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¿Existe un término para un procedimiento en el que la columna de cromatografía se lava con alcohol al 20%?

¿Existe un término para un procedimiento en el que la columna de cromatografía se lava con alcohol al 20%?


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De una descripción de método en un documento ruso:

Una vez finalizado el análisis cromatográfico, la columna se enjuaga con al menos 2-3 volúmenes de agua a una velocidad de 0,4 ml / min. La columna es entonces naufragio (?) lavándolo con al menos 10-15 volúmenes de alcohol al 20% a una velocidad que disminuye lentamente de 0,4 ml / min a 0 ml / min.

La palabra que traduje como "naftalina" es Konservirovat (консервировать колонку) en ruso. Tiene el significado general de "preparar algo para el almacenamiento" (por ejemplo, "preparar verduras para el almacenamiento mediante encurtido").

En un esfuerzo por determinar la terminología correcta, Me gustaría saber la razón por la que una columna de cromatografía se lavaría con etanol al 20%.. Cualquier recomendación sobre la terminología bioquímica estándar para este procedimiento, si existe, también sería bienvenida.


Preparado o acondicionado para almacenamiento probablemente sería perfectamente aceptable.

Si está buscando un equivalente de una sola palabra, en este caso, lo traduciría como estabilizado. De dictionary.com:

estabilizar

[stey-buh-lahyz]

verbo (usado con objeto), estabilizado, estabilizador.

  1. para hacer o mantener estable, firme o firme.

Esto parece apropiado, ya que se desea garantizar el mantenimiento de la condición adecuada de la columna para su uso posterior, cuando se saca del almacenamiento.


Este es un procedimiento de rutina en FPLC para preparar columnas para el almacenamiento. Se utiliza etanol al 20% para prevenir el crecimiento microbiano. Vea esta nota técnica:

Todas las columnas SEC se suministran en etanol al 20% para evitar el crecimiento microbiano.


¿Cómo se pueden limpiar o regenerar las columnas?

El aumento de la contrapresión, los cambios en los tiempos de retención / la pérdida del rendimiento de la columna son síntomas comunes de los depósitos en la frita de entrada de la columna, en la columna o en la superficie de la fase estacionaria. La mayoría de las veces, estos problemas pueden superarse mediante el uso de un procedimiento de lavado correctamente aplicado. Cuanto antes utilice los procedimientos de regeneración de la columna, más posibilidades tendrá de recuperar el rendimiento original de la columna.

Las especies fuertemente adsorbidas se recogen en el extremo de la columna de entrada de disolvente y, en muchos casos, es una ventaja utilizar un flujo inverso durante el lavado. Contrariamente a la creencia popular, invertir el flujo nunca dañará una columna que esté bien empaquetada. La dirección de flujo mencionada suele ser la dirección en la que se empaquetó originalmente la columna. Tenga en cuenta que las sílices originales irregulares / amorfas representan, sin embargo, un posible problema cuando se invierte el flujo ya que entonces es posible una posible reestructuración del lecho empacado. Siempre se debe tener mucho cuidado al invertir el flujo de estas sílices irregulares.

Consulte nuestros procedimientos de regeneración sugeridos para las diferentes familias de fases (RP, NP, intercambio iónico, etc.) y realice la prueba de columna de CoA después de estos procedimientos, en caso de que se restablezca la presión original, para evaluar el rendimiento de la columna / simetría de picos.


12.5.1 Columnas de HPLC

Una HPLC generalmente incluye dos columnas: una columna analítica responsable de la separación y una columna de protección. La columna de protección se coloca antes de la columna analítica, protegiéndola de la contaminación.

Columnas analíticas

El tipo más común de columna de HPLC es un tubo de acero inoxidable con un diámetro interno entre 2,1 mm y 4,6 mm y una longitud entre 30 mm y 300 mm (Figura 12.39). La columna está llena de partículas de sílice porosas 3 & ndash10 & mum con forma irregular o esférica. Las eficiencias típicas de la columna son 40 000 y 60 000 platos teóricos / m. Asumiendo un Vmax/Vmin de aproximadamente 50, una columna de 25 cm con 50 000 platos / m tiene 12 500 platos teóricos y una capacidad máxima de 110.

Puede usar la ecuación 12.16 para estimar la capacidad máxima de una columna y rsquos.

Figura 12.39 Columna empaquetada típica para HPLC. Esta columna en particular tiene un diámetro interno de 4,6 mm y una longitud de 150 mm, y está empaquetada con partículas de 5 & mum recubiertas con una fase estacionaria.

Las columnas capilares usan menos solvente y, debido a que la muestra se diluye en menor grado, producen señales más grandes en el detector. Estas columnas están hechas de capilares de sílice fundida con diámetros internos de 44 & ndash200 & mum y longitudes de 50 & ndash250 mm. Se han preparado columnas capilares llenas de partículas 3 & ndash5 & mum con eficiencias de columna de hasta 250 000 platos teóricos. 10

Una limitación de una columna capilar empaquetada es la contrapresión que se desarrolla cuando se intenta mover la fase móvil a través de los pequeños espacios intersticiales entre el material de empaquetadura del tamaño de una micra en partículas (Figura 12.40). Debido a que los tubos y los accesorios que llevan la fase móvil tienen límites de presión, una contrapresión más alta requiere una tasa de flujo más baja y un tiempo de análisis más largo. Columnas monolíticas, en el que el soporte sólido es una sola varilla porosa, ofrecen eficiencias de columna equivalentes a una columna capilar empaquetada al tiempo que permiten velocidades de flujo más rápidas. Una columna monolítica que suele ser de tamaño similar a una columna empaquetada convencional, aunque también se encuentran disponibles columnas capilares más pequeñas, se prepara formando la varilla monolítica en un molde y cubriéndola con un tubo de PTFE o una resina polimérica. Las varillas monolíticas hechas de un polímero de gel de sílice típicamente tienen macroporos con diámetros de aproximadamente 2 mu m y mesoporos y mdashpores dentro de los macroporos mu mdash con diámetros de aproximadamente 13 nm. 11

Figura 12.40 El empaque de partículas más pequeñas crea espacios intersticiales más pequeños que el empaque de partículas más grandes. Aunque reducir el tamaño de las partículas en 2 & veces aumenta la eficiencia en un factor de 1,4, también produce un aumento de 4 veces en la contrapresión.

Columnas de guardia

Dos problemas tienden a acortar la vida útil de una columna analítica. Primero, los solutos que se unen irreversiblemente a la fase estacionaria degradan el rendimiento de la columna y rsquos al disminuir la fase estacionaria disponible. En segundo lugar, el material particulado inyectado con la muestra puede obstruir la columna analítica. Para minimizar estos problemas colocamos una columna de protección antes de la columna analítica. Columnas de guardia Por lo general, contienen el mismo material de relleno de partículas y la misma fase estacionaria que la columna analítica, pero son significativamente más cortas y menos costosas y tienen una longitud de 7.5 mm y un costo de una décima parte del de la columna analítica correspondiente es típico. Debido a que están diseñadas para ser sacrificadas, las columnas de protección se reemplazan con regularidad.

Si observa detenidamente la figura 12.39, verá la pequeña columna de protección justo encima de la columna analítica.

Fases estacionarias para cromatografía de gases y líquidos

En la cromatografía líquida y líquida, la fase estacionaria es una película líquida que se recubre sobre un material de relleno, típicamente partículas de sílice porosas de 3 & ndash10 & mum. Debido a que la fase estacionaria puede ser parcialmente soluble en la fase móvil, puede eluir o sangrar de la columna con el tiempo. Para evitar la pérdida de la fase estacionaria, que acorta la vida útil de la columna, se une covalentemente a las partículas de sílice. Fases estacionarias unidas se crean haciendo reaccionar las partículas de sílice con un organoclorosilano de la forma general Si (CH3)2RCl, donde R es un grupo alquilo o alquilo sustituido.

Para evitar interacciones no deseadas entre los solutos y cualquier grupo & ndashSiOH restante, Si (CH3)3Se agrega Cl, convirtiendo los sitios que no han reaccionado a & ndashSiOSi (CH3)3 dichas columnas se designan con finalización.

Las propiedades de una fase estacionaria dependen del organosilano y del grupo alquilo rsquos. Si R es un grupo funcional polar, entonces la fase estacionaria es polar. Ejemplos de fases estacionarias polares incluyen aquellas en las que R contiene un ciano (& ndashC2H4CN), un diol (& ndashC3H6OCH2CHOHCH2OH), o un amino (& ndashC3H6NUEVA HAMPSHIRE2) grupo funcional. Debido a que la fase estacionaria es polar, la fase móvil es un disolvente no polar o moderadamente polar. La combinación de una fase estacionaria polar y una fase móvil no polar se llama cromatografía en fase normal.

En cromatografía de fase inversa, que es la forma más común de HPLC, la fase estacionaria es no polar y la fase móvil es polar. Las fases estacionarias apolares más comunes utilizan un organoclorosilano donde el grupo R es un norte-octilo (C8) o norte-octildecilo (C18) cadena de hidrocarburos. La mayoría de las separaciones en fase inversa se llevan a cabo utilizando una solución acuosa tamponada como fase móvil polar, o con otros disolventes polares, como metanol y acetonitrilo. Dado que el sustrato de sílice puede sufrir hidrólisis en soluciones básicas, el pH de la fase móvil debe ser inferior a 7,5.

Puede parecerle extraño que la forma menos común de cromatografía líquida se identifique como fase normal. Tal vez recuerde que uno de los primeros ejemplos de cromatografía fue la separación de pigmentos vegetales de Mikhail Tswett & rsquos utilizando una columna polar de carbonato cálcico y una fase móvil apolar de éter de petróleo. La asignación de lo normal y lo invertido, por lo tanto, tiene que ver con la precedencia.


Reguladores de la señalización de proteína G, Parte B

D.Scott Witherow, Vladlen Z. Slepak, en Métodos en enzimología, 2004

Conclusiones

La purificación de proteínas demostró que se produce la interacción entre las proteínas RGS de la familia Gβ5 y R7 en vivo. Los experimentos de persecución del pulso mostraron que las proteínas Gβ5 y RGS7 no asociadas experimentaron una rápida degradación proteolítica en las células, lo que probablemente proporcionó el mecanismo que mantiene la estequiometría 1: 1 de las subunidades Gβ5 y RGS en las células. Aunque se ha demostrado que Gβ5-RGS7 tiene actividad GAP y regula la señalización mediada por proteína G, los ensayos de reducción no lograron detectar su interacción de unión con las subunidades Gα. Por el contrario, la interacción entre Gβ5 – RGS7 y Gαq Se ha demostrado el uso de FRET en un ensayo basado en células, lo que indica que este enfoque es aplicable a estudios futuros de interacciones Gβ5-RGS con subunidades Gα.


CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA | Cromatografía de afinidad

Introducción

La cromatografía de afinidad se puede definir como un método de cromatografía líquida en el que se usa un agente biológico o ligando biomimético para la retención selectiva de compuestos complementarios. Esta forma de cromatografía líquida fue utilizada originalmente por Starkenstein en 1910 para la purificación de amilasa mediante el uso de almidón como soporte sólido. Este método continuó desarrollándose lentamente durante los siguientes 50 años. Sin embargo, no fue hasta la década de 1960 que se dispuso de soportes adecuados como la agarosa con perlas, tal como la desarrolló Hjerten, así como técnicas de inmovilización relativamente simples para estos soportes. Un avance importante en esta última área fue un informe de 1967 de Axen, Porath y Ernback en el que se informó por primera vez sobre el método del bromuro de cianógeno para la inmovilización de proteínas y péptidos. Este enfoque fue luego utilizado en 1968 por Cuatrecasas, Anfinsen y Wilchek para purificar enzimas mediante el uso de inhibidores enzimáticos inmovilizados. También fue en este momento cuando se propuso el término "cromatografía de afinidad" para describir esta técnica.

La cromatografía de afinidad es relativamente simple de realizar y es una herramienta poderosa para la separación de macromoléculas biológicas. La alta selectividad de este enfoque a menudo permite desarrollar estrategias de purificación de un solo paso, incluso cuando se trabaja con mezclas diluidas y muy complejas. Esta simplicidad y la variedad de ligandos que se pueden usar con este enfoque lo han convertido en una herramienta importante en las separaciones a escala de procesos. Sin embargo, la cromatografía de afinidad moderna también juega un papel importante en el análisis y estudio de sistemas biológicos. Por ejemplo, la mayoría de las formas de cromatografía líquida quiral, como las que utilizan ciclodextrinas inmovilizadas o proteínas séricas, pueden considerarse una subcategoría de la cromatografía de afinidad.


Preguntas del laboratorio 5

3. Fase estacionaria = contiene analito / sistema absorbente, permanece en columna / en placa de TLC
-Fase que no se mueve durante el TLC
-En la cromatografía de columna, es el componente seco de la columna muy compactado.
-normalmente consiste en un adsorbente finamente dividido utilizado en forma de una capa delgada sobre un material de soporte.
-La fase móvil (una solución que contiene la muestra) fluye sobre o a través de la fase estacionaria para efectuar la separación.

-Soluble = Si una sustancia se puede disolver en un líquido.

-Frente del solvente = distancia hasta una placa de TLC que recorre el solvente revelador.
- utilizado para determinar el valor de Rf.

-Cámara de TLC = medio en el que se realiza la TLC.
- Frasco tapado con disolvente de revelado y placa de TLC en posición vertical para evitar el desplazamiento curvo

-Solvente de manchas = disolvente utilizado para disolver el compuesto a analizar.
- A menudo acetato de etilo o cloruro de metileno

-Desarrollo de solvente = solvente en el que se coloca el TLC dentro de la cámara, crea el frente de solvente

-Adsorbente = lo que se aferra al analito, generalmente un sólido
- una capa fina y uniforme de un material seco y finamente pulverizado aplicada a un soporte adecuado

-Rf = Factor de retención: la relación entre la distancia recorrida por el punto y la distancia recorrida por el frente del solvente.


¿Existe un término para un procedimiento en el que la columna de cromatografía se lava con alcohol al 20%? - Biología

Esta página es una introducción a la cromatografía en papel, incluida la cromatografía bidireccional.

Realización de cromatografía en papel

La cromatografía se utiliza para separar mezclas de sustancias en sus componentes. Todas las formas de cromatografía funcionan según el mismo principio.

Todos tienen un fase estacionaria (un sólido o un líquido apoyado sobre un sólido) y un fase móvil (un líquido o un gas). La fase móvil fluye a través de la fase estacionaria y lleva consigo los componentes de la mezcla. Los diferentes componentes viajan a diferentes velocidades. Veremos las razones de esto más adelante en la página.

En la cromatografía de papel, la fase estacionaria es un papel absorbente muy uniforme. La fase móvil es un disolvente líquido adecuado o una mezcla de disolventes.

Producir un cromatograma en papel

Probablemente utilizó la cromatografía en papel como una de las primeras cosas que hizo en química para separar mezclas de tintes de colores, por ejemplo, los tintes que componen una tinta en particular. Es un ejemplo fácil de tomar, así que comencemos desde allí.

Suponga que tiene tres bolígrafos azules y desea averiguar cuál se utilizó para escribir un mensaje. Se manchan muestras de cada tinta sobre una línea de lápiz dibujada en una hoja de papel de cromatografía. Parte de la tinta del mensaje se disuelve en la mínima cantidad posible de un solvente adecuado, y eso también se mancha en la misma línea. En el diagrama, los bolígrafos están etiquetados como 1, 2 y 3, y la tinta del mensaje como M.

Nota: El papel de cromatografía será de hecho blanco puro, no gris pálido. Me veo obligado a mostrarlo como blanquecino debido a la forma en que construyo los diagramas. Todo lo que dibuje como blanco puro permite que se vea el color de fondo de la página.

El papel se suspende en un recipiente con una capa poco profunda de un disolvente adecuado o una mezcla de disolventes. Es importante que el nivel de disolvente esté por debajo de la línea con las manchas. El siguiente diagrama no muestra detalles de cómo se suspende el papel porque hay demasiadas formas posibles de hacerlo y desordena el diagrama. A veces, el papel simplemente se enrolla en un cilindro suelto y se sujeta con clips en la parte superior e inferior. Luego, el cilindro simplemente se coloca en el fondo del contenedor.

La razón para cubrir el recipiente es asegurarse de que la atmósfera del vaso de precipitados esté saturada de vapor de disolvente. La saturación de la atmósfera del vaso de precipitados con vapor evita que el disolvente se evapore a medida que sube por el papel.

A medida que el solvente sube lentamente por el papel, los diferentes componentes de las mezclas de tinta viajan a diferentes velocidades y las mezclas se separan en puntos de diferentes colores.

El diagrama muestra cómo se vería la placa después de que el solvente se haya movido casi hasta la parte superior.

Es bastante fácil ver en el cromatograma final que el bolígrafo que escribió el mensaje contenía los mismos tintes que el bolígrafo 2. También puede ver que el bolígrafo 1 contiene una mezcla de dos tintes azules diferentes, uno de los cuales podría ser el mismo que el tinte único en la pluma 3.

Algunos compuestos en una mezcla viajan casi tan lejos como lo hace el solvente, algunos permanecen mucho más cerca de la línea base. La distancia recorrida en relación con el solvente es una constante para un compuesto en particular, siempre que mantenga todo lo demás constante: el tipo de papel y la composición exacta del solvente, por ejemplo.

La distancia recorrida en relación con el solvente se llama RF valor. Para cada compuesto se puede calcular usando la fórmula:

Por ejemplo, si un componente de una mezcla viajó 9,6 cm desde la línea base mientras que el disolvente había viajado 12,0 cm, entonces el RF el valor de ese componente es:

En el ejemplo que vimos con los distintos bolígrafos, no fue necesario medir RF valores porque está haciendo una comparación directa con solo mirar el cromatograma.

Está asumiendo que si tiene dos puntos en el cromatograma final que son del mismo color y han recorrido la misma distancia en el papel, lo más probable es que sean del mismo compuesto. No es necesariamente cierto, por supuesto, podría tener dos compuestos de colores similares con R muy similarF valores. Veremos cómo puede solucionar ese problema más adelante en la página.

¿Qué pasa si las sustancias que le interesan son incoloras?

En algunos casos, es posible hacer visibles las manchas haciéndolas reaccionar con algo que produzca un producto coloreado. Un buen ejemplo de esto son los cromatogramas producidos a partir de mezclas de aminoácidos.

Suponga que tiene una mezcla de aminoácidos y quiere saber qué aminoácidos en particular contiene la mezcla. Para simplificar, asumiremos que sabe que la mezcla solo puede contener cinco de los aminoácidos comunes.

Se coloca una pequeña gota de una solución de la mezcla en la línea base del papel, y junto a ella se colocan pequeñas manchas similares de los aminoácidos conocidos. A continuación, se coloca el papel en un disolvente adecuado y se deja que se desarrolle como antes. En el diagrama, la mezcla es M y los aminoácidos conocidos están etiquetados del 1 al 5.

La posición del frente del solvente se marca con lápiz y el cromatograma se deja secar y luego se rocía con una solución de ninhidrina. La ninhidrina reacciona con los aminoácidos para dar compuestos coloreados, principalmente marrones o morados.

El diagrama de la izquierda muestra el papel después de que el frente del solvente casi ha llegado a la parte superior. Las manchas siguen siendo invisibles. El segundo diagrama muestra cómo se vería después de rociar con ninhidrina.

No es necesario medir la RF valores porque puede comparar fácilmente las manchas en la mezcla con las de los aminoácidos conocidos, tanto por sus posiciones como por sus colores.

En este ejemplo, la mezcla contiene los aminoácidos etiquetados como 1, 4 y 5.

¿Y si la mezcla contuviera aminoácidos distintos a los que hemos utilizado para comparar? Habría manchas en la mezcla que no coincidían con las de los aminoácidos conocidos. Tendría que volver a ejecutar el experimento utilizando otros aminoácidos para comparar.

Cromatografía de papel bidireccional

La cromatografía en papel bidireccional soluciona el problema de separar sustancias que tienen R muy similaresF valores.

Volveré a hablar de compuestos coloreados porque es mucho más fácil ver lo que está sucediendo. Puede hacer esto perfectamente con compuestos incoloros, ¡pero debe usar mucha imaginación para explicar lo que está sucediendo!

Esta vez se hace un cromatograma a partir de una sola mancha de mezcla colocada hacia un extremo de la línea base. Se coloca en un solvente como antes y se deja hasta que el frente del solvente se acerque a la parte superior del papel.

En el diagrama, la posición del frente del solvente está marcada con lápiz antes de que se seque el papel. Esto está etiquetado como SF1, el frente de solvente para el primer solvente. Usaremos dos disolventes diferentes.

Si observa de cerca, podrá ver que la gran mancha central en el cromatograma es en parte azul y en parte verde. Dos tintes en la mezcla tienen casi la misma RF valores. Por supuesto, ambos podrían haber sido del mismo color, en cuyo caso no se podría saber si había uno o más tintes presentes en ese lugar.

Lo que debe hacer ahora es esperar a que el papel se seque por completo y luego rotarlo 90 ° y desarrollar el cromatograma nuevamente en un solvente diferente.

Es muy poco probable que los dos puntos confusos tengan la misma RF valores tanto en el segundo disolvente como en el primero, por lo que las manchas se moverán en una cantidad diferente.

El siguiente diagrama muestra lo que podría suceder con los distintos puntos del cromatograma original. También se marca la posición del segundo frente de disolvente.

Por supuesto, no verías estos lugares en sus posiciones original y final: ¡se han movido! El cromatograma final se vería así:

La cromatografía bidireccional ha separado completamente la mezcla en cuatro puntos distintos.

Si desea identificar las manchas en la mezcla, obviamente no puede hacerlo con sustancias de comparación en el mismo cromatograma que vimos anteriormente con los ejemplos de bolígrafos o aminoácidos. Terminarías con un lío de manchas sin sentido.

Sin embargo, puedes calcular la RF valores para cada una de las manchas en ambos solventes, y luego compárelos con los valores que ha medido para compuestos conocidos bajo exactamente las mismas condiciones.

¿Cómo funciona la cromatografía en papel?

Aunque la cromatografía en papel es sencilla de realizar, es bastante difícil de explicar en comparación con la cromatografía en capa fina. La explicación depende en cierta medida del tipo de solvente que esté utilizando, y muchas fuentes pasan por alto el problema por completo. Si aún no lo ha hecho, sería útil que pudiera leer la explicación de cómo funciona la cromatografía de capa fina (enlace a continuación). Eso me ahorrará muchas repeticiones y puedo concentrarme en los problemas.

Nota: Encontrará la explicación de cómo funciona la cromatografía en capa fina siguiendo este enlace.

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La estructura esencial del papel

El papel está hecho de fibras de celulosa y la celulosa es un polímero del azúcar simple, la glucosa.

El punto clave sobre la celulosa es que las cadenas de polímero tienen grupos -OH que sobresalen alrededor de ellas. En esa medida, presenta el mismo tipo de superficie que el gel de sílice o la alúmina en la cromatografía de capa fina.

Sería tentador intentar explicar la cromatografía del papel en términos de la forma en que los diferentes compuestos se adsorben en diferentes grados sobre la superficie del papel. En otras palabras, sería bueno poder utilizar la misma explicación para la cromatografía en capa fina y en papel. Desafortunadamente, ¡es más complicado que eso!

La complicación surge porque las fibras de celulosa atraen el vapor de agua de la atmósfera, así como el agua que estaba presente cuando se hizo el papel. Por lo tanto, puede pensar en el papel como fibras de celulosa con una capa muy delgada de moléculas de agua unidas a la superficie.

Es la interacción con esta agua el efecto más importante durante la cromatografía en papel.

Cromatografía en papel utilizando un disolvente no polar.

Suponga que usa un solvente no polar como el hexano para desarrollar su cromatograma.

Las moléculas no polares de la mezcla que está intentando separar tendrán poca atracción por las moléculas de agua adheridas a la celulosa, por lo que pasarán la mayor parte del tiempo disueltas en el disolvente en movimiento. Moléculas como esta, por lo tanto, viajarán mucho por el papel transportado por el solvente. Tendrán R relativamente altoF valores.

Por otro lado, las moléculas polares voluntad tienen una alta atracción por las moléculas de agua y mucho menos por el solvente no polar. Por tanto, tenderán a disolverse en la fina capa de agua alrededor de las fibras de celulosa mucho más que en el disolvente en movimiento.

Debido a que pasan más tiempo disueltos en la fase estacionaria y menos tiempo en la fase móvil, no van a viajar muy rápido por el papel.

La tendencia de un compuesto a dividir su tiempo entre dos disolventes inmiscibles (disolventes como el hexano y el agua que no se mezclan) se conoce como dividir. La cromatografía en papel que utiliza un disolvente no polar es, por tanto, un tipo de cromatografía de partición.

Cromatografía en papel utilizando agua y otros disolventes polares.

Un momento de pensamiento le dirá que la partición no puede ser la explicación si está usando agua como solvente para su mezcla. Si tiene el agua como fase móvil y el agua unida a la celulosa como fase estacionaria, no puede haber ninguna diferencia significativa entre la cantidad de tiempo que una sustancia pasa en solución en cualquiera de ellos. Todas las sustancias deben ser igualmente solubles (o igualmente insolubles) en ambos.

Y, sin embargo, los primeros cromatogramas que hizo probablemente fueron de tintas que utilizan agua como disolvente.

Si el agua funciona como fase móvil además de como fase estacionaria, tiene que haber algún mecanismo bastante diferente en funcionamiento, y eso debe ser igualmente cierto para otros disolventes polares como los alcoholes, por ejemplo. La partición solo ocurre entre solventes que no se mezclan entre sí. Los disolventes polares como los alcoholes pequeños se mezclan con agua.

Al investigar este tema, no he encontrado una explicación fácil de lo que sucede en estos casos. La mayoría de las fuentes ignoran el problema por completo y simplemente citan la explicación de la partición sin tener en cuenta el tipo de solvente que está utilizando. Otras fuentes citan mecanismos que tienen tantos aspectos que son demasiado complicados para este nivel introductorio. Por lo tanto, no voy a llevar esto más lejos, no debería tener que preocuparse por esto en el nivel A del Reino Unido, o sus diversos equivalentes.

Nota: Si me he perdido algo obvio en mi investigación y conoce una explicación sencilla (que valga aproximadamente 1 o 2 puntos en un examen) de lo que sucede con el agua y otros disolventes polares, ¿podría ponerse en contacto conmigo a través de la dirección en la página Acerca de este sitio? .

Preguntas para poner a prueba su comprensión

Si esta es la primera serie de preguntas que ha hecho, lea la página de introducción antes de comenzar. Deberá usar el BOTÓN ATRÁS en su navegador para volver aquí después.


Diferencias entre el uso de acetonitrilo y metanol para la cromatografía de fase inversa

Los disolventes orgánicos más comúnmente utilizados para las fases móviles en la cromatografía inversa son probablemente el acetonitrilo y el metanol. Los precios de lista (ejemplos) para los reactivos comerciales de estos disolventes se indican a continuación.

Como se muestra, el acetonitrilo es muy caro, particularmente para el grado LC. Sin embargo, las condiciones analíticas indicadas en los materiales de referencia y por los fabricantes de LC utilizan con mayor frecuencia acetonitrilo. ¿Porqué es eso? Ese es el tema de esta página.

2. Absorbancia: el acetonitrilo de grado LC es el más bajo

Las Figuras 1 y 2 son espectros de absorción para LC y grados especiales de reactivos comerciales de acetonitrilo y metanol, respectivamente. El grado LC significa que se han eliminado las impurezas que absorben la luz ultravioleta (no que la pureza absoluta sea mayor) y que la absorbancia de longitudes de onda especificadas se mantiene dentro de un rango especificado. Las figuras muestran que, de estos cuatro reactivos, el acetonitrilo de grado LC tiene la absorbancia más baja, especialmente para longitudes de onda más cortas. Dado que cuanto menor es la absorbancia de un disolvente orgánico utilizado para las fases móviles, menor es el ruido en la detección de UV, el El acetonitrilo de grado LC es el más adecuado para análisis de alta sensibilidad en longitudes de onda UV cortas. Además, el acetonitrilo de grado LC da como resultado menos pico fantasma para las líneas de base del gradiente. Aunque existen varios otros disolventes orgánicos con una alta compatibilidad con el agua, aparentemente ninguno tiene menor absorción que el acetonitrilo de grado LC.

Como digresión, a continuación se describe un ejemplo de un problema que ocurrió con respecto a los grados de los reactivos. Cierta persona, el "Sr. A", estaba midiendo efedrina en efedra a 210 nm, pero solo pudo obtener datos con mayor ruido que su predecesor. Después de desanimarse por sus habilidades analíticas, volvió a preguntarle al predecesor sobre el análisis y se enteró de que el predecesor había usado acetonitrilo de grado LC, mientras que el Sr. A había estado usando un grado especial, debido al costo. Le costaba usar una fase móvil con un valor de fondo varias decenas de veces mayor que el del grado LC. Según se informa, después de eso, estableció una regla estricta de describir siempre el fabricante y el grado del reactivo en condiciones analíticas.
En el caso del metanol, no hay una diferencia significativa en los espectros de LC y grados especiales, pero la absorbancia no está garantizada para el grado especial, por lo que es más probable que tenga una mayor variabilidad. Dado que el precio no es tan diferente, el grado LC debe usarse siempre que sea posible.

3. Presión: el acetonitrilo es menor

La presión experimentada por las columnas varía según el tipo y la proporción de mezcla de disolventes orgánicos. La Figura 3 muestra la relación entre la relación de la mezcla y la presión de suministro para las mezclas de agua / acetonitrilo y agua / metanol. La presión para el metanol aumenta cuando se mezcla con agua, pero no tanto para el acetonitrilo. Como consecuencia, dado el mismo caudal, las soluciones a base de acetonitrilo aplican menos presión a la columna. Basándonos en los dos temas discutidos anteriormente, hemos confirmado las razones para usar acetonitrilo. Sin embargo, ¿tiene el metanol alguna ventaja además del precio? Continuamos nuestra comparación a continuación.

4. Fuerza de elución: el acetonitrilo es generalmente más alto

Cuando se mezclan respectivamente acetonitrilo y metanol con agua en la misma proporción, la solución a base de acetonitrilo tiene generalmente una mayor fuerza de elución. En particular, en algunos casos donde la proporción de la mezcla es baja, se pueden lograr los mismos tiempos de retención usando acetonitrilo con menos de la mitad de la proporción de metanol, como se puede ver para la cafeína y los fenoles (Figura 4).
Por otro lado, para los disolventes orgánicos al 100% o muy cerca del 100%, el metanol a menudo tiene una mayor fuerza de elución, como puede verse para el caroteno y el colesterol (Figura 5). Las propiedades de las soluciones de mezcla pueden ser difíciles de comprender, pero en casos como este, las propiedades (polaridades) de los disolventes individuales parecen pasar a primer plano.
Para proporciones de mezcla más extremas, como 50: 1, cualquier error del operador durante la preparación puede tener un efecto significativo en los tiempos de retención o aumentar el tiempo para alcanzar el equilibrio. Si esto ocurre con una solución a base de acetonitrilo, el uso de metanol permitirá usar una proporción menor, como 10: 1, lo que puede facilitar la preparación.

5. Selectividad de separación (elución): difiere para cada uno

La selectividad de separación difiere para acetonitrilo y metanol. El ejemplo de la Figura 6 muestra que el orden de elución del fenol y el ácido benzoico se invierte. (Sin embargo, para altas proporciones de agua, el fenol se eluye primero incluso para soluciones a base de acetonitrilo). Esto se debe presumiblemente a diferencias en las propiedades químicas de las moléculas de solvente orgánico. (El metanol y el etanol son próticos, pero el acetonitrilo y el tetrahidrofurano son apróticos). En consecuencia, si el acetonitrilo no proporciona una selectividad de separación adecuada, pruebe con metanol.

6. Forma de pico: a veces hay diferencias

En el caso de compuestos como el ácido salicílico (fenol con grupo carboxilo o metoxi en posición orto), el acetonitrilo puede provocar una formación de colas significativa, que podría suprimirse mediante el uso de metanol. This is probably caused by differences in the way the mobile phases relate to the mutual interaction (adsorption) between the silica surfaces and target components, due to the chemical properties of the organic solvent molecules.
Also, polymer-based reversed-phase columns generally tend to result in broader peaks than silica-based columns. This is particularly common for aromatic compounds in polystyrene columns. This is especially noticeable when using methanol-based mobile phases, whereas it is not very noticeable for acetonitrile-based mobile phases. Consequently, the latter is recommended for polymer reversed phase columns. The reason is presumably because of an affinity of organic solvents for gels, which causes the pore structure to change.

7. Mobile Phase Degassing - Use Caution With Acetonitrile

The following discusses preparing solvent mixtures ahead of time, in a mobile phase bottle (isocratic), instead of inside the LC system.
When methanol is mixed with water, it releases heat, which tends to facilitate releasing any extraneous dissolved air as bubbles (facilitates degassing). In contrast, acetonitrile cools the temperature by absorbing heat, so air bubbles are generated later, as it gradually returns to room temperature. Consequently, more care is required with respect to degassing. (Refer to LCtalk Special Issue 5 regarding heated stirring, membrane degassers, helium purging, and so on).

8. Resumen

The organic solvents most commonly used for mobile phases in reverse chromatography, acetonitrile and methanol, were compared. In general, using LC grade acetonitrile is the safest choice. If selectivity or peak shape is poor, try LC grade methanol, but it can also be effective to set analytical conditions by carefully considering the properties of each solvent.


RESULTS AND DISCUSSION

Fig. 1 outlines the general strategy of the practical protocol in a flow chart. Fig. 2 shows the elution profile of 40–60% ammonium sulfate precipitation protein that was loaded onto a Superdex G-75 column (500 μg of concentrated protein was applied to the column) and eluted out with 10 m M Tris-HCl buffer (pH 7.8). The fractions obtained were tested for their inhibitory activity by the dot-blot method. The tubes (numbers 41–52) showed the inhibitory activity. These tubes were used for electrophoretic analysis.

Fig. 3 shows the gel-x-r ay film contact print photograph. Lane 1 shows the crude extract, lane 2 shows the 0–40% ammonium sulfate precipitation, lane 3 shows the 40–60% ammonium sulfate precipitation, and lane 4 shows the 60–90% ammonium sulfate precipitation. These results show that the crude extract contained all the inhibitors (es decir. trypsin and chymotrypsin inhibitors) and that the ammonium sulfate fractions showed different isoforms of inhibitors. In particular, the 40–60% ammonium sulfate-precipitated protein showed more specific inhibition toward trypsin than chymotrypsin. Similarly the 60–90% fraction had more affinity for chymotrypsin inhibition. Therefore, from the above observations, we can designate the 40–60%-saturated protein as trypsin inhibitors and the 60–90%-saturated proteins as chymotrypsin inhibitors (in vitro analysis confirms these results). It is evident that the inhibitory activity is distributed among the different isoforms of inhibitors in the legume seeds.

Fig. 4 shows the electrophoretically separated gel filtration fractions (numbers 41–52). These fractions were loaded onto a gel (non-denaturing) and were stained for activity using 0.1% trypsin as a substrate. It was observed that there are about six to eight isoinhibitors depending upon the time of development. No extra bands were detected even when the gel was incubated with the x-ray films for more than 30 min.

There are several reported methods of visualization of protease inhibitors [ 19 ]. The method we described here requires neither ampholytes nor synthetic substrates, so it is cheaper and more convenient. Preparation of gels is simpler than in methods that incorporate substrates in a gel [ 7 ]. X-ray films can be stored as records, and an immediate photograph is not essential. The time required for visualization on inhibitor bands is much shorter (less than 1 h for non-SDS and 2 h for SDS-PAGE) than are most other methods. The protease solution used for visualizing inhibitor bands in the gel can be reused several times, and therefore, the amount of proteases required is much less than in methods involving agarose overlaying [ 20 ]. The protease concentrations for the visualization of protease inhibitors in gels are only indicators of the range, as the protease concentrations and solution volume are changed by repeated use of the same solution. More protease can be added to the used protease solution to restore the activity and the volume to the desired level.

This method is fairly reliable, and gel storage does not appear to cause a serious problem. This method can be applied for visualization of isoelectrophoretically separated protease inhibitors and estimation of their isoelectric points. 2 2 K. Sudheendra, unpublished data. The use of single side-coated x-ray films will obviate the need to remove the coating on one side of the two side-coated film. The inhibitor activity bands are clearly visible even without removing the gelatin coating on the other side of the film. However, removal of coating on the other side of the film improves the contrast for developing the x-ray film.

With exposure to x-ray film and rinsing the gel, the protease concentration goes down, and lower inhibitory activity bands become visible. However, under these conditions higher inhibitory activity bands appear much thicker and broader. So exposing the same gel a few times to fresh films allows the detection of even closely spaced, high activity bands in the beginning and the low activity bands in the later exposures. High activity inhibitor bands can be resolved by increasing, and low activity inhibitor bands by decreasing, gel-x-r ay film incubation time. Even after several exposures, the same gel can be incubated again in protease solution, and inhibitor bands can be visualized.

However, visualization of poorly resolved or closely spaced high and low inhibitory activity bands will be difficult with this method. Protease inhibitors can be detected using photographic paper instead of x-ray film. However, paper needs to be incubated with the x-ray film for a longer time. X-ray film is more sensitive than photographic paper.

Based on our experience with this assay to detect protease inhibitors, there appears to be little variation between different lots of films (x-ray). The results are immediately available after electrophoresis and are rapid and reproducible (after electrophoresis the results can be observed on x-ray film within 1 h). Also this method is inexpensive a box of 25 films (20 × 25 cm) can accommodate up to 50 assays ($5.00 per box). The presence of a well defined end point and the simplicity of the experiment allows this experiment to be carried out by undergraduate and graduate students.


Contenido

Ion chromatography has advanced through the accumulation of knowledge over a course of many years. Starting from 1947, Spedding and Powell used displacement ion-exchange chromatography for the separation of the rare earths. Additionally, they showed the ion-exchange separation of 14N and 15N isotopes in ammonia. At the start of the 1950s, Kraus and Nelson demonstrated the use of many analytical methods for metal ions dependent on their separation of their chloride, fluoride, nitrate or sulfate complexes by anion chromatography. Automatic in-line detection was progressively introduced from 1960 to 1980 as well as novel chromatographic methods for metal ion separations. A groundbreaking method by Small, Stevens and Bauman at Dow Chemical Co. unfolded the creation of the modern ion chromatography. Anions and cations could now be separated efficiently by a system of suppressed conductivity detection. In 1979, a method for anion chromatography with non-suppressed conductivity detection was introduced by Gjerde et al. Following it in 1980, was a similar method for cation chromatography. [10]

As a result, a period of extreme competition began within the IC market, with supporters for both suppressed and non-suppressed conductivity detection. This competition led to fast growth of new forms and the fast evolution of IC. [11] A challenge that needs to be overcome in the future development of IC is the preparation of highly efficient monolithic ion-exchange columns and overcoming this challenge would be of great importance to the development of IC. [12]

The boom of Ion exchange chromatography primarily began between 1935–1950 during World War II and it was through the "Manhattan project" that applications and IC were significantly extended. Ion chromatography was originally introduced by two English researchers, agricultural Sir Thompson and chemist J T Way. The works of Thompson and Way involved the action of water-soluble fertilizer salts, ammonium sulfate and potassium chloride. These salts could not easily be extracted from the ground due to the rain. They performed ion methods to treat clays with the salts, resulting in the extraction of ammonia in addition to the release of calcium. [13] [ fuente poco confiable? ] It was in the fifties and sixties that theoretical models were developed for IC for further understanding and it was not until the seventies that continuous detectors were utilized, paving the path for the development from low-pressure to high-performance chromatography. Not until 1975 was "ion chromatography" established as a name in reference to the techniques, and was thereafter used as a name for marketing purposes. Today IC is important for investigating aqueous systems, such as drinking water. It is a popular method for analyzing anionic elements or complexes that help solve environmentally relevant problems. Likewise, it also has great uses in the semiconductor industry.

Because of the abundant separating columns, elution systems, and detectors available, chromatography has developed into the main method for ion analysis. [14]

When this technique was initially developed, it was primarily used for water treatment. Since 1935, ion exchange chromatography rapidly manifested into one of the most heavily leveraged techniques, with its principles often being applied to majority of fields of chemistry, including distillation, adsorption, and filtration. [15]

Ion-exchange chromatography separates molecules based on their respective charged groups. Ion-exchange chromatography retains analyte molecules on the column based on coulombic (ionic) interactions. The ion exchange chromatography matrix consists of positively and negatively charged ions. [16] Essentially, molecules undergo electrostatic interactions with opposite charges on the stationary phase matrix. The stationary phase consists of an immobile matrix that contains charged ionizable functional groups or ligands. [17] The stationary phase surface displays ionic functional groups (R-X) that interact with analyte ions of opposite charge. To achieve electroneutrality, these inert charges couple with exchangeable counterions in the solution. Ionizable molecules that are to be purified compete with these exchangeable counterions for binding to the immobilized charges on the stationary phase. These ionizable molecules are retained or eluted based on their charge. Initially, molecules that do not bind or bind weakly to the stationary phase are first to wash away. Altered conditions are needed for the elution of the molecules that bind to the stationary phase. The concentration of the exchangeable counterions, which competes with the molecules for binding, can be increased or the pH can be changed. A change in pH affects the charge on the particular molecules and, therefore, alters binding. The molecules then start eluting out based on the changes in their charges from the adjustments. Further such adjustments can be used to release the protein of interest. Additionally, concentration of counterions can be gradually varied to separate ionized molecules. This type of elution is called gradient elution. On the other hand, step elution can be used in which the concentration of counterions are varied in one step. [1] This type of chromatography is further subdivided into cation exchange chromatography and anion-exchange chromatography. Positively charged molecules bind to cation exchange resins while negatively charged molecules bind to anion exchange resins. [18] The ionic compound consisting of the cationic species M+ and the anionic species B- can be retained by the stationary phase.

Cation exchange chromatography retains positively charged cations because the stationary phase displays a negatively charged functional group:

Anion exchange chromatography retains anions using positively charged functional group:

Note that the ion strength of either C+ or A- in the mobile phase can be adjusted to shift the equilibrium position, thus retention time.

The ion chromatogram shows a typical chromatogram obtained with an anion exchange column.

Before ion-exchange chromatography can be initiated, it must be equilibrated. The stationary phase must be equilibrated to certain requirements that depend on the experiment that you are working with. Once equilibrated, the charged ions in the stationary phase will be attached to its opposite charged exchangeable ions. Exchangeable ions such as Cl- or Na+. Next, a buffer should be chosen in which the desired protein can bind to. After equilibration, the column needs to be washed. The washing phase will help elute out all impurities that does not bind to the matrix while the protein of interest remains bounded. This sample buffer needs to have the same pH as the buffer used for equilibration to help bind the desired proteins. Uncharged proteins will be eluted out of the column at a similar speed of the buffer flowing through the column. Once the sample has been loaded onto to the column and the column has been washed with the buffer to elute out all non-desired proteins, elution is carried out to elute the desired proteins that are bound to the matrix. Bound proteins are eluted out by utilizing a gradient of linearly increasing salt concentration. With increasing ionic strength of the buffer, the salt ions will compete with the desired proteins in order to bind to charged groups on the surface of the medium. This will cause desired proteins to be eluted out of the column. Proteins that have a low net charge will be eluted out first as the salt concentration increases causing the ionic strength to increase. Proteins with high net charge will need a higher ionic strength for them to be eluted out of the column. [16] It is possible to perform ion exchange chromatography in bulk, on thin layers of medium such as glass or plastic plates coated with a layer of the desired stationary phase, or in chromatography columns. Thin layer chromatography or column chromatography share similarities in that they both act within the same governing principles there is constant and frequent exchange of molecules as the mobile phase travels along the stationary phase. It is not imperative to add the sample in minute volumes as the predetermined conditions for the exchange column have been chosen so that there will be strong interaction between the mobile and stationary phases. Furthermore, the mechanism of the elution process will cause a compartmentalization of the differing molecules based on their respective chemical characteristics. This phenomenon is due to an increase in salt concentrations at or near the top of the column, thereby displacing the molecules at that position, while molecules bound lower are released at a later point when the higher salt concentration reaches that area. These principles are the reasons that ion exchange chromatography is an excellent candidate for initial chromatography steps in a complex purification procedure as it can quickly yield small volumes of target molecules regardless of a greater starting volume. [2]

Comparatively simple devices are often used to apply counterions of increasing gradient to a chromatography column. Counterions such as copper (II) are chosen most often for effectively separating peptides and amino acids through complex formation. [19]

A simple device can be used to create a salt gradient. Elution buffer is consistently being drawn from the chamber into the mixing chamber, thereby altering its buffer concentration. Generally, the buffer placed into the chamber is usually of high initial concentration, whereas the buffer placed into the stirred chamber is usually of low concentration. As the high concentration buffer from the left chamber is mixed and drawn into the column, the buffer concentration of the stirred column gradually increase. Altering the shapes of the stirred chamber, as well as of the limit buffer, allows for the production of concave, linear, or convex gradients of counterion.

A multitude of different mediums are used for the stationary phase. Among the most common immobilized charged groups used are trimethylaminoethyl (TAM), triethylaminoethyl (TEAE), diethyl-2-hydroxypropylaminoethyl (QAE), aminoethyl (AE), diethylaminoethyl (DEAE), sulpho (S), sulphomethyl (SM), sulphopropyl (SP), carboxy (C), and carboxymethyl (CM). [1]

Successful packing of the column is an important aspect of ion chromatography. Stability and efficiency of a final column depends on packing methods, solvent used, and factors that affect mechanical properties of the column. In contrast to early inefficient dry- packing methods, wet slurry packing, in which particles that are suspended in an appropriate solvent are delivered into a column under pressure, shows significant improvement. Three different approaches can be employed in performing wet slurry packing: the balanced density method (solvent’s density is about that of porous silica particles), the high viscosity method (a solvent of high viscosity is used), and the low viscosity slurry method (performed with low viscosity solvents). [20]

Polystyrene is used as a medium for ion- exchange. It is made from the polymerization of styrene with the use of divinylbenzene and benzoyl peroxide. Such exchangers form hydrophobic interactions with proteins which can be irreversible. Due to this property, polystyrene ion exchangers are not suitable for protein separation. They are used on the other hand for the separation of small molecules in amino acid separation and removal of salt from water. Polystyrene ion exchangers with large pores can be used for the separation of protein but must be coated with a hydrophilic substance. [21]

Cellulose based medium can be used for the separation of large molecules as they contain large pores. Protein binding in this medium is high and has low hydrophobic character. DEAE is an anion exchange matrix that is produced from a positive side group of diethylaminoethyl bound to cellulose or Sephadex. [22]

Agarose gel based medium contain large pores as well but their substitution ability is lower in comparison to dextrans. The ability of the medium to swell in liquid is based on the cross-linking of these substances, the pH and the ion concentrations of the buffers used. [21]

Incorporation of high temperature and pressure allows a significant increase in the efficiency of ion chromatography, along with a decrease in time. Temperature has an influence of selectivity due to its effects on retention properties. The retention factor (k = (tR g − tMETRO g )/(tMETRO g − text)) increases with temperature for small ions, and the opposite trend is observed for larger ions. [23] [24]

Despite ion selectivity in different mediums, further research is being done to perform ion exchange chromatography through the range of 40–175 °C. [25]

An appropriate solvent can be chosen based on observations of how column particles behave in a solvent. Using an optical microscope, one can easily distinguish a desirable dispersed state of slurry from aggregated particles. [20]

A "strong" ion exchanger will not lose the charge on its matrix once the column is equilibrated and so a wide range of pH buffers can be used. "Weak" ion exchangers have a range of pH values in which they will maintain their charge. If the pH of the buffer used for a weak ion exchange column goes out of the capacity range of the matrix, the column will lose its charge distribution and the molecule of interest may be lost. [26] Despite the smaller pH range of weak ion exchangers, they are often used over strong ion exchangers due to their having greater specificity. In some experiments, the retention times of weak ion exchangers are just long enough to obtain desired data at a high specificity. [27]

Resins (often termed 'beads') of ion exchange columns may include functional groups such as weak/strong acids and weak/strong bases. There are also special columns that have resins with amphoteric functional groups that can exchange both cations and anions. [28] Some examples of functional groups of strong ion exchange resins are quaternary ammonium cation (Q), which is an anion exchanger, and sulfonic acid (S, -SO2OH), which is a cation exchanger. [29] These types of exchangers can maintain their charge density over a pH range of 0–14. Examples of functional groups of Weak ion exchange resins include diethylaminoethyl (DEAE, -C2H4N(CH2H5)2), which is an anion exchanger, and carboxymethyl (CM, -CH2-COOH), [30] which is a cation exchanger. These two types of exchangers can maintain the charge density of their columns over a pH range of 5–9. [ cita necesaria ]

In ion chromatography, the interaction of the solute ions and the stationary phase based on their charges determines which ions will bind and to what degree. When the stationary phase features positive groups which attracts anions, it is called an anion exchanger when there are negative groups on the stationary phase, cations are attracted and it is a cation exchanger. [31] The attraction between ions and stationary phase also depends on the resin, organic particles used as ion exchangers.

Each resin features relative selectivity which varies based on the solute ions present who will compete to bind to the resin group on the stationary phase. The selectivity coefficient, the equivalent to the equilibrium constant, is determined via a ratio of the concentrations between the resin and each ion, however, the general trend is that ion exchangers prefer binding to the ion with a higher charge, smaller hydrated radius, and higher polarizability, or the ability for the electron cloud of an ion to be disrupted by other charges. [32] Despite this selectivity, excess amounts of an ion with a lower selectivity introduced to the column would cause the lesser ion to bind more to the stationary phase as the selectivity coefficient allows fluctuations in the binding reaction that takes place during ion exchange chromatography.

Following table shows the commonly used ion exchangers [33]

Sr. No Nombre Escribe Grupo funcional
1 DEAE Cellulose (Anion exchanger) Weakly basic DEAE (Diethylaminoethyl)
2 QAE Sephadex (Anion exchanger) Strongly basic QAE (Quaternary aminoethyl)
3 Q Sepharose (Anion exchanger) Strongly basic Q (Quaternary ammonium)
4 CM- Cellulose (Cation exchanger) Weakly acidic CM (Carboxymethyl)
5 SP Sepharose (Cation exchanger) Strongly acidic SP (Sulfopropyl)
6 SOURCE S (Cation exchanger) Strongly acidic S (Methyl sulfate)

A sample is introduced, either manually or with an autosampler, into a sample loop of known volume. A buffered aqueous solution known as the mobile phase carries the sample from the loop onto a column that contains some form of stationary phase material. This is typically a resin or gel matrix consisting of agarose or cellulose beads with covalently bonded charged functional groups. Equilibration of the stationary phase is needed in order to obtain the desired charge of the column. If the column is not properly equilibrated the desired molecule may not bind strongly to the column. The target analytes (anions or cations) are retained on the stationary phase but can be eluted by increasing the concentration of a similarly charged species that displaces the analyte ions from the stationary phase. For example, in cation exchange chromatography, the positively charged analyte can be displaced by adding positively charged sodium ions. The analytes of interest must then be detected by some means, typically by conductivity or UV/visible light absorbance.

Control an IC system usually requires a chromatography data system (CDS). In addition to IC systems, some of these CDSs can also control gas chromatography (GC) and HPLC.

A type of ion exchange chromatography, membrane exchange [34] [35] is a relatively new method of purification designed to overcome limitations of using columns packed with beads. Membrane Chromatographic [36] [37] devices are cheap to mass-produce and disposable unlike other chromatography devices that require maintenance and time to revalidate. There are three types of membrane absorbers that are typically used when separating substances. The three types are flat sheet, hollow fibre, and radial flow. The most common absorber and best suited for membrane chromatography is multiple flat sheets because it has more absorbent volume. It can be used to overcome mass transfer limitations [38] and pressure drop, [39] making it especially advantageous for isolating and purifying viruses, plasmid DNA, and other large macromolecules. The column is packed with microporous membranes with internal pores which contain adsorptive moieties that can bind the target protein. Adsorptive membranes are available in a variety of geometries and chemistry which allows them to be used for purification and also fractionation, concentration, and clarification in an efficiency that is 10 fold that of using beads. [40] Membranes can be prepared through isolation of the membrane itself, where membranes are cut into squares and immobilized. A more recent method involved the use of live cells that are attached to a support membrane and are used for identification and clarification of signaling molecules. [41]

Ion exchange chromatography can be used to separate proteins because they contain charged functional groups. The ions of interest (in this case charged proteins) are exchanged for another ions (usually H + ) on a charged solid support. The solutes are most commonly in a liquid phase, which tends to be water. Take for example proteins in water, which would be a liquid phase that is passed through a column. The column is commonly known as the solid phase since it is filled with porous synthetic particles that are of a particular charge. These porous particles are also referred to as beads, may be aminated (containing amino groups) or have metal ions in order to have a charge. The column can be prepared using porous polymers, for macromolecules over 100,000 the optimum size of the porous particle is about 1 μm 2 . This is because slow diffusion of the solutes within the pores does not restrict the separation quality. [42] The beads containing positively charged groups, which attract the negatively charged proteins, are commonly referred to as anion exchange resins. The amino acids that have negatively charged side chains at pH 7 (pH of water) are glutamate and aspartate. The beads that are negatively charged are called cation exchange resins, as positively charged proteins will be attracted. The amino acids that have positively charged side chains at pH 7 are lysine, histidine and arginine. [43]

The isoelectric point is the pH at which a compound - in this case a protein - has no net charge. A protein’s isoelectric point or PI can be determined using the pKa of the side chains, if the amino (positive chain) is able to cancel out the carboxyl (negative) chain, the protein would be at its PI. Using buffers instead of water for proteins that do not have a charge at pH 7, is a good idea as it enables the manipulation of pH to alter ionic interactions between the proteins and the beads. [44] Weakly acidic or basic side chains are able to have a charge if the pH is high or low enough respectively. Separation can be achieved based on the natural isoelectric point of the protein. Alternatively a peptide tag can be genetically added to the protein to give the protein an isoelectric point away from most natural proteins (e.g., 6 arginines for binding to a cation-exchange resin or 6 glutamates for binding to an anion-exchange resin such as DEAE-Sepharose).

Elution by increasing ionic strength of the mobile phase is more subtle. It works because ions from the mobile phase interact with the immobilized ions on the stationary phase, thus "shielding" the stationary phase from the protein, and letting the protein elute.

Elution from ion-exchange columns can be sensitive to changes of a single charge- chromatofocusing. Ion-exchange chromatography is also useful in the isolation of specific multimeric protein assemblies, allowing purification of specific complexes according to both the number and the position of charged peptide tags. [45] [46]

Gibbs–Donnan effect Edit

In ion exchange chromatography, the Gibbs–Donnan effect is observed when the pH of the applied buffer and the ion exchanger differ, even up to one pH unit. For example, in anion-exchange columns, the ion exchangers repeal protons so the pH of the buffer near the column differs is higher than the rest of the solvent. [47] As a result, an experimenter has to be careful that the protein(s) of interest is stable and properly charged in the "actual" pH.

This effect comes as a result of two similarly charged particles, one from the resin and one from the solution, failing to distribute properly between the two sides there is a selective uptake of one ion over another. [48] [49] For example, in a sulphonated polystyrene resin, a cation exchange resin, the chlorine ion of a hydrochloric acid buffer should equilibrate into the resin. However, since the concentration of the sulphonic acid in the resin is high, the hydrogen of HCl has no tendency to enter the column. This, combined with the need of electroneutrality, leads to a minimum amount of hydrogen and chlorine entering the resin. [49]

Clinical utility Edit

A use of ion chromatography can be seen in the argentation ion chromatography. [ cita necesaria ] Usually, silver and compounds containing acetylenic and ethylenic bonds have very weak interactions. This phenomenon has been widely tested on olefin compounds. The ion complexes the olefins make with silver ions are weak and made based on the overlapping of pi, sigma, and d orbitals and available electrons therefore cause no real changes in the double bond. This behavior was manipulated to separate lipids, mainly fatty acids from mixtures in to fractions with differing number of double bonds using silver ions. The ion resins were impregnated with silver ions, which were then exposed to various acids (silicic acid) to elute fatty acids of different characteristics.

Detection limits as low as 1 μM can be obtained for alkali metal ions. [50] It may be used for measurement of HbA1c, porphyrin and with water purification. Ion Exchange Resins(IER) have been widely used especially in medicines due to its high capacity and the uncomplicated system of the separation process. One of the synthetic uses is to use Ion Exchange Resins for kidney dialysis. This method is used to separate the blood elements by using the cellulose membraned artificial kidney. [51]

Another clinical application of ion chromatography is in the rapid anion exchange chromatography technique used to separate creatine kinase (CK) isoenzymes from human serum and tissue sourced in autopsy material (mostly CK rich tissues were used such as cardiac muscle and brain). [ cita necesaria ] These isoenzymes include MM, MB, and BB, which all carry out the same function given different amino acid sequences. The functions of these isoenzymes are to convert creatine, using ATP, into phosphocreatine expelling ADP. Mini columns were filled with DEAE-Sephadex A-50 and further eluted with tris- buffer sodium chloride at various concentrations (each concentration was chosen advantageously to manipulate elution). Human tissue extract was inserted in columns for separation. All fractions were analyzed to see total CK activity and it was found that each source of CK isoenzymes had characteristic isoenzymes found within. Firstly, CK- MM was eluted, then CK-MB, followed by CK-BB. Therefore, the isoenzymes found in each sample could be used to identify the source, as they were tissue specific.

Using the information from results, correlation could be made about the diagnosis of patients and the kind of CK isoenzymes found in most abundant activity. From the finding, about 35 out of 71 patients studied suffered from heart attack (myocardial infarction) also contained an abundant amount of the CK-MM and CK-MB isoenzymes. Findings further show that many other diagnosis including renal failure, cerebrovascular disease, and pulmonary disease were only found to have the CK-MM isoenzyme and no other isoenzyme. The results from this study indicate correlations between various diseases and the CK isoenzymes found which confirms previous test results using various techniques. Studies about CK-MB found in heart attack victims have expanded since this study and application of ion chromatography.

Industrial applications Edit

Since 1975 ion chromatography has been widely used in many branches of industry. The main beneficial advantages are reliability, very good accuracy and precision, high selectivity, high speed, high separation efficiency, and low cost of consumables. The most significant development related to ion chromatography are new sample preparation methods improving the speed and selectivity of analytes separation lowering of limits of detection and limits of quantification extending the scope of applications development of new standard methods miniaturization and extending the scope of the analysis of a new group of substances. Allows for quantitative testing of electrolyte and proprietary additives of electroplating baths. [52] It is an advancement of qualitative hull cell testing or less accurate UV testing. Ions, catalysts, brighteners and accelerators can be measured. [52] Ion exchange chromatography has gradually become a widely known, universal technique for the detection of both anionic and cationic species. Applications for such purposes have been developed, or are under development, for a variety of fields of interest, and in particular, the pharmaceutical industry. The usage of ion exchange chromatography in pharmaceuticals has increased in recent years, and in 2006, a chapter on ion exchange chromatography was officially added to the United States Pharmacopia-National Formulary (USP-NF). Furthermore, in 2009 release of the USP-NF, the United States Pharmacopia made several analyses of ion chromatography available using two techniques: conductivity detection, as well as pulse amperometric detection. Majority of these applications are primarily used for measuring and analyzing residual limits in pharmaceuticals, including detecting the limits of oxalate, iodide, sulfate, sulfamate, phosphate, as well as various electrolytes including potassium, and sodium. In total, the 2009 edition of the USP-NF officially released twenty eight methods of detection for the analysis of active compounds, or components of active compounds, using either conductivity detection or pulse amperometric detection. [53]

Drug development Edit

There has been a growing interest in the application of IC in the analysis of pharmaceutical drugs. IC is used in different aspects of product development and quality control testing. For example, IC is used to improve stabilities and solubility properties of pharmaceutical active drugs molecules as well as used to detect systems that have higher tolerance for organic solvents. IC has been used for the determination of analytes as a part of a dissolution test. For instance, calcium dissolution tests have shown that other ions present in the medium can be well resolved among themselves and also from the calcium ion. Therefore, IC has been employed in drugs in the form of tablets and capsules in order to determine the amount of drug dissolve with time. [54] IC is also widely used for detection and quantification of excipients or inactive ingredients used in pharmaceutical formulations. Detection of sugar and sugar alcohol in such formulations through IC has been done due to these polar groups getting resolved in ion column. IC methodology also established in analysis of impurities in drug substances and products. Impurities or any components that are not part of the drug chemical entity are evaluated and they give insights about the maximum and minimum amounts of drug that should be administered in a patient per day. [55]



Comentarios:

  1. Voodoosar

    hacer algo

  2. Juktilar

    ¡gracias!

  3. Jonam

    Sí, en serio. Entonces sucede. Podemos comunicarnos sobre este tema.



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