiones no canónicas de ADN o ARN, que a menudo se desvían significativamente de lo que se considerarían orientaciones apiladas. 30 & # x0201332 Además, la orientación relativa de las bases apiladas puede variar significativamente durante el curso de la dinámica normal a la que se someten los oligonucleótidos en entornos acuosos y fisiológicos a temperatura ambiente. 33,34 Por lo tanto, para investigar la contribución de las interacciones de apilamiento a las propiedades conformacionales del ADN y el ARN, es necesario adoptar un marco de referencia en el que se pueda definir rigurosamente la orientación relativa de las bases apiladas, con el fin de controlar sistemáticamente la orientación intermolecular entre monómeros de base apilados o pares de bases mientras que también permite la relajación de los grados de libertad intramoleculares de las bases individuales en el complejo.


Revisión del enlace de hidrógeno: la selección geométrica como determinante principal de la fidelidad de la replicación del ADN

El hecho de que los enlaces de hidrógeno desempeñen un papel central en la formación de pares de bases Watson-Crick (W-C) A⋅T y G⋅C es un paradigma fundamental que se remonta al descubrimiento de la estructura del ADN en 1953. Además de los enlaces H entre cadenas, entre cadenas Las interacciones de apilamiento de bases y de apilamiento cruzado entre cadenas son importantes para mantener las bases en una estructura apilada a lo largo de la columna vertebral del ADN. En general, los enlaces H entre los pares de bases W-C se consideran "informativos", mientras que las interacciones de apilamiento de bases se consideran "no informativas", simplemente estabilizan la doble hélice. En consecuencia, es una percepción común que los enlaces H que emparejan A con T y G con C son los principales responsables de la capacidad de las ADN polimerasas para sintetizar ADN con alta fidelidad.

El difluorotolueno, un análogo isostérico no polar de la timina (T), contiene átomos de flúor en lugar de oxígenos en el anillo de pirimidina y, por lo tanto, no puede formar enlaces H con A (1). Sin embargo, los pares de bases A⋅F se forman casi tan bien como los pares A⋅T por Escherichia coli ADN polimerasa I defectuosa en la corrección de pruebas (KF exo -), como Moran et al. (2) informe en este número de la Actas [las estructuras químicas de F y T y los modelos de llenado de espacio de cada uno se muestran en Moran et al. (2), figura 1]. La observación de que KF exo no discrimina fuertemente contra los pares A⋅F se aplica cuando F está presente como base de plantilla en el ADN (3) o como sustrato de dFTP (2). La conclusión aparentemente ineludible es que los enlaces H no son absolutamente necesarios para que la polimerasa forme pares de bases W-C de forma selectiva.

Estos resultados proporcionan un impulso para reconsiderar qué papel juegan realmente los enlaces H en la estabilización del ADN y la mejora de la fidelidad de la ADN polimerasa. Los pares de bases no coincidentes en un oligómero de ADN dúplex provocan marcadas reducciones en las temperaturas de fusión del ADN (4). La pérdida de enlaces H al reemplazar T con F tiene este tipo de efecto desestabilizador (2). Sin embargo, la noción de que los enlaces H por sí solos mantienen juntas las dos hebras de una doble hélice de ADN, que se encuentra en muchos libros de texto, parece inadecuada. Cuando se considera que los copolímeros dúplex alternos poli d (A, T) o poli d (G, C) tienen temperaturas de fusión en solución acuosa que difieren sustancialmente de sus homólogos homopolímeros respectivos poli dA⋅poly dT o poli dG⋅poly dC, se convierte en Está claro que las interacciones de apilamiento de bases tienen un efecto dependiente de secuencia importante, quizás dominante, sobre la estabilidad del dúplex.

Además, las diferencias de energía libre (ΔΔG 0) entre pares de bases coincidentes y no coincidentes deducidas de los datos de fusión se encuentran en un rango de aproximadamente 0,2 a 4,0 kcal / mol (4 a 6), según la identidad del par erróneo, la secuencia circundante contexto, y su ubicación cerca del centro o en el término del ADN. Estos valores de ΔΔG 0, medidos en solución, son insuficientes para tener en cuenta las altas fidelidades de inserción de nucleótidos de prácticamente todas las polimerasas, incluidas aquellas que parecen ser especialmente "propensas a errores" como la eucariota Pol β (7) o la transcriptasa inversa del VIH-1. (8-10). Por ejemplo, ΔΔG 0 ≈3,7 kcal / mol medido para los pares de bases naturales A⋅T frente a A⋅C (6) debería dar como resultado una frecuencia de inserción incorrecta de A⋅C de aproximadamente 2 × 10 −3. Sin embargo, las frecuencias de inserción incorrecta de dAMP⋅C y dCMP⋅A son típicamente de uno a dos órdenes de magnitud más bajas que eso (11).

El reconocimiento de que las diferencias de energía libre entre pares de bases son demasiado pequeñas para tener en cuenta completamente las selectividades de inserción de la polimerasa nos llevó a H. Echols ya mí a proponer un mecanismo de "selección geométrica" ​​como un componente clave de la especificidad de inserción (12, 13). La idea es que es probable que las propiedades geométricas y electrostáticas del sitio activo de la polimerasa tengan una profunda influencia en las especificidades de inserción de nucleótidos. Esta influencia favorecería fuertemente la inserción de bases que tengan una geometría óptima, de manera que las distancias C1 ′ y los ángulos de enlace se aproximen más a los de los pares de bases Watson-Crick. Por ejemplo, los pares incorrectos G⋅T, G⋅A y C⋅A tienen ángulos de enlace marcadamente diferentes que los pares A⋅T y G⋅C (Fig. 1) (14).

Propiedades geométricas de Watson-Crick y pares de bases no coincidentes. Esta cifra se basa en la cristalografía de rayos X de oligonucleótidos de ADN-B dúplex. La llamativa identidad geométrica de los pares de bases Watson-Crick A⋅T y G⋅C no se corresponde con la oscilación protonada de A⋅C y los errores de pares de base de oscilación G⋅T ni con el G (anti) ⋅A (syn) falta de emparejamiento de base. [Reproducido con permiso de la ref. 14 (copyright 1987, Springer, Heidelberg).]

La observación de Moran et al. (2) que la inserción del análogo de base F opuesto a A se reduce sólo 40 veces en comparación con su compuesto parental isostérico T opuesto a A sugiere que la alineación geométrica del sustrato y las bases de la plantilla es un determinante principal de la fidelidad de la polimerasa. Este resultado se puede comparar con estudios anteriores que utilizan el análogo de base 2-aminopurina (2AP), que forma pares de bases 2AP⋅T con dos enlaces H en una geometría W-C adecuada y se reduce 7 veces en comparación con A⋅T ( 15, 16). Por lo tanto, la ausencia de enlaces H en la incorporación de F opuesto a A disminuye la selectividad solo alrededor de 6 veces en relación con la incorporación de 2AP opuesto a T. C (oscilación protonada), G⋅A (antisyn) (Fig. 1) están mal insertadas con frecuencias del orden de 10 −3-10 −6 (11), las restricciones geométricas impuestas en el sitio activo de la polimerasa pueden mejorar las selectividades quizás en tres órdenes de magnitud o más.

Hay al menos tres puntos de control posibles para una alineación geométrica adecuada durante la inserción de bases por polimerasas: unión de dNTP inicial (16, 17), selección posterior a la unión para la geometría correcta (12, 18) mediante un mecanismo de ajuste inducido (19-21), y el paso químico de formación de fosfodiéster. Los datos anteriores sugieren que existen diferencias significativas en la medida en que las diferentes polimerasas utilizan cada uno de los puntos de control. Hemos sugerido que la notable fidelidad de inserción de bases de las ADN polimerasas se deriva de la aplicación secuencial de cada punto de control para proporcionar una sensibilidad exquisita a la geometría de Watson-Crick en el estado de transición para la formación de fosfodiéster (13).

Teniendo en cuenta las limitaciones geométricas impuestas por el sitio activo de la polimerasa junto con el entorno electrostático del sitio activo, puede ser posible relacionar la selectividad de inserción de polimerasa con las diferencias de energía libre en solución entre pares de bases emparejados y mal emparejados. Las mediciones de ΔG 0 = ΔH 0 - TΔS 0 indican diferencias relativamente pequeñas entre pares de bases correctos e incorrectos a 37 ° C. ΔΔG 0 está en un rango de 0,2 a 4 kcal / mol, como se mencionó anteriormente. Las diferencias son pequeñas porque ΔS 0 se correlaciona con ΔH 0 (5, 22), un fenómeno llamado compensación de entalpía-entropía, que se observa en solución acuosa (23). Es decir, se necesita más energía para fundir pares de bases altamente estables y rígidamente restringidos que para fundir pares de bases menos estables y débilmente restringidos. Sin embargo, los pares de bases rígidos que tienen menos grados de libertad en la doble hélice ganarán más grados de libertad al fundirse, mientras que lo contrario es cierto para los pares de bases menos estables. Siempre que los cambios de entropía y entalpía sean proporcionales, ΔΔH 0 se reduce en TΔΔS 0, lo que da como resultado un pequeño ΔΔG 0 (5).

¿Cómo podrían las polimerasas aumentar las diferencias de energía libre para lograr una alta discriminación? Quizás las restricciones geométricas impuestas sobre el sustrato y las bases de la plantilla en la hendidura activa de la polimerasa pueden suprimir ΔΔS lo suficiente para acercar ΔΔG en magnitud mucho más a ΔΔH. Los valores típicos de ΔΔH 0 medidos en solución acuosa son, por sí mismos, casi lo suficientemente grandes para adaptarse a las fidelidades de inserción de la polimerasa (5). Luego, en la medida en que el dNTP y las bases de la plantilla se enfrenten entre sí en un medio dieléctrico inferior que actúa para excluir parcialmente el agua, los valores de ΔΔH pueden ser incluso mayores que en el agua (24). Por lo tanto, un sitio activo de polimerasa que se adapta perfectamente a los pares de bases correctos mediante la selección geométrica y también reduce el agua en las proximidades del par de bases puede amplificar las diferencias de energía libre del par de bases al reducir las diferencias de entropía y aumentar las diferencias de entalpía en cantidades suficientes para explicar los nucleótidos. fidelidad de inserción.

Además de la discriminación durante la inserción de nucleótidos, la fidelidad en la replicación del ADN a menudo se ve reforzada por una actividad exonucleasa asociada. La corrección de exonucleasas aumenta la fidelidad en aproximadamente 40 a 200 veces (25), mostrando una selectividad significativamente menor que las polimerasas. En general, se cree que la exonucleasa se basa en la "capacidad de fusión" del extremo 3 'para distinguir entre inserciones correctas e incorrectas (26, 27). Se razona que la polimerización y la corrección de pruebas son reacciones competitivas en un extremo 3 'del cebador, que requieren un extremo recocido o fundido, respectivamente (16, 17). La discriminación surge porque es más probable que el terminal 3 'se hibride después de inserciones correctas, lo que favorece la polimerización, pero es mucho más probable que se derrita después de inserciones incorrectas, lo que favorece la escisión (16, 28). Es tentador preguntarse si podría estar ocurriendo un mecanismo de selección geométrica en el sitio activo de la exonucleasa, mejorando la escisión de pares de bases que no son de Watson-Crick más allá de lo que cabría esperar basándose únicamente en las estabilidades relativas de los pares de bases en solución.

Cualitativamente, las diferencias en la estabilidad de los pares de bases parecen ser suficientes. La evidencia proviene de las mediciones de la cinética del estado preestablecido en la escisión de 2AP emparejados frente a T, C, A y G utilizando la ADN polimerasa del bacteriófago T4 (29). La velocidad de escisión de 2AP de un cebador-terminal 3 'está inversamente correlacionada con la temperatura de fusión de los pares de bases 2AP⋅N incrustados en un dúplex de ADN de oligómero. Por ejemplo, cuando está presente en el mismo contexto de secuencia, un par de bases 2AP⋅T Watson – Crick “estable” se hidroliza mucho más lentamente que un par de bamboleo inestable 2AP⋅C. Sin embargo, un 2AP⋅T terminal en un ambiente rico en A-T se hidroliza más rápidamente que el 2AP⋅C en un ambiente rico en G-C. Por tanto, la especificidad de la exonucleasa parece estar más fuertemente ligada a la estabilidad del ADN que a la geometría del par de bases terminales.

Sin embargo, sería de gran interés utilizar polimerasas con dominio de la corrección de pruebas para medir la escisión de difluorotolueno. Basado en mediciones de desnaturalización térmica, Moran et al. (2) demuestre que F se empareja mal con todas las bases naturales. De manera significativa, la magnitud de la diferencia de energía libre entre los pares de bases F⋅A y T⋅A es 3.6 kcal / mol, similar a la encontrada para los pares de bases C⋅A versus T⋅A (6). Si las actividades de corrección de pruebas se rigen principalmente por la estabilidad del cebador y no por la selección geométrica, entonces se esperaría que F se extirpara mucho más rápidamente que T frente a A y, además, la tasa de escisión de F podría ser la misma independientemente de las bases naturales con las que se encuentre. emparejado.

La superficie apenas se ha arañado en términos de comprensión de las interacciones entre las polimerasas y el ADN que determinan la fidelidad de la replicación. La magnitud y la ubicación de las mutaciones dependen de una interacción compleja entre las polimerasas, las exonucleasas de corrección de pruebas, los factores de procesividad y las propiedades de las secuencias de plantilla de cebador de ADN. Aunque se ha propuesto que los modelos incluyan parámetros cinéticos de estado estable de la polimerasa junto con el apilamiento de bases y el contexto de secuencia para explicar la fidelidad (11), los mecanismos moleculares precisos que gobiernan los puntos calientes y fríos mutagénicos siguen siendo oscuros. Diferentes polimerasas que copian el mismo ADN cebador-molde pueden exhibir frecuencias de mutación y espectros marcadamente diferentes. La capacidad de separar los efectos de la unión de H del apilamiento de bases promete nuevos avances en estas direcciones. El uso futuro del análogo de difluorotolueno T junto con un grupo anticipado de otros análogos de bases de enlace no H debería permitir una determinación precisa de los efectos del apilamiento de bases del vecino más cercano sobre las frecuencias de inserción incorrecta y las eficiencias de corrección de pruebas, y arrojar luz sobre las diferencias entre la polimerasa y los sitios activos de exonucleasa detectan la presencia de bases cebadores y molde cercanas.

Reconozco la contribución fundamental de Hatch Echols al reconocer la importancia de la selección geométrica en la determinación de la fidelidad de la polimerasa, y agradezco a D. Kuchnir Fygenson, John Petruska, Ken Breslauer y Sharon Wald Krauss por sus valiosas contribuciones intelectuales y sus generosos consejos. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (GM21422) y por el Laboratorio de Biología Molecular Hedco de la Universidad del Sur de California.


Bucle de dos bases

Las interacciones base-base entre el primero y el cuarto nucleótidos se encuentran en la mayoría de los tetraloops (UNCG, GNRA, CUUG, UGAA y CAAC). Los tetrabucles que tienen estas interacciones deben considerarse como mini bucles que tienen solo dos nucleótidos de bucle. Para estos tetrabucles, generalmente se observa pandeo entre la primera y la cuarta base. Ambos nucleótidos de dos bases tienen uno o más C2′-endo conformación de azúcar para ayudar a unir el tallo. Para los esquemas de enlaces de hidrógeno específicos de las interacciones base-base, consulte la sección sobre Estructura y Figura 1d.

Uno o ambos de los dos nucleótidos de bucle de los bucles de dos bases a menudo exhiben dinámica estructural. La posición del segundo nucleótido en los bucles UNCG y GNRA no está bien definida en comparación con los otros nucleótidos del bucle.La conformación de azúcar de todos los nucleótidos del bucle en el bucle UGAA muestra dinámica. En el tetraloop CUUG, la segunda U está bien definida por los datos NOE e interactúa con el bucle C · G y los primeros pares de bases del tallo en el surco menor. La posición de la tercera U no está bien definida aunque se encuentra en el surco mayor. El nucleótido no estructurado en los bucles de dos bases puede ser importante para el reconocimiento y las interacciones ARN-proteína.

Glosario

Un oligonucleótido de unión a ligando que ha sido aislado por un in vitro técnica de selección.

Un enlace de hidrógeno donde un solo aceptor o donante de enlaces de hidrógeno está involucrado en dos enlaces de hidrógeno.

Métodos que evalúan la energía del campo de fuerza y ​​sus derivadas analíticas y mueven todos los átomos utilizando las leyes del movimiento de Newton.

Un cambio en la intensidad de la señal de resonancia magnética nuclear integrada de un espín nuclear cuando otro espín está saturado.

Un proceso por el cual se lleva a cabo una transferencia de energía no radiativa desde un espín excitado hasta los grados de libertad reticular del sistema.

El lado de una base o un par de bases que tiene los donantes y aceptores de enlaces de hidrógeno que participan en el par de bases Watson-Crick.


Métodos para detectar interacciones proteína-ADN

El método de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) se puede utilizar para controlar la regulación transcripcional a través de la modificación de histonas (epigenética) o interacciones de unión entre el factor de transcripción y el ADN. El método de ensayo ChIP permite el análisis de interacciones ADN-proteína en células vivas tratando las células con formaldehído u otros reactivos de reticulación para estabilizar las interacciones para la purificación y detección posteriores. La realización de ensayos de ChIP requiere el conocimiento de la proteína diana y la secuencia de ADN que se analizará, ya que los investigadores deben proporcionar un anticuerpo contra la proteína de interés y cebadores de PCR para la secuencia de ADN de interés. El anticuerpo se utiliza para precipitar selectivamente el complejo proteína-ADN de los otros fragmentos de ADN genómico y complejos proteína-ADN. Los cebadores de PCR permiten la amplificación y detección específicas de la secuencia de ADN diana. La técnica de PCR cuantitativa (qPCR) permite cuantificar la cantidad de secuencia de ADN diana. El ensayo de ChIP es apto para formatos basados ​​en matrices (ChIP-on-chip) o secuenciación directa del ADN capturado por la proteína inmunoprecipitada (ChIP-seq).

  • capturar una instantánea de una proteína-ADN específica
    interacciones a medida que ocurren en células vivas
  • cuantitativo cuando se combina con el análisis qPCR
  • capacidad de perfilar un promotor para diferentes proteínas
  • El investigador necesita obtener anticuerpos de grado ChIP.
  • requiere el diseño de imprimaciones específicas
  • difícil de adaptar para cribado de alto rendimiento

Una guía paso a paso para el éxito de los ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)

Esta descripción general actualizada del procedimiento de ChIP incluye detalles adicionales sobre la selección de anticuerpos primarios (es decir, anticuerpos validados por ChIP). La nota de aplicación también describe y proporciona ejemplos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) como una técnica para estudiar la epigenética, ya que permite a los investigadores capturar una instantánea de interacciones específicas entre proteínas y ADN.

Nuestro Manual técnico de interacción de proteínas de 72 páginas proporciona protocolos e información técnica y de productos para ayudar a maximizar los resultados de los estudios de interacción de proteínas. El manual proporciona antecedentes, sugerencias útiles y consejos para la resolución de problemas para los ensayos de inmunoprecipitación y co-inmunoprecipitación, ensayos de extracción, transferencia de lejano oeste y reticulación. El manual también incluye una sección ampliada sobre métodos para estudiar las interacciones proteína-ácido nucleico, incluidos ChIP, EMSA y RNA EMSA. El manual es un recurso esencial para cualquier laboratorio que estudie las interacciones de las proteínas.

El contenido incluye: Introducción a las interacciones de proteínas, Ensayos de co-inmunoprecipitación, Ensayos de pull-down, Transferencia de Far-Western, Mapeo de interacción de proteínas, Ensayos de reportero de dos híbridos de levadura, Ensayos de cambio de movilidad electroforética [EMSA], Ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), Proteína –Conjugados de ácido nucleico y más.

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El ensayo de desplazamiento de movilidad electroforético de ADN (EMSA) se usa para estudiar proteínas que se unen a sondas oligonucleotídicas de ADN conocidas y se puede usar para evaluar el grado de afinidad o especificidad de la interacción. La técnica se basa en la observación de que los complejos proteína-ADN migran más lentamente que las moléculas de ADN libre cuando se someten a electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida no desnaturalizante. Debido a que la velocidad de migración del ADN se desplaza o retarda con la unión a la proteína, el ensayo también se denomina ensayo de cambio de gel o de retardo de gel. La adición de un anticuerpo específico de proteína a los componentes de unión crea un complejo aún mayor (anticuerpo-proteína-ADN), que migra aún más lentamente durante la electroforesis. Esto se conoce como "superdesplazamiento" y se puede utilizar para confirmar la identidad de las proteínas. Hasta la concepción de la EMSA, las interacciones proteína-ADN se estudiaron principalmente mediante ensayos de unión a filtros de nitrocelulosa utilizando sondas marcadas radiactivamente.

  • detectar proteínas de unión a ADN de baja abundancia a partir de lisados
  • probar mutaciones en el sitio de unión usando muchas configuraciones de sonda con el mismo lisado
  • prueba de afinidad de unión a través del análisis mutacional de la sonda de ADN
  • EMSA no radiactivo posible utilizando sondas de ADN biotiniladas o marcadas con fluorescencia
  • analizar las interacciones proteína-ADN in vitro
  • difícil de cuantificar
  • necesidad de realizar un ensayo de superdesplazamiento con el anticuerpo para estar seguro de la identidad de la proteína en un complejo

Tradicionalmente, las sondas de ADN se han marcado radiactivamente con ³²P incorporando un [γ-³²P] dNTP durante una reacción de relleno en 3 'usando un fragmento de Klenow o mediante marcaje en el extremo 5' usando [γ-³²P] ATP y polinucleótido quinasa T4. Después de la electroforesis, el gel se expone a una película de rayos X para documentar los resultados. El kit EMSA quimioluminiscente Thermo Scientific LightShift es un ensayo no radiactivo que proporciona un rendimiento sólido y sensible. El kit incluye reactivos para configurar y personalizar reacciones de unión al ADN, un conjunto de control de ADN y extracto de proteína para probar el sistema del kit, conjugado de estreptavidina-HRP estabilizado para sondear el ADN diana marcado con biotina y un módulo de sustrato quimioluminiscente excepcionalmente sensible para la detección.

EMSA quimioluminiscente de cuatro complejos ADN-proteína diferentes. Los dúplex diana marcados con biotina variaron en tamaño de 21 a 25 pb. Los factores de transcripción Oct-1, AP1 y NF-κB se derivaron del extracto nuclear de HeLa. El extracto de EBNA-1 se proporciona como control en el kit EMSA quimioluminiscente LightShift. Las secuencias competidoras específicas no marcadas (cuando se usaban) estaban presentes en un exceso molar de 200 veces con respecto a la diana marcada. Los tiempos de exposición de la película de rayos X para cada sistema oscilaron entre 2 minutos para EBNA, Oct-1 y AP1, y 5 minutos para NF-κB.


Diferencia entre Van der Waals y enlaces de hidrógeno

Las fuerzas de Van der Waals y los enlaces de hidrógeno son atracciones intermoleculares entre moléculas. Algunas fuerzas intermoleculares son más fuertes y otras son débiles. Estos enlaces determinan el comportamiento de las moléculas.

Las fuerzas de van der Waals

Para una atracción intermolecular, debe haber una separación de carga. Hay algunas moléculas simétricas como H 2, Cl 2, donde no hay separaciones de carga. Sin embargo, los electrones se mueven constantemente en estas moléculas. Por lo tanto, puede haber una separación de carga instantánea dentro de la molécula si el electrón se mueve hacia un extremo de la molécula. El extremo con el electrón tendrá una carga negativa temporalmente, mientras que el otro extremo tendrá una carga positiva. Estos dipolos temporales pueden inducir un dipolo en la molécula vecina y, posteriormente, puede producirse una interacción entre polos opuestos. Este tipo de interacción se conoce como interacción dipolo inducida por dipolo. Además, puede haber interacciones entre un dipolo permanente y un dipolo inducido o entre dos dipolos permanentes. Todas estas interacciones intermoleculares se conocen como fuerzas de Van der Waals.

Enlaces de hidrógeno

Cuando el hidrógeno se une a un átomo electronegativo como el flúor, el oxígeno o el nitrógeno, se producirá un enlace polar. Debido a la electronegatividad, los electrones en el enlace serán más atraídos por el átomo electronegativo que por el átomo de hidrógeno. Por lo tanto, el átomo de hidrógeno obtendrá una carga positiva parcialmente, mientras que el átomo más electronegativo obtendrá una carga negativa parcialmente. Cuando dos moléculas que tienen esta separación de carga están cerca, habrá una fuerza de atracción entre el hidrógeno y el átomo cargado negativamente. Esta atracción se conoce como enlace de hidrógeno. Los enlaces de hidrógeno son relativamente más fuertes que otras interacciones dipolo y determinan el comportamiento molecular. Por ejemplo, las moléculas de agua tienen enlaces de hidrógeno intermoleculares. Una molécula de agua puede formar cuatro enlaces de hidrógeno con otra molécula de agua. Dado que el oxígeno tiene dos pares solitarios, puede formar dos enlaces de hidrógeno con hidrógeno cargado positivamente. Entonces, las dos moléculas de agua se pueden conocer como dímero. Cada molécula de agua puede unirse con otras cuatro moléculas debido a la capacidad de enlace de hidrógeno. Esto da como resultado un punto de ebullición más alto para el agua, a pesar de que una molécula de agua tiene un peso molecular bajo. Por tanto, la energía necesaria para romper los enlaces de hidrógeno cuando pasan a la fase gaseosa es elevada. Además, los enlaces de hidrógeno determinan la estructura cristalina del hielo. La disposición única de la celosía de hielo lo ayuda a flotar en el agua, por lo que protege la vida acuática en el período invernal. Aparte de esto, los enlaces de hidrógeno juegan un papel vital en los sistemas biológicos. La estructura tridimensional de las proteínas y el ADN se basa únicamente en enlaces de hidrógeno. Los enlaces de hidrógeno pueden destruirse por calentamiento y fuerzas mecánicas.

¿Cuál es la diferencia entre las fuerzas de Van der Waals y los enlaces de hidrógeno?

• Los enlaces de hidrógeno se producen entre el hidrógeno, que está conectado a un átomo electronegativo y un átomo electronegativo de otra molécula. Este átomo electronegativo podría ser flúor, oxígeno o nitrógeno.

• Las fuerzas de Van der Waals pueden ocurrir entre dos dipolos permanentes, dipolos inducidos por dipolos o dos dipolos inducidos.

• Para que se produzcan las fuerzas de Van der Waals, la molécula no debe tener necesariamente un dipolo, pero el enlace de hidrógeno tiene lugar entre dos dipolos permanentes.