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La extracción de ADN de plantas y algas no usa fenol. ¿Por qué?

La extracción de ADN de plantas y algas no usa fenol. ¿Por qué?



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No sé si este es el lugar correcto para hacer esta pregunta, pero he notado que los protocolos para la extracción de ADN de organismos fotosintéticos no usan fenol. Solo CTAB / Cloroformo.

¿Por qué?

Porque las extracciones bacterianas o animales son fenol: a base de cloroformo.

Gracias


CTAB es para eliminar polifenoles y polisacáridos que se encuentran en los tejidos vegetales. Las células / bacterias animales no las tienen. Puede hacer una extracción adicional de fenol-cloroformo si lo desea.

Vea este protocolo de Monsanto.

  1. Pese 6 g de tejido procesado en un tubo cónico de 50 ml apropiado para centrifugación. Nota: Para el tejido sin procesar, el pesaje puede ocurrir antes del procesamiento, siempre y cuando toda la muestra procesada se transfiera al tubo cónico.

  2. Por cada muestra de 6 g, agregue 25 ml de una solución que consta de 24,25 ml de tampón de extracción CTAB precalentado (55 ° C), 0,5 ml de 2-mercaptoetanol (2-ME) y 0,25 ml de proteinasa K de 10 mg / ml para una concentración final. de 2% (2-ME) y 100 µg / ml (proteinasa K).

  3. Incubar el tubo durante 60 minutos a 55 ° C. Enfriar el tubo brevemente en un banco (10 minutos)

  4. Agregue 20ml de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (PCI, 25: 24: 1). Tape el tubo y mezcle vigorosamente mediante vórtice o inversión.

  5. Centrifugar durante 10 minutos a 13.000 × gy 20-25 ° C para separar las fases acuosa y orgánica. Transfiera la fase acuosa superior a un tubo cónico limpio de 50 ml.

  6. Repita la extracción dos veces para un total de tres extracciones (pasos 4-5).

  7. Transfiera la fase acuosa superior a un tubo nuevo y agregue aproximadamente 2/3 del volumen de isopropanol a -20 ° C e invierta suavemente el tubo varias veces para mezclar.

  8. Para precipitar el ADN, coloque los tubos a -20 ° C durante al menos 30 minutos y hasta tres días.

  9. Para sedimentar el ADN, centrifugue los tubos a aproximadamente 13.000 × g durante 20 minutos a 4 ° C.

  10. Vuelva a disolver el sedimento en 4 ml de TE pH 8.0. Transfiera a un tubo Sarstedt de 13 ml y agregue aproximadamente 40 µl de RNasa 10 mg / ml, luego incube a 37 ° C durante 30 minutos.

  11. Para extraer el ADN agregue 4ml de cloroformo: alcohol isoamílico (CIA, 24: 1). Centrifugar durante 10 minutos a aproximadamente 13.000 × ga temperatura ambiente. Transfiera la fase acuosa superior a un tubo Sarstedt limpio.

  12. Repita el paso 11 y luego agregue la mitad del volumen de acetato de amonio 7,5 M, mezcle suavemente mediante inversión / pipeta y agregue 2 volúmenes de etanol al 100%. Mezclar mediante inversión / pipeta y colocar a -20 ° C durante 30 minutos o toda la noche.

  13. Centrifugar a 13.000 × g durante 20 minutos a 4 ° C para sedimentar el ADN.


He usado fenol: cloroformo muchas veces para extracciones de ADN y ARN de algas. Estos protocolos solo necesitaban pequeños ajustes para adaptarlos a una especie en particular (algunas paredes celulares pueden ser extremadamente difíciles). El principio general detrás del cloroformo de fenol funciona en casi cualquier muestra una vez que haya lisado / pulverizado las células. Los únicos problemas importantes ocurren cuando los tejidos son extremadamente grasos o están llenos de carbohidratos.

También he usado CTAB pero parece ser menos universalmente aplicable a muestras de algas.


Problemas para aislar el ADN genómico de las plantas - (17 / Feb / 2005)

Hemos utilizado dos kits diferentes que funcionan bien para otras especies de plantas, pero fallan con este. Con el kit de Nucleon vemos una gran pastilla (¿ADN + contaminantes?) Y cuando lo ejecutamos en una electroforesis, no podemos ver nada.

¿Alguien puede sugerir algo?

Hola
Nunca he trabajado con ADN vegetal, pero ¿se puede utilizar el método tradicional de extracción de ADN con fenol / cloroformo? hemos tenido pocos casos de especies bacterianas donde los kits no funcionaron y este método sí.
y una punta: Eppendorf fabrica tubos con & quot; gel de bloqueo de fase & quot que son realmente útiles para las extracciones; compruebe si dieron uno compatible con la extracción de ADN vegetal.

Solía ​​extraer ADN y ARN de Pittosporaceae, que son muy ricas en fenólicos, utilizando una extracción estándar PCI (Fenol: cloroformo: alcohol isoamílico), que funcionó muy bien. Sin embargo, para esta extracción usábamos la mayor parte de una hoja (tal vez 500 mg) que no recuerdo exactamente.

El principal problema era que a menudo los azúcares, etc. coprecipitaban con el ADN y daban como resultado una gran pastilla que era difícil de disolver y, a menudo, se decoloraba. Las extracciones repetidas generalmente resolvieron esto.

Hola & # 33 Gracias por tus respuestas

Hemos intentado ahora usar el protocolo CTAB y extracciones de fenol doble: cloroformo, obtuvimos un gránulo más limpio pero todavía tenemos problemas para verificarlo en la electroforesis.
Ahora estamos intentando precipitar ese ADN nuevamente con NaAc y etanol. ¿Sabe si las precipitaciones repetidas limpiarían aún más el ADN y eliminarían los polisacáridos?

He tenido muchos problemas para aislar el ADN genómico de las plantas debido a contaminantes como los que mencionas. En este momento, estoy en el proceso de intentar purificar mi ADN en columna. Utilizo una columna sephadex G50 (del mismo tipo que hacemos para separar las sondas de la etiqueta libre). Si su solución de ADN es demasiado viscosa, es posible que se necesiten algunas vueltas para extraer el ADN. Si es así, probablemente llevaste mucha sal y algunos fenólicos en el segundo giro. Haga una columna nueva y repita si este es el caso. Si su sephadex está almacenado en TE, calibre la columna usando TE bajo. Hoy fue en realidad el primer día que probé esto. El color bronceado ha desaparecido de la muestra y el A260 / A280 está bien. Tuve una pérdida de aproximadamente un 25% en mi ADN. Mañana, haré un resumen de restricciones para verificar la restricción y la fluorescencia. Voy a publicar los resultados.
Ah, y no bloquee la columna con ADN de esperma de arenque o algo así.

Los precips repetidos no suelen ayudar. Si hace sus precips a temperatura ambiente y solo los deja reposar durante unos minutos, la mayoría de los polisacáridos no tendrán la oportunidad de salir de la solución.

Desafortunadamente, la purificación de la columna no tuvo tanto éxito. Mis resúmenes de HindIII se ven un poco mejor, pero mi EcoR1 y BamH1 todavía se ven socavados.

Se me acabaron las ideas. ¿Alguien más puede ayudar?

Lamento estar inundando las respuestas, pero al examinar más de cerca mis geles, creo que la purificación de la columna ayudó más de lo que había pensado originalmente. Creo que este método es prometedor, pero todavía no estoy seguro de cómo perfeccionar el proceso. Quizás alguien tenga algunas sugerencias.

Hola Gran Norhthern blanco
esta no es realmente una buena respuesta porque no sé cómo mejorar la purificación, es solo que he notado con mis propias preparaciones (adn genómico bacteriano, sí, incluso para nosotros la vida no siempre es buena) que algunas enzimas de restricción digerirá bien el ADN que la mayoría no toca, para mí EcoRV, DraI y RsaI se lo comieron, así que tal vez puedas solucionar tu problema de calidad.

Gracias, leahf, pero también tengo problemas de metilación con los que lidiar. Esto realmente limita las enzimas que puedo usar. Además, normalmente necesito 6 cortadores de base. Sin embargo, si tiene enzimas confiables que no son sensibles a la metilación que usa, me encantaría saber sobre ellas.


Fondo

Casi todos los métodos para extraer ácidos nucleicos deben realizarse en un laboratorio, por ejemplo, [1-8]. Muchos estudios sistemáticos, filogenéticos, moleculares y relacionados de plantas y hongos utilizan ADN y / o ARN como fuente primaria de datos [9-14]. En la mayoría de los casos, se utilizan tejidos frescos para la extracción de ácidos nucleicos, porque la degradación y otros procesos bioquímicos comienzan inmediatamente después de que el tejido se ha eliminado del organismo o de su sustrato natural. Esto limita los estudios a las plantas y hongos que se encuentran en las proximidades de un laboratorio de investigación, incluidos los que se pueden cultivar en invernaderos y / o cámaras de crecimiento. Sin embargo, se realizan una gran cantidad de estudios de investigación sobre organismos que deben recolectarse en el campo.

Se han desarrollado tres métodos para preservar el ADN en muestras de plantas recolectadas en el campo [15-18]. Uno emplea gel de sílice como desecante para secar rápidamente el tejido, lo que reduce la degradación en la mayoría de las muestras [15, 18]. Sin embargo, no elimina la degradación y los rendimientos de ADN son bajos para algunos tejidos [19]. El segundo método utiliza una solución saturada de NaCl-CTAB (es decir, salmuera-bromuro de cetiltrimetilamonio) [18]. El alto contenido de sal deshidrata parcialmente los tejidos y el CTAB puede formar complejos con ácidos nucleicos, proteínas y carbohidratos para ralentizar los procesos de degradación. Sin embargo, en algunos casos se han observado altos grados de degradación con este método, y ocasionalmente se obtienen rendimientos bajos de ADN [19]. La adición de ascorbato mitiga parte de la degradación. El tercer método utiliza un papel absorbente para preservar el ADN [16]. Trozos de tejido vegetal o de hongos se rompen sobre el papel y luego se dejan secar. Posteriormente, los discos del papel se pueden usar (y reutilizar) para la amplificación por PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Si bien esto probablemente sea apropiado para muchos propósitos, se ha informado de degradación [16]. Por lo tanto, pueden ser necesarios otros medios de conservación y / o extracción. Extracción de ADN en el sitio de muestreo (p. Ej. en el lugar) es una posible alternativa que puede minimizar la degradación y maximizar el rendimiento.

La degradación se puede controlar mediante electroforesis en gel porque a medida que el ADN se descompone, las bandas de mayor peso molecular se vuelven más difusas y los fragmentos más pequeños de ADN se ven como manchas de fluorescencia cada vez más brillantes que se extienden hacia las regiones de menor peso molecular del gel, ver por ejemplo, [8]. Sin embargo, esto solo indica que se está produciendo la escisión de las hebras de ADN. Simultáneamente, también están ocurriendo otros procesos degradantes, lo que resulta en pérdidas de información de secuencia [20, 21]. Los cambios más comunes son las pérdidas de bases por ataque hidrolítico de los enlaces glicosídicos. La depurización ocurre con mayor frecuencia, pero la despirimidización también ocurre a una tasa menor. Cuando estos ADN se utilizan como plantillas para la PCR, aproximadamente el 75% de las veces, se incorporará una base inexacta en esos sitios, lo que provocará una pérdida potencial en la precisión de la secuencia. La desaminación de m 5 C (5-metilcitosina, prevalente en los loci de genes de ARNr) produce una timidina, que se emparejará con una adenosina en lugar de una guanosina durante las reacciones de secuenciación y amplificación por PCR. La desaminación de la adenosina conduce a la formación de hipoxantina que se emparejará con una citosina en lugar de una timidina, lo que de nuevo podría causar una pérdida de precisión de la secuencia. En nuestros estudios anteriores, demostramos que el ADN dañado se puede amplificar y secuenciar con éxito, pero a menudo los errores en las secuencias son evidentes [22-24].

Se puede observar una degradación significativa del ADN poco después de la remoción de hojas o tejido fúngico del cuerpo del organismo primario o sustrato [8], y la degradación del ARN es aparente segundos después de la toma de muestras. Algunos ARN tienen vidas medias de minutos a horas, mientras que la degradación del ADN es un proceso más lento. Se ha detectado ADN en muchas especies de plantas y hongos en tejidos secos desde meses hasta siglos después de la muerte del organismo [20, 25]. Aunque el ADN puede detectarse en tejidos que se han secado durante largos períodos de tiempo (hasta cientos de años para los hongos y hasta decenas de milenios para las plantas), la degradación se puede observar relativamente poco después de que las células comienzan a morir [3, 8 , 10-12, 26]. A menudo, la amplificación y secuenciación por PCR se puede lograr a partir de ADN extraído de tejidos que han estado muertos durante siglos o milenios. Si bien el ADN está presente, puede detectarse, extraerse, amplificarse y secuenciarse mucho después de que la planta o el tejido del hongo se haya eliminado de la planta o del basidiocarpio, está parcialmente fragmentado y alterado por enzimas degradativas, hidrólisis, oxidación y otros procesos, que a menudo conducen a resultados de secuencia alterada [20, 21]. Estos procesos aumentan en climas cálidos y húmedos y varían según la especie. Por lo tanto, el muestreo en tales condiciones en sitios de campo remotos puede limitar la utilidad de los ácidos nucleicos extraídos para estudios moleculares, a menos que la extracción proceda poco después del muestreo. La velocidad es de suma importancia para asegurar la extracción de ADN de alta calidad que es necesaria para asegurar resultados precisos y reproducibles. Cuando las muestras no pueden ser muestreadas, preservadas y transportadas rápidamente al laboratorio de manera efectiva, entonces, alternativamente, el equipo y las soluciones de laboratorio pueden transportarse a las muestras de destino en sus entornos naturales para extraer el ADN. en el lugar.

Se presenta un análisis que compara la calidad y los rendimientos del ADN extraído de tejido fresco con la calidad y los rendimientos del ADN extraído de tejido expuesto al aire a 21 ° C durante 48 horas o 72 horas (para simular el transporte desde el campo al laboratorio). . Este proyecto se inició para desarrollar un método que pudiera asegurar la precisión de la secuencia y podría utilizarse cuando otros métodos produjeron resultados deficientes. Primero, probamos el equipo de campo en el laboratorio y luego probamos el método con el equipo de campo en condiciones de campo simuladas. Todo el equipo se puede llevar en una mochila estándar (Figura 1), en un automóvil, en una motocicleta (o bicicleta) o en un animal de carga. El calentamiento de las soluciones se logra colocando los recipientes en una olla con agua que se calienta con una pequeña estufa de gas, una fogata o carbón. Alternativamente, las soluciones en sus contenedores se pueden calentar directamente usando un calentador a batería (varios están disponibles comercialmente). La centrifugación se puede realizar con una centrífuga operada manualmente o con batería. La batería puede estar en un automóvil, motocicleta, linterna o transportarse por separado. Una vez que los ácidos nucleicos se han extraído y precipitado como sales de CTAB o en etanol como sales de sodio, pueden transportarse de forma segura al laboratorio independientemente de la temperatura o las condiciones exteriores, sin riesgo de degradación adicional. Posteriormente, el resto del proceso de extracción se puede completar en un laboratorio.

Equipo básico de extracción de ADN de campo (a) y mochila (b). Se incluye todo el equipo necesario para la extracción hasta el punto de precipitación del ADN en etanol. una.

Equipo en la imagen (de izquierda a derecha): contenedores de desechos de plástico, herramientas de disección, cables adaptadores, baterías de 6 V, rejillas para tubos de microcentrífuga, recipiente para correo (botella de cloroformo en el interior), pipetas (P20, P200, P1000), microcentrífuga a batería, 100% etanol, etanol al 80%, caja de espuma de poliestireno (con 2X CTAB, tampón de precipitación CTAB, tampón TE con alto contenido de sal, 0,1X TE, agua RO), tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, contenedor de residuos, cinta de etiquetado, herramientas de molienda manuales, puntas de pipeta, guantes, mochila. No se muestra en la imagen: fuente de calor, centrífuga operada manualmente (por lo general, se utilizaría la centrífuga operada por batería o operada manualmente, ver Figura 2) y herramientas de molienda operadas con batería (ver Figura 6). B. Mochila con todo el equipo y suministros en 1a empaquetados en su interior. Las dos baterías de linterna de 6 V se pueden ver en los bolsillos a cada lado de la mochila. El peso total de la mochila completamente cargada fue de 24 libras (aproximadamente 10 kg). Quedaba espacio libre adicional en la mochila.


Extracción de ADN de alto peso molecular (HMW) y ndash que minimiza un cuello de botella para las aplicaciones emergentes de secuenciación de lectura larga

La cantidad de aplicaciones que utilizan datos generados a partir de la secuenciación de moléculas largas de ADN, o ADN HMW, se está expandiendo a una velocidad vertiginosa. Sin embargo, obtener ADN de HMW como material de entrada para estas aplicaciones ha sido históricamente un desafío y ha llevado mucho tiempo. Los usuarios de estas técnicas emergentes de lectura larga están ansiosos por encontrar una solución para extraer ADN de HMW de alta calidad utilizando una metodología más rápida, robusta y fácil de usar. Simplificar y acelerar este importante paso permitiría a los investigadores llevar a cabo sus aplicaciones posteriores de lectura larga de forma más rápida y eficiente, produciendo una gran cantidad de información genómica contextual con menos esfuerzo.

Evolución de la tecnología de secuenciación de ADN

La secuenciación del ADN ha implicado tradicionalmente la lectura de hebras cortas de ADN; es rentable y precisa. La secuenciación de Sanger, aunque no es una secuenciación de lectura estrictamente corta porque puede producir lecturas individuales de más de 500 pb, fue el pilar de la secuenciación durante 40 años y fue crucial en la producción de la primera secuencia de referencia para el genoma humano. La secuenciación de próxima generación vio la introducción de tecnologías que permitieron la secuenciación de millones de hebras cortas en paralelo y brindó la oportunidad de secuenciar genomas completos a un ritmo sin precedentes. En la tercera generación de tecnologías de secuenciación, la secuenciación de fragmentos largos de ADN como una sola molécula elimina la necesidad de fragmentar y amplificar el ADN. Las ventajas de la secuenciación de lectura larga (LRS) son numerosas: la secuenciación de una sola molécula sin amplificación por PCR omite el sesgo de GC que se produce durante la amplificación, la secuenciación del ADN en su estado nativo permite la detección de modificaciones de bases como la metilación y, al trabajar con una longitud de lectura de 10 kb + facilita el ensamblaje del genoma de una manera análoga a armar un rompecabezas con piezas más grandes. Por ejemplo, si piensa en el genoma como un rompecabezas que puede armar usando 100 piezas grandes o 10,000 piezas pequeñas, las piezas grandes serán mucho más fáciles de armar, con menos carga para la bioinformática. Por otro lado, la construcción de un genoma a partir de lecturas breves, en última instancia, requiere más profundidad de secuenciación para proporcionar una mayor cobertura.

Nuestras opciones actuales para la extracción de ADN HMW son menos que ideales

Cualquier valor superior a 50 kb se considera ADN HMW, pero existe una necesidad en rápido desarrollo de ADN que sea mucho más grande que eso y varios cientos de kilobases, incluso en el rango de megabase. Uno de los métodos tradicionales y económicos para obtener ADN de HMW en el rango de tamaño de megabase es la extracción con fenol / cloroformo junto con precipitación con etanol, un procedimiento largo que trabaja con productos químicos peligrosos. Además, se ve obstaculizado por la inevitable dificultad para manipular el ADN de HMW: durante el proceso de extracción, se convierte en una 'gota' extremadamente viscosa, que es un desafío para volver a la solución antes de que pueda usarse. El proceso de uso de fenol también es menos agradable y requiere trabajar bajo una campana extractora, tiene un olor desagradable y es tóxico y, por lo tanto, requiere una eliminación peligrosa.

Hay métodos más nuevos que no involucran fenol / cloroformo, como los enfoques basados ​​en perlas magnéticas, y estos también tienen pros y contras. Existe la ventaja de la compatibilidad con la automatización, que permite escalar los experimentos para lograr un mayor rendimiento. Sin embargo, las perlas magnéticas típicas son diminutas, y las moléculas de ADN muy largas se unen y envuelven alrededor de múltiples perlas diminutas simultáneamente. La centrifugación, agitación o pipeteo posteriores pueden hacer que las perlas se separen y el ADN de HMW se rompa. Entonces, aunque ofrecen mejoras en la escala, el tamaño del ADN que se puede extraer suele rondar los 100 kb.

Recientemente se introdujo una tecnología más nueva que emplea discos magnéticos recubiertos de sílice y ha ganado algo de impulso. El ADN en el rango de megabase se puede aislar, y aunque la capa de sílice proporciona una gran superficie para la unión del ADN, se une muy fuertemente al disco dando una capa gelatinosa de ADN, que es difícil de eluir (menor rendimiento) y posteriormente difícil de disolver (flujo de trabajo más largo).

¿Cómo está resolviendo NEB el cuello de botella de la extracción de ADN HMW?

Los investigadores de NEB han desarrollado un enfoque novedoso que produce ADN HMW intacto mediante la utilización de perlas de vidrio. Aborda un par de deficiencias de otras tecnologías. En primer lugar, las cuentas son grandes y ndash de 4 mm de diámetro y ndash y lisas.

Perlas de vidrio de 4 mm para la extracción de ADN HMW

La química de la lisis se optimiza para inactivar las nucleasas y mantener la integridad del ADN, y la lisis se lleva a cabo con agitación para controlar el tamaño del fragmento de ADN y una agitación más rápida proporciona un ADN más pequeño y una agitación más lenta proporciona un ADN de longitud máxima. Después de la lisis, la adición de isopropanol desencadena la precipitación de una gran red de ADN y el tubo se invierte para que el ADN comience a adherirse y a envolver las perlas de vidrio, como la forma en que el algodón de azúcar se envuelve alrededor de su barra. Debido a que las moléculas de ADN largas se enrollan alrededor de las perlas grandes, el ADN es extremadamente fácil de eluir y básicamente se desliza. El ADN también se captura en una forma relajada y no compacta, lo que le permite volver a la solución con un esfuerzo bastante mínimo, lo que significa que el ADN a menudo se puede usar el mismo día en que se extrae. Consulte esta nota de aplicación en la que un usuario pudo reducir entre 2 y 3 días su flujo de trabajo.

La tecnología está disponible para procesar células y sangre (NEB # T3050) o tejido (y bacterias y algunas otras muestras) (NEB # T3060), superando las limitaciones de muestra de algunas de las otras metodologías de extracción. El flujo de trabajo se completa en 30 minutos para las células, 60 minutos para la sangre y 90 minutos para los tejidos y las bacterias. Este rápido flujo de trabajo también facilita la resolución de problemas con las aplicaciones posteriores. Un enfoque futuro en la expansión del repertorio de tipos de muestras es una alta prioridad para los investigadores de NEB, por ejemplo, optimizar la química de lisis para superar la inhibición de la unión causada por polisacáridos en plantas, hongos y algas, y evaluar la variedad de microorganismos e invertebrados para los que esto El enfoque se puede utilizar para aislar ADN de HMW.

Descripción general de la extracción de ADN de HMW utilizando Monarch para células y sangre

¿Qué están haciendo los investigadores con secuencias de lectura largas?

La necesidad de extraer rápidamente ADN intacto y muy HMW es esencial para que los investigadores no pierdan un tiempo precioso preparando el material de partida para la gama de tecnologías en constante expansión que están obteniendo una gran cantidad de información genómica. Algunas de las aplicaciones se basan en la secuenciación de estas moléculas de ADN muy largas, y algunas no requieren necesariamente toda la información capturada en una lectura de secuenciación larga. Entonces, ¿qué están haciendo los investigadores con esta enorme cantidad de información de secuencia?

Actualmente, LRS permite una tasa sin precedentes de montaje de novo de una amplia gama de genomas, secuencias para las que no hay referencia. Antes de la capacidad de realizar secuencias de lectura largas, la mayoría de las secuencias de referencia se ensamblaban en base a contigs de lectura corta, seguidas de la complicada tarea de ensamblar lo que termina siendo una secuencia de referencia fragmentada. El uso de un tramo largo y continuo de ADN en lugar de fragmentos más cortos le da al investigador mucha más información contextual sobre cómo encajan las piezas. Por ejemplo, mapeo del genoma es esencialmente hacer un mapa de cromosomas y asignar un gen específico a una región de un cromosoma y determinar las distancias relativas entre y dentro de los genes en el mismo cromosoma. Identificación de nuevas isoformas se sirve mejor con lecturas de secuenciación largas porque puede cubrir un gen completo de múltiples exones. La superposición de exones y el empalme alternativo pueden dificultar la resolución de nuevas isoformas mediante lecturas cortas. Variaciones estructurales como las grandes translocaciones o inversiones segmentarias son más fáciles de definir y pueden colocarse con mayor confianza dentro del genoma cuando se utilizan tramos de secuencia largos que abarcan las uniones. Si bien las lecturas cortas pueden identificar cambios en un solo nivel de nucleótido, o incluso pequeños indels, la identificación de variaciones de secuencia más grandes ha resultado difícil.

Algunas aplicaciones se benefician de lecturas de ADN más largas, aunque no se utilice toda la información capturada en una lectura larga. Fase genómico, por ejemplo, se refiere a la capacidad de tener en cuenta la naturaleza diploide del genoma humano cuando se observan secuencias derivadas de la madre y el padre. Los ensamblajes basados ​​en haplotipos generados a partir de lecturas más largas de ADN brindan información sobre variantes en dos copias homólogas de una región cromosómica y cómo esto puede afectar la expresión de los genes de la región. Los datos de lectura larga generados a partir de la secuenciación del ADN de HMW brindan la capacidad de asociar contextualmente diferentes regiones del genoma que pueden ser variables de una manera significativa. Esto puede proporcionar una comprensión de la expresión específica de alelos y las asociaciones genotipo-fenotipo. Además, cuando se observan modificaciones a nivel de base, como la metilación, la secuenciación de moléculas nativas permite su transición con variantes genéticas, y esto tiene aplicaciones en la exploración de la diversidad epigenética. Mapeo óptico es otra técnica mediante la cual no se secuencian todas las bases, pero se asocia un fluoróforo con mapas de restricción ordenados de alta resolución para obtener información de largo alcance sobre cómo encajan en la arquitectura cromosómica.

En términos generales, unir genomas junto con secuencias de ADN continuas más grandes mejora la contigüidad del ensamblaje y proporciona una mayor comprensión de la información contenida dentro del genoma que los fragmentos más pequeños. Por lo general, se encuentra en una compensación de la profundidad general de la secuenciación y la secuenciación de lectura corta ndash es rentable y, por lo general, se logra una mayor profundidad de cobertura cuando se alinean muchas lecturas. Pero, en realidad, los datos de lectura larga y corta están casados ​​de una manera que, aunque no se mira tan profundamente, hay una profundidad de cobertura generada por las lecturas cortas que complementan la contigüidad de la lectura larga. Entonces, en otras palabras, se combinan las fortalezas de ambos métodos de secuenciación.

Los genomas contienen una gran cantidad de información a la espera de ser descubierta. Las aplicaciones de secuenciación de lectura larga que se analizan aquí son solo algunas de las emergentes que tienen el potencial de brindar información estructural, epigenética y fenotípica interesante. Actualmente hay mucha innovación y entusiasmo en el espacio de extracción de ADN HMW. Reducir el cuello de botella de la extracción es un paso esencial para allanar el camino para acelerar las nuevas y emocionantes tecnologías que están desentrañando los secretos de los genomas.

Háganos saber en la sección de comentarios en qué muestras está trabajando y qué técnicas está aprovechando.


Consulte nuestro seminario web donde el desarrollador del producto del kit de extracción de ADN de HMW Monarch & reg, Giron Koetsier, Ph.D., presenta la tecnología, recorre el flujo de trabajo y comparte algunos datos de secuenciación de larga lectura producidos con ADN de HMW purificado.

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Extracción de fenol-cloroformo - (26 / Sep / 2005)

Es posible que desee probar AquaPlasmid y AquaGenomic, que no utilizan fenol / cloroformo en absoluto para la extracción de ADN.

¿Alguien que sepa cómo preparar el tampón 5.1 para la extracción de ARN? ¿Es necesario que todo el reactivo esté libre de ARNasa? ¿Dónde podemos conseguirlos?

SÓLO UNA PREGUNTA DE NOVATOS.
EN LA EXTRACCIÓN DE ADN FENOL-CLOROFORMO UTILIZAMOS FENOL, PERO EN CONDICIÓN LÍQUIDA.
Hice un pedido de fenol, pero el que llegó estaba en estado de cristal (MERCK).
NO PUEDO ENCONTRAR ALGUNA INFORMACIÓN SOBRE ESO.

¿CÓMO DEBO PREPARAR LIQUID-PHENOL DE CRYSTAL FORM?

SÓLO UNA PREGUNTA DE NEWBIE.
EN LA EXTRACCIÓN DE ADN FENOL-CLOROFORMO UTILIZAMOS FENOL, PERO EN CONDICIÓN LÍQUIDA.
Hice un pedido de fenol, pero el que llegó estaba en estado de cristal (MERCK).
NO PUEDO ENCONTRAR ALGUNA INFORMACIÓN SOBRE ESO.

¿CÓMO DEBO PREPARAR LIQUID-PHENOL DE CRYSTAL FORM?

puede disolver 500 g de fenol cristalino en 500 ml de tris 1M pH 8.0 (si desea una solución de fenol para la extracción de ADN) o acetato de sodio 50 mM pH 4.0 (cuando prepare fenol ácido para la extracción de ARN). Recuerde verificar el pH de la solución de fenol antes de usarla y deseche esta solución cuando el fenol se vuelva rojo / marrón.

volviendo al tema principal sobre la extracción de fenol / cloroformo. si tengo un producto de PCR purificado, que es purificado por el gel de todos los taq y dNTP, supongo. Continúo y lo digiero y luego desactivo las enzimas. El libro de clonación molecular dice fenol / cloroformo después de eso y luego ligar ... pero ¿por qué si el ADN ya está purificado? eso solo conducirá a más pérdidas.

SÓLO UNA PREGUNTA DE NEWBIE.
EN LA EXTRACCIÓN DE ADN FENOL-CLOROFORMO UTILIZAMOS FENOL, PERO EN CONDICIÓN LÍQUIDA.
Hice un pedido de fenol, pero el que llegó estaba en estado de cristal (MERCK).
NO PUEDO ENCONTRAR ALGUNA INFORMACIÓN SOBRE ESO.

¿CÓMO DEBO PREPARAR LIQUID-PHENOL DE CRYSTAL FORM?

Solía ​​derretir el fenol cristalino en un baño de agua a 37 ° C, luego agregar (en la campana) un volumen igual de Tris-Cl, pH 8 y mezclar para saturar el fenol. Después de estabilizar la mezcla, retire la mayor parte de la capa superior del exceso de tampón Tris y agregue un volumen de cloroformo: alcohol isoamílico (24: 1) igual al volumen original de fenol (por lo tanto, para 500 ml de fenol, use una mezcla de 480 ml). mL de cloroformo + 20 mL de IAA. El IAA reduce la tendencia del cloroformo a formar espuma cuando se mezcla). Necesitará un recipiente más grande para esta mezcla; cualquier cosa con tapón de rosca está bien (utilicé un Erlenmeyer con tapa de rosca de 2L), siempre que la mezcla final se almacene en uno o más frascos / botellas marrones (contenido sensible a la luz) . La mejor manera de hacer esto es decantar la mezcla de fenol-Tris en el recipiente más grande, luego lavar cuidadosamente el frasco de fenol original con la mezcla de Cl: IAA varias veces, vertiendo cada vez en el recipiente más grande. Hay algunas advertencias:
1. Esto es MUY desagradable, especialmente cuando el fenol cáustico se mezcla con el cloroformo solubilizante de grasas. NO lo derrame sobre la piel expuesta. Use mucho equipo de protección (gafas, delantal de goma, etc.)
2. El fenol en sí es resbaladizo mezclado con Cl: IAA, se vuelve muy resbaladizo y tiene la desagradable costumbre de escabullirse por debajo de las tapas de los frascos cuando se agita el frasco. Esto puede llevar a que se caiga el frasco grande de P: Cl: IAA, con consecuencias predeciblemente desagradables (y altamente peligrosas) para los humanos y el equipo de laboratorio. Use guantes muy "adherentes": los guantes para lavar platos de Rubbermaid funcionaron para mí, sobre los guantes de laboratorio estándar de látex o nitrilo.
3. Liquid P: C: IAA se puede almacenar a 4C durante algún tiempo (hasta meses), pero no se debe utilizar cuando el tono amarillento tenue normal se oscurece o se vuelve rosado.
Sé que esto es mucho más de lo que necesita, pero a lo largo de los años he descubierto que demasiada información es casi siempre mejor que insuficiente.

Ah, y Kathy: es una buena idea limpiar la enzima / sal de la mezcla antes de ligar. Sin embargo, no siempre es necesario extraerlo con fenol; existen varios kits de limpieza a base de columnas de Qiagen, Promega, etc. Son más rápidos, más fáciles, menos desagradables y tienen una menor pérdida.

Hola,
otra pregunta a este tema:
¿Cuál es el método "mejor" (es decir, rendimiento de ADN de mayor calidad) si las muestras disponibles contienen solo pequeñas cantidades de ADN (por ejemplo, huevos o patas de insectos diminutos). Cloroformo / Fenol, Salado, Kit o.
Gracias
hobglobin

eso significa que si quiero extraer el ADN del lisado de adenovirus con fenol-cloroformo (1: 1) tengo que preparar la solución de fenol como dijiste (500g de fenol de cristal en 500 ml de tris 1M pH 8) y mezclarlo con cloroformo.

SÓLO UNA PREGUNTA DE NEWBIE.
EN LA EXTRACCIÓN DE ADN FENOL-CLOROFORMO UTILIZAMOS FENOL, PERO EN CONDICIÓN LÍQUIDA.
Hice un pedido de fenol, pero el que llegó estaba en estado de cristal (MERCK).
NO PUEDO ENCONTRAR ALGUNA INFORMACIÓN SOBRE ESO.

¿CÓMO DEBO PREPARAR LIQUID-PHENOL DE CRYSTAL FORM?

puede disolver 500 g de fenol cristalino en 500 ml de tris 1M pH 8.0 (si desea una solución de fenol para la extracción de ADN) o acetato de sodio 50 mM pH 4.0 (cuando prepare fenol ácido para la extracción de ARN). Keep in mind check pH of phenol solution before use and discard this solution when phenol turns red/brown.


Acknowledgment

Author Adilah Ayoib gratefully acknowledges the support from the Director of Institute of Nano Electronic Engineering (INEE), Universiti Malaysia Perlis (UniMAP), the staff members and colleagues for valuable discussion and helpful comments. This work is also supported by NanoMalaysia Institute for Innovative Technology (NanoMite) Grant (9012 00006) program funded by Long Term Research Grant (LRGS), Ministry of Education, Malaysia. The views expressed in this publication are the authors’ own interpretation based on the data collected and do not reflect in any way the views of the funding agencies.


Resultados

Hypovirulence and Associated Traits of Strain DT-8 of S. Sclerotiorum.

Strain DT-8 grew slowly on potato dextrose agar (PDA) and developed colony morphology similar to that of the hypovirulent strain Ep-1PN (Fig. 1 A and D). The hypovirulence phenotype of strain DT-8 is even more pronounced than that of strain Ep-1PN when inoculated onto Arabidopsis thaliana (Fig. 1B) or detached leaves of Brassica napus (Fig. S1). Although strain DT-8 was able to produce sclerotia, the time required for sclerotial initiation was about 3–5 days longer than that for the normal strain and the sclerotia were randomly distributed on the colony surface. Furthermore, the size of the sclerotia produced by strain DT-8 was significantly smaller than that of the normal strain (Fig. 1C).

Hypovirulence-associated traits of strain DT-8 of S. sclerotiorum. (A) Abnormal colony morphology of strain DT-8 grown on a PDA plate at 20 °C for 15 days (B) hypovirulent phenotype of strain DT-8 as exhibited by infected Arabidopsis thaliana plants, which were maintained at 20 °C for 4 days postinoculation (C) small sclerotia produced by strain DT-8 on a PDA plate at 20 °C for 30 days and (D) growth rate of strain DT-8 relative to other strains, bars represent standard deviation from the mean (norte = 8). The small letters on top of the bars in D indicate whether the differences are statistically significant (PAG & lt 0,05). The RNA virus-infected hypovirulent strain Ep-1PN and its sexual progeny Ep-1PNA367 (virus-free) were used as controls DT-8VF is a virus-free culture derived by hyphal tipping of strain DT-8, and showed a normal phenotype of S. sclerotiorum.

Strain DT-8 was cured of its hypovirulent phenotype either by hyphal-tip culturing or protoplast regeneration, and the cured isolates of DT-8, such as DT-8VF, regained virulence on plants comparable to that of the normal strains (e.g., strain Ep-1PNA367) and developed normal colony morphology (Fig. 1 A y D). Furthermore, the traits of these cured isolates can be reverted to the hypovirulence phenotype following contact with the original hypovirulent strain DT-8 (Fig. S2). Thus, strain DT-8 shows typical characteristics of virus-mediated debilitation/hypovirulence.

DNA Elements Associated with Strain DT-8 of S. Sclerotiorum.

Virus-mediated hypovirulence in pathogenic fungi is usually caused by either double-stranded (ds) or single-stranded (ss) RNA viruses. However, several attempts to extract dsRNA from strain DT-8 were unsuccessful. The genomic DNA of strain DT-8 was extracted and resuspended in RNase A-containing TE buffer, and the DNA sample was electrophoresed on 1% agrose gel and stained with ethidium bromide. Surprisingly, besides the fungal genomic DNA, two additional DNA bands with sizes of about 2 kb [large DNA element (LDE)] and 0.3 kb [small DNA element (SDE)], respectively, were clearly observed in a stained gel (Fig. 2A). These two DNA elements could be digested with DNase I (active against ssDNA and dsDNA) and S1 nuclease (active against ssDNA or ssRNA) but could not be digested with either Exonuclease III (active against linear dsDNA) or Exonuclease I (active against linear ssDNA), suggesting that these elements are circular ssDNA molecules or linear ssDNA with modified 5′ and 3′ ends (Fig. S3A).

Genomic characteristics and particle morphology of Sclerotinia sclerotiorum hypovirulence associated DNA virus 1 (SsHADV-1). (A) Total DNA extracted from mycelia of strains DT-8 and DT-8VF. DNA samples were fractionated on 1.0% agarose gel. The positions of host genomic DNA, viral DNA, or the large DNA element (LDE) and defective viral DNA or small DNA element (SDE) of strain DT-8 are indicated. Lane M1, λ-Hind III-digested DNA Marker lane M2, DL2000 DNA ladder marker (TaKaRa). (B) Southern blot analysis of total nucleic acid extracted from mycelia of strains DT-8 and DT-8VF. The forms of viral DNA are indicated as OC dsDNA [open circular double-stranded (ds) DNA], SC dsDNA (supercoiled dsDNA), and circular single-stranded (ss) DNA. A 379-bp DNA fragment of Rep was PCR amplified and labeled with α- 32 P dCTP and used as a probe. (C) Viral particles observed under transmission electron microscopy. Particles were purified from mycelia of strain DT-8 and negatively stained with 1% uranyl acetate. (Scale bars, 50 nm.) (D) SDS/PAGE analysis of SsHADV-1 coat protein. Samples collected from fractions corresponding to 25% sucrose of sucrose gradients were subjected to SDS/PAGE. The size of the Coomassie blue-stained protein was estimated by comparison with protein markers. (mi) Agarose gel electrophoresis on 1% agarose of DNA extracted from sucrose gradient fractions containing virus particles. (F) Genome organization of SsHADV-1. Functional ORFs (coding for CP and Rep) were displayed as thick arrows. The positions of the potential stem–loop structure, large intergenic region (LIR) and small short intergenic region (SIR) were marked the stem-loop structure was shown on the right. LIR is also shown in an expanded form to indicate the elements of the bidirectional promoter.

Interestingly, strain DT-8VF, which was derived from strain DT-8, lacked the additional ssDNA elements characteristic of DT-8 (Fig. 2 A y B). However, after contacting the colony of strain DT-8, newly obtained isolates of strain DT-8VF contained the two ssDNA elements, and their colony morphology and virulence were as debilitated as the original strain DT-8 (Fig. S2). Thus, the ssDNA elements are likely to be associated with hypovirulence of strain DT-8.

Cloning and Sequencing of the Full-Length DNA Elements of Strain DT-8.

Full-length DNA clones of LDE were obtained by PCR amplification, confirmed by Southern blot analysis (Fig. 2B) and subjected to sequence analysis. Sequencing results showed that the full-length DNA of LDE is 2,166 nt in length and contains two large ORFs, whose expressions were confirmed by northern hybridization and RT-PCR analysis (Fig. S4 A y B). One ORF, whose expression codes for a putative coat protein, is located on the sense strand and the other ORF is situated on the complementary-sense strand and codes for a putative replication initiation protein (Rep) (Fig. 2F). The putative Rep has two conserved domains, namely geminivirus Rep catalytic domain (Gemini_AL1) and geminivirus Rep protein central domain (Gemini_AL1_M) with conserved motifs for rolling-circle replication (21) (Fig. 3A). Two intergenic regions separate the two ORFs, the large intergenic region (LIR) contains 133 nt and the small intergenic region (SIR) contains 119 nt (Fig. 2F). Both LIR and SIR also have similar characteristics to those of viruses in the genus Mastrevirus in the family Geminiviridae (22). LIR has an unusual nonanucleotide TAATATT↓AT at the apex of a potential stem-loop structure, which is recognized at a specific position (↓) by the Rep during the initiation of virion DNA replication (23). Therefore, the large DNA element most likely represents a DNA viral genome.

Phylogenetic analysis of SsHADV-1. (A) Amino acid sequence alignment of Rep of SsHADV-1 and selected viruses from the genus Mastrevirus in the family Geminiviridae. The conserved motifs (I to VII) were shaded with light gray color Asterisks indicate identical amino acid residues, and colons indicate similar residues. Conserved motif Ito VII are IRD, RCR-I, RCR-II, RCR-III, RBR, NTP Binding-A, and NTP binding-B, respectively. The Alignment was generated by using CLUSTALX (2.0). Numbers in brackets are the positions of amino acid residues that are not listed. (B) Phylograms of the Rep and CP of SsHADV-1 and selected circular ssDNA viruses in the families Geminiviridae, Nanoviridae and Circoviridae. Multiple alignments of amino acids and tentative phylogenetic trees generation were referred to the method described by Liu et al. (20). The position of SsHADV-1 is indicated by a red star. See Table S1 for abbreviations of virus names and viral protein accession numbers used for phylogenetic analysis.

Sequence analysis showed that the SDE comprises a mixture of ssDNA molecules, 236–284 nt in length, representing defective DNA derived from LDE. They lack the two ORFs but contain both LIR and SIR (Fig. S5). The short direct repeat sequences flanking LIR and SIR may represent signal nucleotides for deletion (24).

Viral Particles in Strain DT-8 of S. Sclerotiorum.

To confirm that LDE represents a viral genomic DNA, mycelial mass of strain DT-8 grown on a PDA plate was collected and subjected to a virus purification protocol that includes sucrose gradient centrifugation as the final step. The major band containing viral particles, which was present in the gradient region corresponding to 25–30% sucrose, was collected and the viral particles were recovered by centrifugation. Negatively stained viral particles observed with an electron microscope were nontwinned isometric particles, 20–22 nm in diameter (Fig. 2C). The viral particles were examined for coat protein (CP) and viral genomic DNA contents. A DNA band, similar in size to the LDE extracted directly from mycelia of strain DT-8, was extracted from the viral particles (Fig. 2D). Like the ssDNA form of M13 phage genomic DNA, the DNA extracted from viral particles can be digested by ssDNA nuclease S1, but not by Exonuclease I (Fig. S3B). Only one major protein with a molecular mass of about 35 kDa was resolved by SDS/PAGE analysis (Fig. 2mi). The size of this isolated protein is similar to that predicted for coat protein based on DNA sequence analysis. Furthermore, N-terminal sequencing analysis further confirmed that the isolated protein was in fact the coat protein. Thus, we verified that the large DNA element in strain DT-8 represents a circular ssDNA viral genome, which we named Sclerotinia sclerotiorum hypovirulence associated DNA virus 1 (SsHADV-1).

Sequence and Phylogenetic Analyses of SsHADV-1.

Sequence analysis of the full-length amino acid sequence of the putative Rep of SsHADV-1 showed that it shares the highest sequence identity with the Reps of chickpea chlorotic dwarf virus (25), bean yellow dwarf virus (26), and tobacco yellow dwarf virus (27) (Table S2). These three viruses that infect dicotyledonous plants belong to the genus Mastrevirus (Fig. 3A). Phylogenetic analysis of SsHADV-1 and selected ssDNA viruses showed that the putative Rep of SsHADV-1 clusters with members of the family Geminiviridae, but it is distinct from ssDNA viruses in the families Nanoviridae and Circoviridae (Fig. 3B). Although SsHADV-1 appears to be related to geminiviruses, it is clearly different from all documented geminiviruses. In addition to the difference in particle morphology, the genome of this fungal DNA virus has an unusual nonanucleotide and is smaller than those of plant geminiviruses in the genus Mastrevirus (24). The genome of SsHADV-1 only codes for two proteins (CP and Rep), but lacks a gene for movement protein (MP), which is a key protein of plant geminiviruses for cell-to-cell movement. Furthermore, the Rep gene on the complementary strand lacks an intron. Moreover, phylogenetic analysis of the CP of SsHADV-1 and that of viruses in the families Geminivirdae, Nanoviridae, and Circovirdae shows that SsHADV-1 CP is phylogenetically divergent because it does not cluster with any of the viruses included in this analysis (Fig. 3B). Thus, SsHADV-1 most likely belongs to a family that is phylogenetically related to the family Geminiviridae. Interestingly, we found that SsHADV-1 CP shares the highest sequence similarity with a marine putative protein (Marine_PP) encoded by a whole genome shotgun sequence (GenBank accession no.: AACY024124290) from a metagenomic data of a microbial community from Sargasso Sea (28). The percent identity and similarity of these two proteins are 37.8% and 52.6%, respectively (Fig. S6). Considering that a short gene sequence possibly coding for a viral Rep is present on the same fragment as this Marine_PP gene, this putative protein is likely of a viral origin. It is thus possible that SsHADV-1 is more closely related to the putative marine virus (most likely infecting algae) than to plant geminiviruses.

Infectivity of Purified SsHADV-1 Particles and Viral DNA Extracted Directly from Infected Mycelium.

Mycelial agar discs were taken randomly from regeneration plates of transfected S. sclerotiorum protoplasts and transferred into fresh PDA plates. Isolates Ep-1PNA367-NT3 and Ep-1PNA367-NT7 were derived from colonies where viral DNA-transfected protoplasts were regenerated and isolates Ep-1PNA367-PT2 and Ep-1PNA367-PT6 were derived from colonies where viral particle-infected protoplasts were regenerated. Colony morphology and hyphal growth of these four isolates were similar to those of strain DT-8 but different from the virus-free strain Ep-1PNA367 (Fig. 4A). Viral DNA also was extracted successfully from these cultures and confirmed with PCR amplification using the specific primers, which were designed based on the Rep sequence (Fig. 4 B y C). Thus, both purified viral particles and viral DNA-enriched fractions isolated directly from infected mycelium were able to transfect S. sclerotiorum protoplasts.

PEG-mediated protoplast transfection with purified SsHDV-1 particles and viral DNA extracted directly from infected mycelium. Colony morphology of the virus-free strain Ep-1PNA367 and its newly transfected isolates. Ep-1PNA367-NT3 and Ep-1PNA367-NT7 were isolated from transfectants with purified viral DNA, whereas Ep-1PNA367-PT2 and Ep-1PNA367-PT6 were isolated from transfectants with viral particles. Colonies were grown on PDA plate at 20 °C for 7 days. (B) Viral DNA extracted from transfected cultures of strain Ep-1PNA367. Lane 1, strain Ep-1PNA367 lane 2, Ep-1PNA367-NT3 lane 3, p-1PNA367-NT7 lane 4, Ep-1PNA367-PT2 lane 5, Ep-1PNA367-PT6 lane 6, strain DT-8 and lane M, λ-Hind III-digested DNA Marker. (C) Viral DNA of newly transfected cultures were confirmed by PCR amplification with primer pair designed from the Rep sequence of SsHADV-1. Lane M, DL2000 DNA ladder marker lane 1 to lane 6 are as the same as in B.

Transmission of SsHADV-1 from Strain DT-8 to a Vegetatively Incompatible Strain of S. sclerotiorum.

Vegetative incompatibility between two fungal individuals often limits the transmission of mycoviruses, and the most likely reasons are compartmentation and cell death of the fusing hyphal cells (29, 30). However, transmission of hypoviruses between two vegetatively incompatible strains has been observed previously (31). In our experiment, successful transmission of SsHADV-1 between vegetatively incompatible strains of S. sclerotiorum was confirmed by dual-culture of DT-8 and the vegetatively incompatible virulent strain Ep-1PNA367, which was labeled with hygromycin-resistance gene. Virus-infected isolates of strain Ep-1PNA367 were frequently obtained from dual culture plates (7 from 21 dual-culture plates), and all newly infected isolates of strain Ep-1PNA367 were converted to hypovirulence and showed a similar phenotype to that of strain DT-8 (Fig. S7).


Any real difference between DNA purification kits? - (May/02/2014 )

Is there any important difference between e.g. PCR clean-up, eukaryotic genomic DNA extraction, mini-, midi-, maxi- plasmid prep, gel extraction kits sold by different companies or are they all selling the same things?

There is a difference between genomic DNA preparation kits and plasmid preparation kits. The kits for PCR cleanup, gel purification, and column based plasmid kits are pretty similar in the final portion of the protocols, but differ in the sample handling early on, primarily in releasing the DNA and adjusting chemistry so that it binds. The charge-switch kits are different chemistry. I'm now a fan of magnetic bead purification for most applications.

I'm not sure whether my question was clear. Just in case, I'm asking whether there's a difference between the kits of different companies' (e.g. QIAGENs vs Promegas vs Life Technologies) kits.

Why do you prefer magnetic bead-based kits? Have you been using them long?

In general there isn't much difference, though there may well be some adjustment of the chemistry to enhance DNA extraction over the basic protocols, though these bits would be proprietary (check the MSDS they will often tell you components based on hazard).

The costs make sometimes the difference .

For DNA extraction kits I know a study where they compared several kits to extract DNA from museum species and they found quite clear differences between companies in terms of DNA yield and PCRs with this DNA (working or not). Therefore especially for difficult and unusual sources the differences can be huge, whereas for standard samples the differences might be small (and differences in results due to differently skilled users can superimpose the actual kit differences).

Generaly QIAGEN is thought to be the best, and also the most expensive (may not be true at different uses and needs, both of these).

For PCR cleanup/gel extraction, I don't know about the others, but Q offers colums with minimal elution volumes, which makes DNA isolated from gel to have reasonable concentration for spectrophotometric measuring (i.e. more than 10 ng/ul). Any other companies, may have half the prize for column kit, but half the yield and much bigger elution volume, so at the end you get so low concentration it's hard to measure.

For plasmids, there depends how much you care about yield. Minipreps are usually only good for testing, and you do a lot of them so we use column kits from a noname cheep company (but we don't use their gel extraction kits as I mentioned). In this case, prize is more important.

Q has even several types of isolation for Midi and Maxi preps, some use filter, some not (in one case needs a centrifuge force we didn't have, so we ended using several midipreps instead of Maxi, when only overall yeald is required and not a high concentration, because it was both cheaper and more bothersome). But if you cultivate a huge bottle of bacteria, you don't want to waste it on some shitty cheap kit. 

Genomic DNA isolation depends much on the type of source tissue and how much you want do bother with it. Q has really many types, for lipidous tissues, plants, etc, many protocols. You can use a whole blood if you want, but as I'm a "blood person" I still prefer classic phenol/chlorophorm, because there is generaly no kit, that would process 6-9 ml of whole blood, the colum kits are usualy up to 1 ml, that's a waste..  but fine for small animals blood, where you don't have that much and you need a PCR-grade DNA.

And.. several companies have differen systems, Q has mostly columns, but few other types, and those kits for the robot of theirs, also column kits that are compatible with vacuum thingy they sell.

Other companies have magnetic beads (not sure if Q makes them) so if you prefer certain type, you choose a company by that. (some other company was really into some weird filtering stuff, for isolations, there are many approches).

LifeTech engulfed Invitrogen and late Ambion, and Ambion was known for the best RNA stuff. But RNA is more tricky thing than DNA. RNA isolation kits we use are mostly not from Q. So, depends on who is doing the best, the exact thing you need. 

But personally I found another huge plus for Q, in theyr marvelous protocols. There just the small books you can read, some background info, clear and comprehensible protocol (protocol variants often).. I've seen Invitrogen manuals, Promega manuals (my god..), ABI manuals (they are so full of safety nonsense and whant other things you should buy from them..), I have seem folded papers of noname companies, but QIAGEN simply makes the best manuals. 
I would take it as a reading on a vacation, with graphs and pictures!

No seriously, I found the comfort of work also an important part. Sometimes it's worth the money, sometimes not.

There is also this company that sells alegedly "the same colums as QIAGEN has" in bulk and manual how to mix your own "QIAGEN" buffers. That is also possible. 

Trof on Tue May 6 21:13:28 2014 said:

Generaly QIAGEN is thought to be the best, and also the most expensive (may not be true at different uses and needs, both of these).

 

For PCR cleanup/gel extraction, I don't know about the others, but Q offers colums with minimal elution volumes, which makes DNA isolated from gel to have reasonable concentration for spectrophotometric measuring (i.e. more than 10 ng/ul). Any other companies, may have half the prize for column kit, but half the yield and much bigger elution volume, so at the end you get so low concentration it's hard to measure.

 

For plasmids, there depends how much you care about yield. Minipreps are usually only good for testing, and you do a lot of them so we use column kits from a noname cheep company (but we don't use their gel extraction kits as I mentioned). In this case, prize is more important.

Q has even several types of isolation for Midi and Maxi preps, some use filter, some not (in one case needs a centrifuge force we didn't have, so we ended using several midipreps instead of Maxi, when only overall yeald is required and not a high concentration, because it was both cheaper and more bothersome). But if you cultivate a huge bottle of bacteria, you don't want to waste it on some shitty cheap kit. 

 

Genomic DNA isolation depends much on the type of source tissue and how much you want do bother with it. Q has really many types, for lipidous tissues, plants, etc, many protocols. You can use a whole blood if you want, but as I'm a "blood person" I still prefer classic phenol/chlorophorm, because there is generaly no kit, that would process 6-9 ml of whole blood, the colum kits are usualy up to 1 ml, that's a waste..  but fine for small animals blood, where you don't have that much and you need a PCR-grade DNA.

 

And.. several companies have differen systems, Q has mostly columns, but few other types, and those kits for the robot of theirs, also column kits that are compatible with vacuum thingy they sell.

Other companies have magnetic beads (not sure if Q makes them) so if you prefer certain type, you choose a company by that. (some other company was really into some weird filtering stuff, for isolations, there are many approches).

 

LifeTech engulfed Invitrogen and late Ambion, and Ambion was known for the best RNA stuff. But RNA is more tricky thing than DNA. RNA isolation kits we use are mostly not from Q. So, depends on who is doing the best, the exact thing you need. 

 

 

But personally I found another huge plus for Q, in theyr marvelous protocols. There just the small books you can read, some background info, clear and comprehensible protocol (protocol variants often).. I've seen Invitrogen manuals, Promega manuals (my god..), ABI manuals (they are so full of safety nonsense and whant other things you should buy from them..), I have seem folded papers of noname companies, but QIAGEN simply makes the best manuals. 
I would take it as a reading on a vacation, with graphs and pictures!

No seriously, I found the comfort of work also an important part. Sometimes it's worth the money, sometimes not.

 

There is also this company that sells alegedly "the same colums as QIAGEN has" in bulk and manual how to mix your own "QIAGEN" buffers. That is also possible. 

Now I'm wondering if you have a contract with the "Q" company?

Maybe for people working with "clean" stuff QIAGEN is a reference. For the ones we work in environmental micro, you never use their kits for isolation. Probably, MoBIO has more stuff in environmental DNA extraction than any other company. And if you use kits for that type of samples you usually use either one from MOBIO or the FastDNA Spin kit (or one the many protocols derived from it).

hobglobin on Wed May 7 16:40:31 2014 said:

Now I'm wondering if you have a contract with the "Q" company?

No, but I obviously should ask them to 
 
(they're are expensive, so not an option for everyone, but as said, often a "golden standard")
 
 
 

El Crazy Xabi on Thu May 8 05:39:16 2014 said:

Maybe for people working with "clean" stuff QIAGEN is a reference. For the ones we work in environmental micro, you never use their kits for isolation. Probably, MoBIO has more stuff in environmental DNA extraction than any other company. And if you use kits for that type of samples you usually use either one from MOBIO or the FastDNA Spin kit (or one the many protocols derived from it).

Didn't they have that miraculous polymerase mixes, that can overcome many inhibitors? One company had such, especially for soil samples and other.. so you could do onsite PCR (but I don't remember which company that was). I found that very interesting, but I don't need that actually.

Q supplies "Q solution" which is 1M betaine.  They forgot to pay me this month. -)


Has anyone here done an RNA extraction?

In the lab I'm working in, I'm still in the midst of being trained. I just did my third RNA extraction and the results were horrid. I know it comes with practice, but does anyone have any helpful tips? I do RNA extractions on Brachypodium/Oryza sativa roots with the RNeasy plant mini kit, starting with grinding the roots in a mortar and pestle and then a series of washes. I try to grind the tissue up as hard as I can and get as much as I can into the collection tubes, I just can't tell if my error is in the grinding/collecting or in the washes, if I'm not being careful enough with my micro-pipetting. Thanks in advance for any helpful tips, Iɽ like to get some good RNA samples so I can move onto RT-PCRs and sequencing.
Cheers!

[EDIT]: Just to add to this, I'm an undergraduate student doing research- so I don't really have much say in what I use/do- I have to use the plant kit and follow the protocol- just looking for tips to make the best of what I have. :)

From my experience (have done thousands of extractions in the last two years), ditch the column kits for TRIzol extractions (also use glycogen, incubate the sample in a -80 for 1-24hrs during the precipitation step, and add a second ethanol wash to the standard protocol, I can send you my modified protocol if youɽ like). Since moving to this new method I've had a 100% success rate with the last 300 samples, great specs, high yields, and no degradation. I had so many issues with the column kits (60-80% success rate with less than perfect specs) that I've given up on them.

If you want to keep using the columns try these things: Make sure you're using filtered tips for any steps involving RNA, make sure your washes are thorough (invert and roll the tubes to get the wash all over the inside and lid before a spin), and use a vac or pipette to remove washes (don't just flick it out of the collection tube).

*Edit: Here is my modified protocol, I work on human cells but there might be some additional steps for plant tissue so look at the original Thermo protocol to find out. Also, make sure you are clean around RNA and use 10% bleach or RNase Zap on your gloves/workspace/tools to inhibit any RNases before working.

Going to second this protocol. Trizol is the shit. I've also heard that linear polyacrylamide works even better than glycogen as an RNA carrier.

Extra recommendation if OP wants to keep using the columns (this protocol combines the high yield of Trizol with the easy/clean-ness of kits):

Follow /u/what_are_you_saying's protocol through step 5, then transfer the aqueous phase to an RNAse-free eppendorf tube.

Kits frequently have an "clean up RNA using our column" protocol. Use that protocol on the aqueous bit from the bullet point above.

If your kit does not have a "RNA clean up protocol", add lysis buffer/ethanol to the amounts you would normally need for a 200uL liquid sample. Do NOT add beta-mercaptoethanol or proteinase K. Add this mixture to the column and purify RNA normally according to instructions for a normal sample in the kit.

This protocol can usually get a couple ug of ultra-clean RNA even if you have an extremely small amount of starting material (like say 10 Drosophila heads).

Have you ever done extractions without glycogen? If so, do you find that the glycogen increases yield? Increases purity?

I use a column kit, I have 100% success rate, with most of my samples scoring a RIN of 10. Mouse cells here.

I'm a molecular geneticist who works on plants. I've done a lot of RNA extractions. Here's a couple thoughts.

-RNA degrades very easily and is much less stable than DNA. Spray down your work bench, pipettes, and your gloves with ethanol before you begin an extraction. Touch something else while the centrifuge is spinning? Spray your gloves again. I also like to use special "filter tips" to avoid contaminating my samples with RNases.

-It sounds like you're using a kit. Make sure you follow the directions carefully - a lot of the buffers have similar sounding names. If there are optional steps, do them. At the final step, when you are eluting your RNA out of the column, I like to take what comes out and pipette it back into the top of the column. This second wash will give you a slightly higher yield.

-It sounds like you're new in the lab - welcome! I'm sure there are some more senior people working with you who have done that protocol (not necessarily the PI, but perhaps even a post doc or a grad student). Ask them for help! Ask them to sit with you while you do the protocol and they can observe your technique and might be able to point out something you're doing incorrectly.


In Genomic Dna Isolation Why We Use 70 Percent Ethanol?

Because 70% ethanol can wash the DNA pellet at the end of DNA isolation process. The genomic or plasmid DNA isolation needs several buffers like lysis buffer, TAE buffer along with different salts and phenol, chloroform, iso-amylalcohol solution.

So at the end we have to wash the DNA pellet with 70% ethanol. 100% ethanol will dry the estimated DNA that's why 70% ethanol is used for this purpose.

You might also like.

The reason why uracil is not seen in DNA is because there are certain enzymes that break it down before.

The denisities of materials is clearly visible in blood agar making it useful as a primary isolation.

1987 was the first year that DNA evidence was used to convict someone in the US. If you would like.

Something to consider: Purifying alcohol is expensive. Each time you distill it you can make it.

It does not lyse WBCs probably because RBCs do not contain nucleus and are more prone to lysis than WBCs.

Because it's what they ave to use.

Molecular biology is completely dependant on the methods of electrophoresis, this method separates DNA.

It acts as a chaotroph (at high concentrations) and will 'dehydrate' the DNA, meaning that the DNA is.

The medical field has used statistics extensively for a very long time - perhaps more than any other.

Its a preprocesser directive of c language which can be use to include a specific file..ex :#include.


Ver el vídeo: laboratorio genética - extracción de ADN (Agosto 2022).