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Método (s) óptimo (s) de inactivación de células vegetativas bacterianas después de que las esporas de subtilis germinen bajo presión

Método (s) óptimo (s) de inactivación de células vegetativas bacterianas después de que las esporas de subtilis germinen bajo presión


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Estoy escribiendo una propuesta de investigación de doctorado y, siendo un novato en el campo, estoy un poco perdido en los métodos de inactivación de células vegetativas bacterianas en los alimentos.

Debo proponer dos métodos principales a mi futuro equipo de investigación. La estrategia consiste en hacer germinar las esporas de B. subtilis aplicando alta presión y luego seleccionar un método suave para inactivarlas.

Mi problema es seleccionar un máximo de dos métodos más apropiados entre:

  • Microondas (MW)
  • Ozono (O3)
  • Campos eléctricos pulsados ​​(PEF)
  • Plasma frío (CP)
  • Calentamiento óhmico (OH)
  • Ultrasonido (EE. UU.)
  • Ultravioleta (UV)
  • Haz de electrones de alta / baja energía (H / LEEB)
  • Dióxido de cloro (ClO2)
  • CO2 (HPCD, scCO2)

Necesito seleccionar dos métodos ..., necesito seleccionar solo los suaves, para preservar el sabor de la comida, así que creo que la temperatura debería ser <60 ° o un máximo de 70 ° ... pero ¿qué otros criterios tomar en consideración, ser un novato en ¿este campo?

Consideremos uno de los métodos para alimentos secos y otro para líquidos (jugos, leche, etc.).


Inactivación de Bacillus subtilis esporas mediante la combinación de ondas ultrasónicas a presión y un tratamiento térmico suave

La inactivación de Bacillus subtilis Se investigaron las esporas mediante tratamientos ultrasónicos bajo presión estática (Mano-Sonication, MS) y un tratamiento combinado MS / térmico (Mano-Thermo-Sonication). El efecto esporicida de los tratamientos de EM dependió de la presión estática, la amplitud de las ondas ultrasónicas y la temperatura del tratamiento. A 70 ° C, los incrementos de presión hasta 500 kPa causaron progresivamente más inactivación. Un tratamiento de EM a 500 kPa y 117 μm de amplitud durante 12 min inactivó aproximadamente el 99% de la B. subtilis población de esporas. Por encima de 500 kPa, los incrementos adicionales de presión no aumentaron el porcentaje de inactivación. En el rango de 90-150 μm, se observó una relación exponencial entre la amplitud de las ondas ultrasónicas bajo presión y el número de supervivientes. Mientras que un tratamiento de EM (20 kHz, 300 kPa, 70 ° C, 12 min) a 90 μm inactivó el 75% de la B. subtilis población de esporas, el mismo tratamiento a 150 μm inactivó al 99,9% de esta población. Los tratamientos con EM a temperaturas superiores a 70 ° C (MTS) condujeron a una mayor inactivación de esporas. En el rango de 70 a 90 ° C, la combinación de calor con un tratamiento de MS (20 kHz, 300 kPa, 117 μm, 6 min) tuvo un efecto sinérgico sobre la inactivación de esporas. El efecto inactivante del ultrasonido no se debió ni a las partículas de titanio erosionadas de la punta de sonicación ni a los radicales libres liberados durante el tratamiento ultrasónico. Los tratamientos de EM sensibilizaron a las esporas de B. subtilis a la lisozima.

El tratamiento térmico de alimentos líquidos se utiliza principalmente como medio de inactivación de microorganismos patógenos o de descomposición que podrían crecer en las condiciones que normalmente se encuentran en el almacenamiento. Sin embargo, el tratamiento térmico puede afectar negativamente el sabor, el sabor y el valor nutritivo de los alimentos. Actualmente, se están realizando esfuerzos para encontrar nuevos métodos de conservación de alimentos para evitar los efectos no deseados del calor. Estos métodos se basan en procesos no térmicos de inactivación (Mertens & Knorr 1992 Knorr 1994 Qin et al. 1996) o una combinación de métodos de conservación ya conocidos (Gould & Jones 1989 Ama et al. 1994 ).

La inactivación de formas vegetativas de microorganismos por ultrasonido en medios líquidos se observó a finales de la década de 1920 (Harvey y Loomis 1929). El efecto letal del ultrasonido se ha atribuido a la cavitación. La cavitación se debe al crecimiento y posterior colapso de burbujas microscópicas cuando las ondas ultrasónicas viajan a través de un líquido. La cavitación puede afectar un sistema biológico en virtud del aumento de temperatura localizado y el estrés mecánico (Scherba et al. 1991). Además, la disociación de moléculas de agua en radicales libres H- y OH-, como consecuencia de las temperaturas y presiones muy elevadas producidas por la cavitación, puede inducir cambios químicos adversos como la desnaturalización del ADN o de las proteínas (Riesz y Kondo 1992). Sin embargo, aún se desconoce la razón última de la letalidad de los ultrasonidos en los microorganismos.

Se ha sugerido el uso de ultrasonido para la desinfección y conservación de alimentos, pero su efecto letal limitado sobre las esporas bacterianas (Berger y Marr 1960) ha desalentado cualquier intento de utilizarlo como procedimiento de esterilización. La combinación de ultrasonido con, por ejemplo, tratamiento químico (Sierra & Boucher 1971 Ahmed & Russell 1975 Lillard 1993), tratamiento térmico (Burgos et al. 1972 García et al. 1989) o la radiación ionizante (Dharkar 1964), aumentó el efecto letal del ultrasonido en las células vegetativas, pero la inactivación de las esporas bacterianas aún era baja.

Aunque algunos autores han demostrado la dependencia de los efectos fisicoquímicos del ultrasonido sobre la presión estática (Neppiras 1980 Chendke y Fogler 1983), la mayoría de los experimentos descritos en la literatura, incluido el ultrasonido, se han llevado a cabo a presión atmosférica. Además, ningún estudio ha demostrado el efecto de las presiones estáticas elevadas sobre la inactivación de esporas bacterianas por ultrasonido.

En este trabajo, la inactivación de Bacillus subtilis Se estudiaron las esporas mediante ondas ultrasónicas a presión (Mano-Sonication MS) y mediante un tratamiento combinado de calor suave / MS (Mano-Thermo-Sonication MTS). También se llevaron a cabo experimentos en un intento de comprender el mecanismo de inactivación de las esporas por la EM.


Andryukov BG 1,2 *, Karpenko AA 3, Lyapun IN 1, Matosova EV 1 y Bynina MP 1

1 Instituto Somov de Epidemiología y Microbiología, Rusia

2 Universidad Federal del Lejano Oriente, Rusia

3 A.V. Instituto Zhirmunsky de Biología Marina, Centro Científico Nacional de Biología Marina, Rama del Lejano Oriente, Academia de Ciencias de Rusia (NSCMB FEB RAS), Vladivostok, Rusia

Recibió:09 de agosto de 2019 | Publicado: 21 de agosto de 2019

Autor correspondiente:Andryukov Boris G, Instituto Somov de Epidemiología y Microbiología, Universidad Federal del Lejano Oriente (FEFU), Facultad de Biomedicina, Vladivostok, Rusia

Abstracto

Algunas bacterias grampositivas del género Bacillus spp. y Clostridium spp. Puede existir en dos estados alternativos: vegetativo y en forma de endosporas, que se dividen en dos tipos: tener capa externa (exosporium) y no tenerla. Las controversias bacterianas se han estudiado durante mucho tiempo y, sin embargo, no siguen siendo plenamente reconocidas como objetos del micromundo. Estas células en reposo (inactivas), reconocidas como la forma de vida más estable en la Tierra, se forman en la célula madre con falta de nutrientes. La extraordinaria resistencia de las esporas a las condiciones físicas y químicas extremas de existencia es la principal característica que las distingue de las formas vegetativas, y su ciclo de vida contribuye a la amplia propagación de las bacterias formadoras de esporas en varios ecosistemas. Las propiedades únicas de las esporas bacterianas provocan un mayor interés científico y médico asociado con la importancia epidemiológica de las formas de células en reposo que pueden estar en un estado metabólicamente inactivo durante decenas y cientos de años. Tan pronto como las esporas ingresan a los organismos humanos o animales, así como a los alimentos enlatados, germinan y se convierten en una fuente de enfermedades infecciosas graves. Las esporas son una forma infecciosa de bacterias formadoras de esporas, entre las cuales las más peligrosas son B. anthracis (agente causante del ántrax), B. cereus (toxicoinfección), así como representantes del género Clostridium - C. botulinum (botulismo), C. perfringens (gangrena gaseosa) y C. difficile (infecciones nosocomiales). La relevancia de la investigación y la prospectividad del estudio de las esporas media la necesidad de revelar su estructura bioquímica, los mecanismos moleculares de estabilidad, así como la detección e indicación mediante herramientas analíticas modernas. Las estructuras supramoleculares caracterizadas de endo y exosporas se convierten en un objetivo para las biotecnologías modernas sobre el principio de "aprender de la naturaleza". Estos sistemas biológicos son modelos en perspectiva para el envasado y la entrega dirigida de enzimas, ácidos nucleicos, antígenos y fármacos a tejidos, células e incluso orgánulos intracelulares específicos para el tratamiento de tumores cancerosos y la creación de vacunas termoestables. Las propiedades únicas de las esporas bacterianas pronto encontrarán aplicación en tecnologías de ecosistemas como biofungicidas y bioinsecticidas en la agricultura, así como en biorremediación y biomineralización.

Palabras clave: Esporas bacterianas Endosporas Exosporas Estructura de esporulación Microscopía de fuerza atómica (AFM) Espectroscopía Raman (RS) Biotecnologías modernas

Introducción

La mayoría de los microorganismos se clasifican ampliamente en categorías gramnegativas y grampositivas, según la presencia de una membrana externa y el grosor de la capa de peptidoglicano. En caso de condiciones ambientales extremas, algunas bacterias grampositivas, que incluyen la mayoría de microorganismos patógenos para el ser humano, forman cuerpos extremadamente estables de forma esférica o elíptica: esporas. La nucleación y maduración dentro de la célula madre dio motivo para llamarlas endosporas. Se reconoce que las esporas bacterianas son la forma de vida más estable en la Tierra [1, 2]. Cumplen la importante función de preservar la población bacteriana de las influencias ambientales extremas y son un factor clave en la virulencia de los agentes infecciosos. En algunas especies patógenas de Bacillus spp. y Clostridium spp. las endosporas son agentes infecciosos independientes [3-5].

La lucha contra las esporas bacterianas de bacterias patógenas en las instituciones médicas también es un problema agudo asociado con la prevención de infecciones nosocomiales [3, 6, 7]. En particular, algunas especies patógenas de Clostridium spp. (p.ej, C. difficile) son el agente causal más común de infecciones nosocomiales en el planeta [8-11]. Entre las endosporas detectadas, se identificaron dos categorías: las que están encerradas en una capa exterior esférica (exospora, exosporium) y las que no tienen esta estructura. En contraste con las endosporas bien caracterizadas, el conocimiento del papel y la estructura de la exosporia es menos distinto [5,12-14].

La relevancia de estudiar las funciones enumeradas de las esporas bacterianas en la epidemiología y patogénesis de infecciones peligrosas está asociada con el estudio de su organización espacial, así como los mecanismos moleculares de la formación de resistencia latente. Esto es importante para el desarrollo de nuevas estrategias de esterilización y detección, así como para el uso de estos sistemas biológicos únicos como modelos prometedores para las biotecnologías modernas [8, 15].

Formación de esporas en bacterias grampositivas

Endospora: estructura inactiva, no metabólica y no reproductiva. La capacidad de los microorganismos para la formación de esporas fue una de las características clave de su clasificación inicial [16]. La esporulación, por un lado, es una forma de reacción bacteriana a los cambios ambientales y, por otro lado, una secuencia estrictamente regulada de etapas de expresión génica y el proceso de diferenciación morfológica celular. Como resultado de la formación de esporas, se forman formas celulares metabólicamente inactivas (latentes), cuya morfología es radicalmente diferente de la de la célula vegetativa materna [17-19].

La formación de esporas es una de las manifestaciones de los numerosos mecanismos de adaptación de los microorganismos a la falta de carbono y nitrógeno, pero a diferencia de otras estrategias adaptativas de bacterias, la formación de endosporas dura en promedio unas 8 horas y se desarrolla en varias etapas [20-22 ]. Las esporas bacterianas son extraordinariamente resistentes a factores ambientales extremos, como la falta total de nutrientes, la exposición a antibióticos, desinfectantes, estrategias antibacterianas del sistema inmunológico del huésped, alta temperatura y presión, radiación ultravioleta, radiación y durante mucho tiempo pueden siguen siendo viables [13,21,23,24].

Regulación de la esporulación

La esporulación, por regla general, comienza en la fase estacionaria del ciclo celular vegetativo, se inicia por el agotamiento de los nutrientes y es un proceso morfogenético de ensamblaje de estructuras supramoleculares dentro del citoplasma de una célula vegetativa (esporangios). La formación de esporas comienza con una señal para que la célula vegetativa inicie una cascada de síntesis de factores de transcripción que controlan las etapas de esporulación. Esta transformación se acompaña de cambios sucesivos y significativos en la morfología, bioquímica y fisiología de las bacterias y culmina en la transformación de una célula vegetativa en una forma de reposo [11,25-28].

A principios del siglo XXI, se hizo evidente que muchas reacciones bacterianas a las condiciones ambientales están reguladas por los llamados sistemas genéticos moleculares multicomponentes [16,29-31]. Uno de estos sistemas, en respuesta al estrés alimentario, desencadena la activación de genes de esporulación, entre los que la clave es spo0A, que codifica la síntesis de la proteína Spo0A [22,32,33]. La forma fosforilada de esta proteína (Spo0A

Р), a su vez, inicia la expresión de unos doscientos genes de esporulación (por ejemplo, spoIIE, suspiro, ftsZ y otros), comenzando el proceso de una hora de formación de endosporas. Uno de los genes expresados ​​por Spo0A

Р es suspiro (spo0H), que codifica la síntesis de factores de transcripción sigma específicos de esporas σН y σF, que controlan las etapas de esporulación [12,33-35].

Como resultado, una célula vegetativa sufre una secuencia compleja, pero claramente definida, de eventos morfológicos y bioquímicos, que finalmente conducen a la formación de endosporas maduras (Figura 1). Una vez completada la formación de las esporas, la célula madre se somete a una autólisis programada, liberando una espora madura al medio ambiente [36].

Resistencia al calor de endosporas y ácido dipicolínico (DPA)

La resistencia extrema de las endosporas a condiciones ambientales extremas aún está en estudio. Sin embargo, el mecanismo de su resistencia al calor, aparentemente, es uno de los más complejos. Las endosporas maduras se encuentran en estado de reposo reproductivo y metabólico, actividad enzimática reducida y bajo contenido de compuestos de alta energía (ATP y NADH). La presencia de varias membranas adicionales en comparación con una célula vegetativa es una barrera contra la penetración de agua y sustancias disueltas en ella. La deshidratación protege las proteínas internas de la desnaturalización y la agregación irreversible a temperaturas extremadamente altas, lo que media la capacidad de las esporas para sobrevivir durante mucho tiempo (decenas, cientos o más años) sin un suministro de nutrientes en condiciones en las que las células vegetativas mueren [19,37 -39].

La resistencia al calor de las endosporas es un mecanismo clave para su supervivencia y preservación de la población bacteriana. Como regla general, para asegurar una esterilización confiable de dispositivos médicos, se recomienda un tratamiento térmico de 110 ° C durante 20 min (método de vapor) o 120 ° C durante 45 min (método de aire seco). Sin embargo, los estudios llevados a cabo por R. Scheldeman (2006) y W. Schubert (2011) con sus colegas mostraron que las endosporas pueden sobrevivir después de los métodos estándar de esterilización térmica, y son necesarios regímenes especiales de tratamiento térmico para su destrucción [40,41].

Figura 1: La secuencia de cambios morfológicos que ocurren en diferentes etapas de la esporulación en bacterias grampositivas: inicio de la esporulación por deficiencias de nutrientes, replicación de cromosomas (etapa 0), formación de un hilo axial de cromatina y condensación de cromosomas en los polos de la célula ( etapa I) etapa II - la formación de una partición ubicada asimétricamente que crea dos compartimentos y la separación del material nuclear etapa III - la formación de la disputa primaria y esporangios etapa IV - formación de corteza de esporas diferenciación de prosporas y esporangios etapa V - formación de la etapa VI de la capa externa de las esporas - etapa VII de maduración de las esporas - autólisis de las células maternas y liberación de las esporas. A y B: visualización de la espora mediante microscopía de fuerza atómica (Bacillus subtilis, ATCC 6633). C: detección de ácido dipicolínico mediante espectroscopía RAMAN (fotografías e imágenes de los autores).

El ácido dipicolínico (piridina-2,6-dicarboxílico) (DPA) proporciona una alta resistencia al calor de las endosporas, que forma un complejo de quelato con calcio y otros cationes divalentes y reduce el contenido de agua en las esporas a un nivel muy bajo [21,39 , 42,43]. El DPA representa hasta el 15% de la masa total de endosporas y no se encuentra en las células vegetativas [7,19,21,38,44,45]. A pesar de que el DPA se encontró en las esporas bacterianas hace bastante tiempo [43], la función de esta interesante estructura química no se ha determinado finalmente [19,44,45]. La alta concentración de ácido dipicolínico y su especificidad por las endosporas bacterianas han convertido a este componente en el principal objeto de investigación científica. A principios del siglo XXI A. Driks (2003) y P. Setlow (2006) sugirieron que este ácido, intercalado con el ADN y el ARN mediante enlaces covalentes, forma una matriz polimérica gelatinosa que protege a los ácidos nucleicos del daño a altas temperaturas. [31,46].

El papel principal del DPA para asegurar la deshidratación [37], crear y mantener el reposo metabólico [7], así como la estabilización de proteínas nucleares básicas indiscutible [38,44] y minimizar la probabilidad de su desnaturalización, agregación y lisis [7, 37,38,44] es indiscutible. Durante la germinación, el DPA se libera de las esporas, proporcionando el proceso inverso de hidratación del núcleo y la formación de células vegetativas [19,37]. Las propiedades únicas del DPA de las endosporas han permitido a los biotecnólogos modernos considerarlo como un excipiente (excipiente) prometedor para aumentar la estabilidad y la alta eficacia de las preparaciones de proteínas líquidas biofarmacéuticas y prevenir su agregación inespecífica, por ejemplo, los anticuerpos [38].

Morfología de endosporas

Las observaciones morfológicas de los cambios que ocurren en las etapas de esporulación mostraron que la formación de la estructura espacial de las membranas de esporas comienza con el proceso de invaginación de la membrana citoplasmática y la separación final de las prosporas de la célula madre. La endospora madura tiene una estructura multicapa concéntrica, mientras que el número de capas de proteínas varía en diferentes tipos de bacterias.Sus principales componentes estructurales son el núcleo rodeado por dos capas de peptidoglicanos estructuralmente distintos en la capa interna, que se caracteriza por una baja permeabilidad para moléculas pequeñas y agua [16, 25, 51] y peptidoglicano cortical [27].

El peptidoglicano cortical corresponde estructuralmente a un polímero de pared celular similar de una célula vegetativa. La principal diferencia es la presencia de muramiko-δ-lactama modificada y enlaces cruzados de péptidos entre las cadenas de glucanos [21,44,52,53]. El núcleo se encuentra dentro del citoplasma deshidratado, contiene ácidos nucleicos y compuestos específicos de esporas: ácido dipicolínico, iones metálicos divalentes (Ca2 +, Mn2 + y Mg2 +) y Pequeñas Proteínas Solubles en Ácido (SASP) con un peso molecular de hasta 12 kDa, hasta 20% del número total de esporoproteínas [17,19,34,37].

Estas proteínas, que funcionan como una barrera molecular, protegen las esporas de la radiación ultravioleta y los radicales de oxígeno activo [17,54,55] y sirven como fuente de aminoácidos para las esporas durante su período de germinación [7,55]. Gracias al uso de espectrometría de masas en la capa exterior, se encontraron más de 70 proteínas diferentes que son difíciles de separar debido a la reticulación química que protege a las endosporas de los efectos destructivos de las enzimas hidrolíticas y fortalece la estructura de la capa. El ensamblaje y la disposición de estos componentes estructurales proteicos de las endosporas asegura su supervivencia y preservación en previsión de las condiciones adecuadas para la germinación [7,21,56,57].

Germinación de endosporas

El interés científico y práctico en las disputas se debe no solo a sus estructuras bioquímicas que median las estrategias de estabilidad molecular, sino también a los mecanismos de regulación de su transformación en formas vegetativas en condiciones favorables. Tales condiciones ocurren cuando las esporas ingresan a humanos o animales, donde germinan y se convierten en patógenos de infecciones peligrosas. Por ejemplo, debido a la germinación de B. anthracis esporas en macrófagos pulmonares, una forma de ántrax pulmonar [26, 58, 59, 60].

Al igual que la esporulación, la germinación de las esporas es un proceso igualmente complejo y estrictamente regulado que se desarrolla en varias etapas [37,45,61]. La germinación de las esporas en la naturaleza es iniciada por nutrientes (aminoácidos, carbohidratos, nucleósidos de purina o combinaciones de los mismos). Los sustratos de nutrientes interactúan con los receptores de la membrana interna de las esporas e inician el programa de germinación, que en algún momento se vuelve irreversible. El programa comienza con la liberación de ácido dipicolínico, iones de hidrógeno y cationes divalentes y su sustitución por agua, lo que provoca un aumento del pH del núcleo de 6,5 a 7,7 y la hidrólisis de la corteza de peptidoglicano.

Estos cambios son importantes para el posterior aumento de la actividad enzimática y, en última instancia, el metabolismo de las células futuras, acompañado de síntesis macromolecular. En este caso, la espora se hincha y aumenta de tamaño no solo como resultado de la absorción de agua, sino también como resultado del crecimiento celular debido al material de reserva [5,14,45,62]. Además, las membranas se rompen bajo la influencia de la presión causada por el crecimiento y una nueva célula vegetativa emerge de la membrana de esporas destruida [57]. Basado parcialmente en este mecanismo de germinación, se basa un método de esterilización fraccionada. Incluso si la espora no ha crecido, pero se ha producido la hidratación, el proceso es irreversible; primero debe convertirse en una célula vegetativa [45,56]. Para la germinación de las endosporas, la membrana de glicoproteína externa, el exosporium (exospora), que proporciona su conexión con el medio ambiente, es de particular importancia.

Exosporium: determinantes moleculares en la superficie de las endosporas

La organización espacial de las exosporas: Como ya se mencionó, en algunas endosporas de bacterias grampositivas formadoras de esporas, una capa de proteína externa adicional, el exosporio, forma una barrera al medio ambiente durante la esporulación [3, 18, 63, 64, 65]. En los últimos años, se han realizado estudios de exosporium principalmente en aislamientos de tres especies principales estrechamente relacionadas de bacterias formadoras de esporas (tipo Firmicutes) incluidas en el Bacillus cereus grupo sensu lato: B. anthracis (agente causante del ántrax), y B. cereus (agente infeccioso transmitido por los alimentos) y B. thuringiensis (insecticida bacteriano) [13,66,67,68]. Además de ellos, las exosporas forman algunas especies de Clostridium spp. [9,12,69-73].

Las arquitecturas de exosporas de las bacterias de estos grupos tienen una morfología similar [13]. Por lo general, son una capa flexible pero fuerte: una capa basal de proteína delgada y continua, que tiene capas cristalinas externas, capilares e internas. Las características sutiles de la exosporia pueden variar en diferentes condiciones de crecimiento y en diferentes tipos de bacterias [68,74-79].

El uso de métodos modernos de biología molecular ha ampliado significativamente la comprensión de la estructura bioquímica y la organización espacial de las estructuras exosporiales de la familia Bacillus spp y Clostridium spp. (Figura 2). El exosporio de estas bacterias es una estructura de capa delgada y flexible, que suele ser mucho más grande que la densa endospora ubicada en el interior [5, 14].

El principal elemento estructural de las exosporas en diferentes tipos de bacterias es una fina capa de proteína basal cristalina [12,13,80]. La superficie exterior de la capa basal tiene una capa vellosa ("pelusa"), que está representada por filamentos similares al colágeno en el exosporio de las bacterias del grupo. B. cereus proteína sensu lato BclA [12,78,79,81,82]. Resultó que esta glicoproteína juega un papel importante en la protección de las esporas de la fagocitosis [21,78,79]. Además, recientemente se demostró que media el mecanismo de inhibición inmunitaria, lo que contribuye a la conservación de las esporas en los pulmones de los ratones [1,83]. La región entre la capa basal del exosporio y la capa exterior de la endospora se denomina espacio intermedio [26,60] y mide aproximadamente 500 nm [67]. En algunos lugares, la capa basal se encuentra muy cerca de la capa exterior de la membrana de endosporas. La capa basal de exosporium tiene un espesor de aproximadamente 12 a 16 nm y consta de dos subcapas de aproximadamente 5 nm de espesor [26,67].

La capa basal tiene una organización estructural cristalina con simetría de 6 veces y un intervalo periódico de 7 nm. La superficie exterior de esta estructura está formada por una serie de copas cóncavas hexagonales en forma de panal, con extremos abiertos orientados hacia el exterior [17]. Los canales semipermeables con un diámetro de 20 a 34 Å se encuentran entre las copas [17,84,85], lo que es suficiente para la penetración de sustancias de bajo peso molecular, pero demasiado pequeño para la difusión de proteínas de gran peso molecular. Esta estructura de canal proporciona las propiedades de barrera de la exosporia [17,67,84].

Los filamentos peludos de exosporas, generalmente compuestos por proteína BclA, tienen una longitud de 14 a 70 nm y cubren toda la superficie de la capa exterior de la capa basal [67,81,82,86,87]. Estudios recientes han demostrado que, a diferencia de otras bacterias del B. cereus grupo sensu lato, en el B. megaterium exosporium (cepa QM B1551), los filamentos de pelo estaban localizados en un solo polo y consistían en proteínas ortólogas BclA y BclB, así como proteína BxpB (ExsFA) [55,88-91].

Figura 2: Visualización AFM y representación esquemática de endo y exosporas: A - exosporas de B. cereus, cepa XXXX B - exosporas de B. cereus, ATCC 11778 C - exosporas de B. cereus, AACC 14579 (microscopía de fuerza atómica) D - organización estructural de endo y exosporas (fotografías e imágenes de los autores).

Síntesis de Exosporium y su estructura bioquímica. La estructura bioquímica del exosporium, que difiere significativamente de la estructura de las endosporas, ha sido objeto de muchas revisiones [13,26,88,92]. El proceso general de biosíntesis de exosporium se ilustra mediante el modelo conceptual de "tapón de botella" e incluye dos etapas con respecto a B. anthracis [60,75,92-94]. El inicio de la síntesis ocurre en el polo central de la espora. Primero, el embrión de la futura exospora aparece en forma de una pequeña estructura en capas en la célula madre formadora de esporas. La exospora se ensambla mediante la precipitación posterior de proteínas y comienza a partir de la síntesis del "casquete", el área ubicada cerca del polo central de la espora materna, que incluye aproximadamente el 25% de la superficie de la capa basal y termina con el formación de la parte restante "sin tapón" ("botella") del exosporio (alrededor del 75%). La síntesis termina en el polo opuesto de la espora después de unir la capa basal de la exospora a la capa exterior de la espora. Estudios realizados en los últimos años sobre B. anthracis y las cepas de B. cereus han demostrado que varias proteínas participan en diferentes etapas de la biosíntesis de regiones individuales de exosporium, que en última instancia media su compleja estructura bioquímica [25, 55, 67, 95].

En el estudio de aislados mutantes de B. anthracis J.A. Boydston y col. y C.T. Steichen y col. por primera vez, se encontró que la capa basal de exosporia no es una estructura bioquímicamente homogénea, difieren en la composición de proteínas [23,74]. Por ejemplo, CotY es una proteína específica del casquete, mientras que las proteínas BclB, ExsY, BhrB (también conocidas como ExsFA), ExsFB y BclA son específicas para el resto del exosporio [23,89,91]. De estas proteínas, CotY y ExsY están involucradas en la biosíntesis de exosporia en las etapas iniciales de la formación de la base de la capa basal, mientras que ExsFA y ExsFB - en las etapas finales [74,88]. Además, ExsFA (proteína de exosporium que pesa 17 kDa) se encuentra tanto en la región "cap" como fuera de ella, mientras que su análogo, BxpB, se encuentra (principalmente) en la parte "no cap" del exosporium [82,90,92 ]. Ambas proteínas (algunos autores ponen un signo igual entre ellas) son necesarias en la etapa de formación de filamentos de la capa vellosa [23,67,82,90].

Entre las proteínas involucradas en la biosíntesis del exosporium, la glicoproteína BclA merece una atención especial. C. Steichen y col. y T.N. Brahmbhatt y col. utilizando un modelo de la proteína BclA glicosilada recombinante de B. anthracis aislado, se encontró que esta glicoproteína proporciona la hidrofobicidad general de las exosporas [92] y también tiene propiedades inmunogénicas [77], lo que determina la oportunidad de uso potencial de BclA para el desarrollo de la vacuna contra el ántrax. En los experimentos, el antígeno rBclA específico mejoró la protección de los ratones infectados con B. anthracis esporas, que activan la fagocitosis y simultáneamente inhiben la capacidad de germinación de las esporas dentro de los macrófagos, que se sabe que es el mecanismo clave de la patogénesis del ántrax [77,87,88,92].

La exospora se adhiere a la capa exterior de la membrana de la endospora a través de interacciones de las proteínas interdimensionales CotY, ExsA, ExsB, ExsY y ExsM con la proteína de endospora CotE [14,35,66,74,88]. Las mismas proteínas determinan la estructura bioquímica del exosporio [66,93-95]. Al considerar la secuencia de etapas de la biosíntesis de exosporium, es de interés la dinámica temporal de la aparición de glicoproteínas específicas y su inclusión en el proceso. La primera, aproximadamente 4-5 horas después del inicio de la esporulación, en el citoplasma de la célula madre se encuentran las proteínas BclA y ВхрВ que participan, como se mencionó anteriormente, en la síntesis de revestimientos vellosos. Además, la glicoproteína ВхрВ es la proteína principal de la capa basal. Estas proteínas aparecen por primera vez como un complejo de proteínas de alto peso molecular, cuyo ensamblaje se produce en el citoplasma de la célula madre (esporangios) mucho antes de que estas proteínas se ubiquen en lugares de desarrollo del exosporio. La aparición de estas proteínas en la célula esporulante en forma de monómeros se produce una hora antes del inicio de la biosíntesis de exosporia [89]. La participación posterior del monómero BclA incluye los pasos de su unión covalente a la proteína de la capa basal de ВхрВ y la glicosilación posterior [89,90]. Es interesante que los complejos de proteínas que contienen BclA y ВхрВ tengan un peso molecular similar y que los enlaces proteína-proteína en ellos sean estables al hervir en presencia de SDS al 1%, urea 8 M y agentes reductores [89,91]. .

J. Manetsberger y col. (2015 y 2018) investigaron el papel de los ortólogos de las proteínas CotW y CotX de B. subtilis codificadas por los genes del plásmido cotW y cotX en el B. megaterium exosporium [20,55]. Estas proteínas forman parte de la capa más externa de las esporas de B. subtilis, la llamada corteza, que posiblemente representa una estructura de exosporium vestigial en esta especie bacteriana [62, 96]. Se reveló que estas proteínas son un componente clave de la capa basal de la B. megaterium exosporium y en su papel estructural corresponden a las proteínas CotY y su parálogo ExsY (ausente en B. megaterium) en la exosporia de B. cereus y B. anthracis [74,88,95].

Sin embargo, la complejidad de la estructura bioquímica de la exosporia no termina ahí. Estudios previos realizados por V.M. Thompson y col. (2011 y 2012), mostraron que la capa basal consta de dos (y posiblemente más) subcapas: la interior (temprana), que consta de dos glicoproteínas CotY (región "cap") y ExsY (región "no cap"), y más tarde (externa), que consiste principalmente en proteínas WhpB y ExsFB [90,91]. Las proteínas estructurales de Exosporium determinan sus propiedades [45]. La superficie exterior de la capa basal se compone principalmente de glicoproteína BclA, que desempeña un papel importante en la protección de las esporas de los macrófagos [84,87]. Recientemente, se demostró que esta proteína media el mecanismo de inhibición inmune [86,97], que contribuyó experimentalmente a la preservación de esporas en los pulmones de ratones. Las enzimas que forman las exosporas, la inosina hidrolasa y la alanina racemasa [85,88,94] pueden inhibir la germinación prematura de las esporas [98,99]. Sin embargo, la principal proteína que determina la estructura del endosporium durante mucho tiempo se desconocía.

S. Jiang y col. (2015) y Terry et al. (2017) con base en los resultados obtenidos por cristalografía electrónica, se concluyó que la proteína ExsY es crítica en la formación de la red cristalina de exosporium y el principal componente estructural de su capa basal [28,63]. Según los autores, la misma proteína determina la estructura cristalina hexagonal del exosporium mediante la unión del disulfuro de los residuos de cisteína dentro de las cadenas polipeptídicas ExsY individuales y sus subunidades [18,28,63].

Estos enlaces disulfuro son la base de la capacidad de ExsY y su homólogo CotY para autoensamblarse en una red cristalina ordenada de alta simetría para el ensamblaje estable de exosporia en todas las especies de Bacillus spp. y Clostridium spp. - fuerte y flexible, capaz de formar pliegues para aumentar la adherencia a la superficie [74,88]. Como se sabe, la adhesión es un factor importante de virulencia en este tipo de bacterias [8,9,17]. Parecería que la cuestión de las proteínas básicas, que determina la estructura del exosporium, está cerrada, sin embargo, en 2018 P. Calderón-Romero et al. realizaron interesantes estudios de exosporas en un modelo de una de las especies Clostridium spp. (C. difficile), que, como se mencionó anteriormente, es actualmente la principal causa de infección nosocomial en el mundo [10].

Encontraron que durante la esporulación, todos analizaron C. difficile Las cepas formaron dos tipos morfológicos de exosporia:

una. Esporas con una fina capa de exosporia y

B. Esporas con una capa gruesa de exosporium [9,10,74,69,70].

A pesar de la falta de evidencia experimental, los autores sugirieron que cada morfotipo aparentemente juega un papel diferente en la patogénesis de la infección asociada con C. difficile [10 69,70]. Es de destacar que, a pesar de las diferencias ultraestructurales, la capa vellosa exterior se encontró en ambos morfotipos de exosporas [9,10,69]. El mismo grupo de investigadores, utilizando un método sin gel para el análisis de la capa de exosporium y métodos de extracción combinados, reveló la presencia de 184 proteínas en la capa de exosporium [10,70]. Se descubrió que algunas de las proteínas identificadas eran inmunogénicas (BclA, CdeC, CdeM, CotA, CotCB y CotE) ​​y se identificaron como sustancias antigénicas potenciales para la creación de vacunas [65,70 99-101].

En este grupo de proteínas, se prestó especial atención a las proteínas BclA de exosporas similares al colágeno, que forman estructuras de filamentos de cabello [69, 70, 73]. C. difficile genomas (bcla1, bcla2 y bcla3) codifican tres parálogos BclA similares al colágeno (BclA1, BclA2 y BclA3) [65], que se localizan exclusivamente en el C. difficile exospora [10]. Dado el hecho de que BclA2 y BclA3 están ampliamente presentes en la mayoría de las cepas de estas bacterias, es posible que las vacunas desarrolladas sobre su base puedan proporcionar protección inmunológica contra cepas clínicamente significativas.

Se encontró que las proteínas ricas en cisteína CdeC y CdeM C. difficile están involucradas en el ensamblaje de la capa de esporas de exosporas [10,32,64], mientras que CdeM es única para esta especie de clostridios [10], mientras que la proteína CdeC se encontró en varios miembros de la familia bacteriana Peptostreptococcaeace [32]. La ausencia de estas proteínas reduce la patogenicidad de C. difficile [10]. Estas proteínas son estructurales y resultaron ser altamente inmunogénicas [32,64,102,103]. Los datos experimentales indican que son de interés para las biotecnologías inmunes como posibles antígenos para el desarrollo de nuevos tipos de vacunas. Por ejemplo, la inmunización de ratones con proteína CdeM demostró una respuesta inmune específica de IgG [103]. En ratones vacunados con CdeM, se logró una eficacia protectora del 90% después de la contaminación de C. difficile. Vacunación de hámsteres con la proteína CdeM de la cepa recombinante 630 C. difficile mostró una eficiencia del 80% [102,103,104]. Esto es sorprendente dado que la proteína CdeM es exclusiva de C. difficile. Experimentos adicionales, por ejemplo, con la inclusión de adyuvantes en la composición de la vacuna CdeM para formar más rápidamente una respuesta inmune específica pronunciada y duradera, pueden aumentar su efecto protector [102,105-109].

La inmunización de ratones con proteína CdeC rica en cisteína provocó una respuesta inmune IgG significativa después de tres inmunizaciones con CdeC recombinante IP [103]. Se encontró que CdeC es una proteína inmunogénica [3,64]. La eficacia protectora de los ratones vacunados con CdeC fue del 100% después de la infección con C. difficile (cepa UK1).La vacunación posterior de hámsteres con tres dosis de CdeC recombinante mostró una supervivencia del 100% de los hámsteres inmunizados después de la infección con C. difficile (cepa 630) [9,69].

El papel del Exosporium en el proceso infeccioso: El principal objeto de investigación sobre el papel del exosporium en el proceso infeccioso fue el agente causante antropozoonótico del ántrax, B. anthracis, que pueden formar esporas en condiciones aeróbicas [13,84,89-94]. La etapa inicial de infección del cuerpo ocurre en gran medida con la participación activa del exosporium, es decir, la interacción de su glucoproteína de colágeno de superficie BclA con la integrina leucocitaria Mas-1 (αMβ2, CR3), que es una molécula de adhesión [26,60,110] .

Cuando las esporas de patógenos ingresan al organismo huésped, son absorbidas por macrófagos y células dendríticas, que inician las manifestaciones clínicas y la forma de la enfermedad (pulmonar, cutánea o gastrointestinal) [89,90,111-113]. En cualquier forma de la enfermedad, los fagocitos migran por la linfa generando un proceso infeccioso. Las esporas germinan dentro de los fagocitos y células dendríticas, se multiplican y producen toxinas. En los ganglios linfáticos, las células se lisan y se liberan formas vegetativas de bacterias, seguido de la invasión del torrente sanguíneo, la reproducción activa y la producción de toxina, que media las manifestaciones clínicas de la infección y conduce a la muerte. La etapa de formación de esporas ocurre solo en el suelo, en condiciones de acceso suficiente de oxígeno, que es un inductor de la esporulación [100,114-116].

Por tanto, el vínculo clave en el proceso infeccioso es la unión de las exosporas de patógenos a la integrina y su fagocitosis. C. Oliva y col. y J. Bozue et al. mostró que el exosporio de B. anthracis, desprovisto de la proteína BclA, no se une a la integrina [104]. Se demostró que el desoxisacárido de ramnosa, que forma parte de BclA, se une a CD14 y actúa como correceptor cuando interactúa con la integrina Mas-1, promoviendo la fagocitosis [78,79,110]. Los datos presentados indican el papel principal de la glicoproteína del exosporium BclA en la patogénesis del ántrax.

A pesar de que en los últimos años se ha logrado un progreso significativo en el esclarecimiento de la estructura y funciones del exosporium, nuestra comprensión de la composición, los mecanismos de su formación y el papel de esta estructura externa de esporas bacterianas sigue siendo insuficiente [10,13, 55,117]. Es probable que el uso de métodos analíticos modernos del arsenal del concepto de microbiología molecular de células individuales (microscopía de fuerza atómica, espectroscopía Raman, genética) en el estudio de estas estructuras se convierta en la clave para una comprensión más completa de la morfología, nanomecánica y características bioquímicas de las exosporas [15,117,118].

Métodos analíticos modernos de microbiología molecular para la visualización y el estudio de esporas bacterianas

Microscopía de fuerza atómica (AFM): de la formación de imágenes a la manipulación atómica. Recientemente, una de las tecnologías analíticas de investigación científica que se desarrolla de forma más dinámica y se utiliza más activamente es la microscopía de sonda de barrido. Una de sus herramientas más conocidas es el microscopio de fuerza atómica, inventado en 1986 como un perfilómetro de túnel de barrido [Binning, 1986]. Desde los años 90 del siglo pasado, la Microscopía de Fuerza Atómica (AFM) se ha utilizado más activamente en la investigación biomédica, gracias a un sencillo procedimiento de preparación de muestras y la posibilidad de visualización submicrónica de objetos biológicos [30,119-122].

Durante un breve período de tiempo, el AFM como método de visualización tridimensional y de investigación de las propiedades micromecánicas locales ha ganado posiciones de liderazgo en muchos campos de la ciencia, incluidos los estudios microbiológicos [30,120,123]. Esta herramienta analítica complementó y amplió las capacidades de los principales métodos de visualización de los microbiólogos: microscopía óptica (va más allá de su resolución técnica), así como microscopía electrónica, cuyo principal inconveniente es la complejidad de la preparación de las preparaciones y la necesidad de investigación. en alto vacío [120,124,125].

El atractivo de usar AFM en microbiología está asociado con algunas características técnicas específicas de este método de diagnóstico, basadas no en las propiedades de las lentes, sino en el uso de una sonda especial (sensor) que analiza la superficie de la muestra con una aguja en un voladizo elástico delgado y flexible instalado en el soporte (Figura 3). Esta herramienta de visualización combina la microscopía en el sentido habitual con la detección nanomolecular de las propiedades mecánicas, inmunoquímicas, adhesivas y electrostáticas de un objeto (bacteria). Estas capacidades han convertido al AFM en una herramienta extremadamente útil e indispensable de la microbiología molecular, y las células procariotas, por su tamaño y propiedades, se han convertido en un objeto favorable para la investigación [120,126,127]. Como resultado del escaneo, el AFM presenta una imagen topográfica digital tridimensional de la superficie de los microorganismos en resolución nanométrica lateral y espacial en cualquier medio ya diferentes temperaturas [125,127].

En un corto período de tiempo, AFM ha evolucionado de un método de imágenes topográficas a un instrumento para manipular átomos individuales y estudiar interacciones intermoleculares.

Figura 3: El sistema de imágenes ópticas AFM consta de un rayo láser dirigido a la superficie reflectante de la consola y un fotodiodo de 4 secciones que fija los desplazamientos verticales y laterales de la sonda (A). En el proceso de escaneo de las esporas de B. subtilius después de la esporulación (B) y la germinación (C), el sistema electrónico registra y la computadora registra la posición de la sonda en cada punto de la superficie fija del objeto con coordenadas (X, Y, Z). Una computadora convierte la información de un escáner piezoeléctrico en una imagen tridimensional (dibujo y fotografía - autores).

Considere las posibilidades de AFM en el estudio de esporas bacterianas

Las observaciones periódicas de la fuerza atómica de las endosporas bacterianas permiten rastrear los procesos dinámicos asociados con la esporulación o la germinación en las células vegetativas. Es esencial para los estudios microbiológicos de las esporas de bacterias la posibilidad de utilizar AFM en varios modos. En el modo topográfico ("esfuerzo constante"), la desviación del voladizo se mantiene constante mediante el uso del circuito de retroalimentación. En este caso, la fuerza de interacción de la aguja con la superficie de la muestra depende en gran medida de la distancia entre ellas y está determinada por la adhesión, así como por las interacciones de van der Waals y capilares. La posición Z de la consola refleja la topografía (altura) de la muestra según el tipo de mapa geográfico, donde el color de la imagen corresponde a la altura del relieve [120,122,127].

Al ser un método de detección de fuerza, el AFM permite obtener no solo una imagen de la topografía de la superficie y la arquitectura multicapa de las esporas, sino también sus características nanomecánicas como elasticidad, viscosidad y adhesión [15,125-127]. Esta práctica permite obtener simultáneamente información sobre la topografía de la superficie de la muestra utilizando el módulo de Young (módulo elástico) y la adhesión en forma de imagen de alta resolución [119,122,128].

Por ejemplo, los estudios de R. Giorno et al. [26,60] y V. Chada et al. [129], realizadas con AFM en soluciones acuosas, se muestra que la superficie de las esporas de Bacillus spp. tiene una serie de protuberancias nanométricas acanaladas redondas en la capa exterior, orientadas a lo largo del eje longitudinal. R. Zolock y sus colegas demostraron que, basándose en estas características morfológicas, se pueden diferenciar cuatro especies de esporas de Bacillus estrechamente relacionadas [130].

La visualización de esporas en un líquido abre amplias perspectivas para monitorear procesos dinámicos, como la esporulación y la germinación de formas celulares inactivas. Ejemplos recientes interesantes son los estudios de la dinámica de la germinación de las esporas de Bacillus spp. en células vegetativas. Después de 30 min de incubación a temperatura ambiente, se observó un aumento (hinchazón) en el tamaño de las esporas, y después de 5-6 horas, todas las esporas crecieron hasta convertirse en células vegetativas, que inmediatamente formaron una biopelícula [125,127].

A. Li y col. (2016) y T. Morisaku et al. [15,127] demostró las posibilidades modernas de utilizar AFM en el estudio de las propiedades nanomecánicas de las estructuras internas de B. anthracis esporas. Usando una sonda térmica AFM (Thermal Scanning Microscopy, SThM), desarrollaron un método para el corte nanoquirúrgico de esporas utilizando una punta de diamante duro, y se utilizó una sonda blanda para visualizar y caracterizar sus estructuras internas a escala nanométrica. Se encontró que los indicadores de elasticidad y adhesión a temperaturas elevadas variaban significativamente en diferentes áreas de la sección transversal de las esporas [127], y una ultraestructura de peptidoglicano previamente desconocida de la B. anthracis Se encontró corteza de esporas, que consta de estructuras en forma de varillas de tamaño nanométrico orientadas en la dirección transversal con respecto a las disputas del eje longitudinal [15,118].

Durante los casi 30 años de historia del uso de la microscopía de fuerza atómica en microbiología molecular, se ha convertido en una poderosa herramienta de investigación en el estudio de las esporas, que complementa eficazmente la microscopía óptica, la genética y los métodos bioquímicos tradicionalmente utilizados para analizar la estructura de las esporas bacterianas. . Sin embargo, el uso potencial de este método en el estudio de las formas de células inactivas bacterianas a veces se subestima y está limitado sólo por algunas de sus capacidades funcionales [118,131]. El uso adicional de AFM está asociado con el uso de métodos dinámicos (multifrecuencia, multiarmónicos, bimodales), que permiten obtener características nanomecánicas cuantitativas más rápidas de una estructura compleja de esporas multicapa en mayor resolución [127,132].

Además, es interesante y prometedor desarrollar y utilizar biosensores AFM para la visualización cuantitativa de moléculas individuales de proteínas estructurales de endosporas y exosporium utilizando tecnologías de ADN G-quadruplex o sondas funcionalizadas con grupos químicos individuales o moléculas individuales inmovilizadas en ellos, especialmente en combinación con otros instrumentos analíticos, como la espectroscopia Raman [131-133].

Espectroscopia Raman: nuevas posibilidades del método antiguo

El desarrollo de métodos rápidos y de alta sensibilidad para la detección de esporas bacterianas es un problema urgente para el diagnóstico médico, la epidemiología y también para la resolución de problemas de bioseguridad. La protesta pública provocada por el ataque bioterrorista de 2001, que utilizó B. anthracis esporas, exacerbó el problema de su detección e identificación oportuna del patógeno. El material necesitaba ser germinado en medios nutritivos a formas de células vegetativas, acumulación de biomasa y, finalmente, estudios de genética molecular para identificar el gen del ARNr 16S específico para este tipo de patógeno. Además, se requirieron estudios similares de horas de duración con otros polvos sospechosos para determinar la magnitud del ataque terrorista [79,115,134].

Como resultado, se ha tomado conciencia de la necesidad de buscar nuevos métodos de detección de agentes infecciosos informativos y mucho más rápidos. La información temprana sobre la identificación de un patógeno podría acelerar el inicio de la profilaxis específica, el tratamiento etiopatogenético y minimizar las trágicas consecuencias del ataque asociado con la contaminación y muerte de personas [29,135,136]. El problema de la identificación rápida se complica por una serie de aspectos relacionados con la cantidad mínima de material de prueba: inhalar solo 104 endosporas de B. anthracis (100 ng de polvo) es una dosis letal para el 50% de las personas infectadas. Además, es necesario diferenciar un material patógeno de uno similar pero inofensivo para eliminar el miedo al pánico que acompaña a los brotes epidémicos de infecciones peligrosas [99,115,137].

Por lo tanto, el nuevo método de indicación no solo debe ser rápido, sino también altamente específico y diferenciar de manera confiable las endosporas bacterianas peligrosas de otros objetos biológicos, en cualquier objeto ambiental. La espectroscopia Raman (RS), un método conocido desde hace más de 80 años y que se ha utilizado ampliamente como herramienta analítica y aplicada en los campos químico y técnico, cumple estos criterios [53,86,121].

La baja intensidad de la señal recibida de los objetos vivos ha sido durante mucho tiempo un obstáculo para el uso de la EM en la investigación biomédica. Sin embargo, después de la aparición de varias mejoras en esta tecnología en los últimos 10-20 años (en primer lugar, la combinación de RS con un microscopio confocal, así como varias formas de amplificar la señal Raman), el método comenzó a ser ampliamente utilizado en investigación biomédica sin perder tiempo en las etapas de preparación de la muestra y etiquetado o tinción especial [121]. En particular, esta poderosa herramienta analítica en los últimos años se ha utilizado activamente para una solución rápida, económica y eficaz de los problemas de la microbiología molecular [53] (Figura 4).

El atractivo de RS está asociado con la no invasividad (la capacidad de estudiar bacterias sin destruirlas), la preparación mínima de la muestra, la ausencia de la necesidad de etiquetas y sondas y la velocidad de obtención del resultado. La muestra de prueba se coloca en el foco del láser de excitación y se mide. La información molecular obtenida con la ayuda de RS hace posible identificar de forma única un microorganismo por el espectro específico de sus sustancias químicas y bioquímicas [115,135,136]. Además, la posibilidad de obtener datos sobre la estructura molecular de células bacterianas ubicadas en diferentes fases del ciclo de vida, así como estudiar la dinámica de algunos procesos celulares, hicieron de este método una poderosa herramienta analítica para el estudio de las esporas.

Figura 4: Para el registro de espectros, es importante la posibilidad de amplificar la señal de dispersión Raman debido a la excitación de plasmones superficiales. El uso de nanopartículas de plata u oro como sustrato de SERS aumenta la señal recibida 106 veces (A). Una amplificación tan gigantesca hizo que las señales Raman fueran más intensas y estables que la fluorescencia de las moléculas. Espectros Raman de esporas de B. Subtilius (B) y B. cereus (C). Ilustraciones de los autores.

Posibilidades de RS en el estudio de esporas bacterianas

Hace mucho tiempo que se descubrieron diferencias significativas en los espectros Raman de las formas de bacterias vegetativas y de células de esporas en el estudio de Bacillus spp. Estas diferencias están asociadas con el predominio en los espectros de resonancia de endosporas bacterianas de dipicolinato de calcio (Ca-DPA), cuyos picos principales se detectaron en frecuencias vibratorias de 1015-1017 (cm -1) a una longitud de onda de excitación de 244 nm [ 19,42,43,48,137].

Como se indicó anteriormente, el contenido de este biomarcador es de hasta el 15% del peso seco de las esporas y su contenido varía según la especie, la cepa de bacterias formadoras de esporas y las condiciones de esporulación [38,39,42,48]. Los espectros Raman obtenidos de B. cereus, B. anthracisy las esporas de B. subtilis resultaron ser muy similares, y se propuso el Ca-DPA como un biomarcador sensible para la detección rápida de esporas de Bacillus spp. [138-140]. Entonces, S. Wang et al. (2015 y 2016) estudiaron la cinética y los niveles de acumulación de alcaloides berberina en esporas de Bacillus spp y Clostridium spp. y su efecto sobre su germinación. El objetivo del estudio fue encontrar medios para minimizar el peligro potencial de las esporas germinadas y formas de destruirlas después o durante la germinación. En este estudio, se utilizaron pinzas láser RS ​​en combinación con microscopía de interferencia diferencial y de fluorescencia para analizar la localización, el nivel y la cinética de absorción de la berberina en una espora separada en reposo y en germinación [1.141].

La combinación de métodos AFM y RS es una herramienta analítica muy prometedora para el estudio de esporas bacterianas. Estos sistemas de diagnóstico integrados se han utilizado en microbiología molecular en los últimos años [121,49]. La información sobre las propiedades estructurales topográficas y nanomecánicas se complementa con datos sobre el perfil molecular submicrónico, lo que proporciona una imagen bastante completa y una mejor comprensión de los sistemas inactivos [121]. Por ejemplo, un estudio de R. Boitor et al. (2015) cuantificaron ARN, ADN y proteínas de formas de células bacterianas registrando espectros Raman y modelos de calibración para cada componente estructural y ajustando los efectos focales utilizando una imagen topográfica AFM [142].

En los últimos años, al estudiar las esporas bacterianas, los métodos espectroscópicos han atraído especialmente la atención como el elemento principal para la combinación con otras herramientas analíticas [53,121,143]. Este enfoque interdisciplinario refleja una nueva tendencia moderna y es una tecnología de investigación indispensable para los estudios de múltiples parámetros de la heterogeneidad de las células individuales en microbiología (el concepto de microbiología unicelular), incluidas las esporas bacterianas. Y en este sentido, AFM y RS son ejemplos de nuevas herramientas y métodos analíticos que brindan una oportunidad única para observar fenómenos microbiológicos discretos que son inaccesibles cuando se utilizan enfoques tradicionales.

Las esporas bacterianas como objeto de las modernas biotecnologías químicas y plasmáticas

Las esporas bacterianas se conocen desde el advenimiento de la microbiología como ciencia. Durante muchos años se han examinado desde el punto de vista de la importancia epidemiológica y patogénica para la aparición de infecciones. Como se mencionó anteriormente, la extrema resiliencia en el medio ambiente ha convertido a las esporas bacterianas en un serio problema de salud pública. Los métodos de esterilización existentes (vapor seco y húmedo, sustancias que contienen cloro, radiación γ y otros) no son lo suficientemente efectivos, especialmente en la descontaminación de instrumentos quirúrgicos, equipos médicos o medicamentos. Por tanto, la búsqueda de medios y métodos para la destrucción de las esporas bacterianas ha sido y sigue siendo una tarea científica urgente, muchos estudios multidisciplinares tienen como objetivo solucionarlo.

Para ello, recientemente, se ha planteado la posibilidad de utilizar plasma no térmico (frío), que tiene una temperatura ambiente, que puede utilizarse para procesar objetos termosensibles y se considera como una alternativa potencial a los métodos tradicionales de esterilización [143-146].

Dicho plasma se genera por la acción sobre un gas (por ejemplo, cualquiera de los inertes) de campos eléctricos o electromagnéticos. La energía de campo provoca la aceleración de los electrones libres e ioniza los átomos y moléculas del gas.Los átomos y moléculas excitados, que vuelven a un estado más estable, emiten un exceso de energía en forma de radiación electromagnética y ultravioleta, así como formas activas generadas de oxígeno y nitrógeno con amplios espectros de acción antimicrobianos, incluidos potentes, [147-149]. Las aplicaciones más estudiadas de esta tecnología en el campo de la biología y la medicina son la esterilización de productos, la descontaminación de equipos médicos, los implantes quirúrgicos y el tratamiento de superficies de heridas [148,150,151]. Inactivación rápida (segundos-minutos) y eficaz con plasma frío de formas celulares latentes y vegetativas de bacterias patógenas gramnegativas y grampositivas, incluidas las esporas de Bacillus spp. y Clostridium spp., despertó un interés considerable de los microbiólogos [152-154]. Se centra principalmente en el estudio y caracterización de la eficacia antimicrobiana del plasma, así como en los mecanismos de inactivación microbiana y acción esporocida, que actualmente se están estudiando activamente [147,155,156].

Conclusión y perspectivas

Las esporas bacterianas son sistemas biológicos únicos y extremadamente inertes, cuyos mecanismos se oponen a condiciones extremas no se comprenden completamente. Comprender los mecanismos de resistencia de estas formas latentes es de gran importancia biomédica y puede conducir potencialmente a nuevos métodos de prevención y esterilización, que estarán dirigidos a estructuras vulnerables de endo y exosporas. La larga historia del estudio de las endosporas nos permitió hacer un análisis detallado y una descripción del proceso de esporulación y germinación en microorganismos modelo seleccionados, para crear una base sólida para comprender los procesos celulares que conducen a la formación de estas formas latentes, en parte para aprender los diversos mecanismos de su estabilidad. El resultado de estos estudios fue la creencia conceptual de que la alta resistencia de las esporas bacterianas puede ser valiosa y de aplicación directa en varios campos de la biotecnología.

Actualmente, su investigación continúa a un nuevo nivel nanoestructurado. En particular, las esporas bacterianas son de interés científico como modelo biológico para estudiar los mecanismos de formación de estructuras supramoleculares complejas y se están convirtiendo en un objetivo de la biotecnología moderna sobre el principio de “aprender de la naturaleza” [157-159]. Por ejemplo, el desarrollo del uso de modelos de la arquitectura natural de las endosporas para crear estructuras supramoleculares autoorganizadas que se utilizan como sustratos nanométricos para el empaquetamiento y la entrega dirigida de enzimas, ácidos nucleicos, antígenos y fármacos a ciertos tejidos, células e incluso orgánulos intracelulares. es muy prometedor [160-162]. Estas superficies se pueden utilizar como biorevestimientos o interruptores moleculares impulsados ​​por productos químicos, electrones o luz [163,164].

También se considera el uso directo de endosporas, pero existe un riesgo significativo asociado con la germinación y el crecimiento vegetativo de bacterias antes de alcanzar el tejido objetivo. Sin embargo N.G. Roberts y colegas (2014) utilizaron las endosporas de C. histolyticum y C. novyi en un experimento. Los investigadores encontraron que durante la germinación y el crecimiento vegetativo, estas especies causaron la lisis de las células tumorales o la regresión del tumor [158,165].

Otra área asociada con el uso de esporas en el tratamiento de tumores cancerosos es la expresión selectiva de enzimas específicas con la germinación predominante de latentes en los tumores hipóxicos [162]. Desde principios del siglo XXI, se han realizado estudios sobre el uso de esporas bacterianas recombinantes para crear vacunas termoestables [157,158,165]. En 2007, N.Q. Uyen y col. [160] realizó un experimento exitoso en la protección de ratones contra el tétanos mediante la administración oral o nasal de vacunas diseñadas en base a la C. tetani Antígeno TTFC en la superficie de las esporas de B. subtilis. Las perspectivas de estas biotecnologías se evidencian en estudios piloto [163,164]. Publicaciones recientes [10,37,159] han sugerido que las esporas y las bacterias formadoras de esporas pueden desempeñar un papel importante en el desarrollo y la propagación de la resistencia a los antibióticos debido a sus propiedades biológicas, su capacidad para dispersarse y, por lo tanto, la propagación de genes de resistencia a los antimicrobianos. sustancias en estado de reposo metabólico [10,37,159].

Es probable que las propiedades únicas de las esporas bacterianas encuentren aplicación en otras tecnologías de ecosistemas en un futuro próximo, por ejemplo, en sondeos paleoecológicos, como biofungicidas y bioinsecticidas en la agricultura, así como en la biorremediación y biomineralización (procesos de mineralización controlados e inducidos biológicamente que ocurren en naturaleza).

Referencias


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Materiales y métodos

Cepas bacterianas, crecimiento y condiciones de esporulación

Bacillus subtilis PS533 y la cepa mutante B. subtilis En este estudio se utilizó PS4150 (proporcionada por el Departamento de Biología Molecular, Microbiana y Estructural del Centro de Salud de la Universidad de Connecticut, Estados Unidos). La cepa PS4150 tiene una capa de esporas defectuosa debido a la deleción de la mayoría de redil y gerE secuencias codificantes (Ghosh et al., 2008).

Para la esporulación, los cultivos se obtuvieron inoculando dos o tres colonias frescas en 50 ml de medio complejo (CM): 10 g / L de extracto de carne (Biokar, Francia), 2 g / L de extracto de levadura (Biokar, Francia), y 0.04 g / L de MnSO4 (Sigma-Aldrich, Francia) (Andr & # x00E9 et al., 2013). Después de la incubación durante aproximadamente 24 h (hasta 0,4 & # x003C OD600 & # x003C 0,6), se esparcieron 0,4 ml del cultivo en agar CM (CMA) en placas de Petri (CM suplementado con 15 g / L de agar, Biokar, Francia). La esporulación se controló usando microscopía de contraste de fases. Cuando se observaron más del 95% de esporas de fase brillante, las esporas se recolectaron inundando las placas de agar con agua destilada estéril fría y raspando la superficie del agar con un esparcidor de células estériles. A continuación, se centrifugaron las suspensiones de esporas (3600 gramo, 15 min, 4 & # x00B0C), y las esporas se suspendieron en 0,2 & # x03BCm de etanol filtrado al 70% (filtro: acetato de celulosa, Sartorius, Francia etanol: Elvetec, Francia) durante 1 h para inactivar las células vegetativas (Koransky et al. ., 1978). A continuación, las esporas se lavaron tres veces mediante centrifugación sucesiva (3600 gramo, 15 min, 4 & # x00B0C) y suspensión en agua destilada estéril a 4 & # x00B0C. Las esporas se enumeraron [en unidades formadoras de colonias (UFC) / ml] en medio de caldo Luria (LB) (Sigma-Aldrich, Francia). Las suspensiones de esporas se estandarizaron para obtener una concentración final de 108 UFC / ml y se almacenaron a 4 ° C. Para los experimentos de microspectroscopía FTIR sincrotrón, las suspensiones de esporas finales se estandarizaron para obtener una concentración final de 109 UFC / ml, se congelaron durante la noche a & # x221280 & # x00B0C y se liofilizaron (FreeZone 18, Labconco, Kansas City, Estados Unidos) . Las esporas se almacenaron a 4 & # x00B0C durante un máximo de 1 mes hasta su uso.

Muestras de tratamiento y control HP

Las pruebas de alta presión se realizaron en un recipiente Top Industrie de 700 MPa (Francia) con una cámara de presión de metal de 7 cm 3 (temperatura de trabajo: & # x2212120 & # x00B0C / 120 & # x00B0C). Se utilizó agua como fluido de transmisión de presión. La cámara de presión se sumergió en un baño de agua (Minisat 240, Huber, Alemania) para controlar la temperatura interna y asegurar que el calentamiento adiabático durante la compresión no aumentara la temperatura en más de 5 ° C por encima del punto de ajuste deseado. La tasa de compresión se estableció en 3 MPa / s, y la descompresión fue casi instantánea (& # x003C3 s).

Efecto de HP sobre la inactivación, germinación y sensibilidad a la nisina de B. subtilis Esporas

Las suspensiones de esporas iniciales se diluyeron (1: 100) en 0,11 mol / L de 2- (nortetampón de ácido morfolino) etanosulfónico (MES) a pH 6,1 (Sigma-Aldrich, Francia) para alcanzar una concentración final de aproximadamente 10 7 UFC / ml. Se eligió el tampón MES porque su pH varía solo ligeramente con la temperatura y la presión (& # x0394pKa / & # x00B0C = & # x22120.011 pH varía de 5,5 a 6,5 ​​entre 10 y 1000 MPa a 25 & # x00B0C) (Bruins et al., 2007). Luego, se sellaron con calor 0,5 ml de cada suspensión de esporas en MES en bolsas de polietileno (pipeta de transferencia de polietileno, Dominique Dutscher). Para cada cepa, se tomaron muestras de tiempo cero para determinar la concentración de esporas inicial antes del tratamiento. Las bolsas se colocaron en el recipiente de HP 5 min antes del tratamiento para permitir que se equilibrara la temperatura. Las muestras se trataron a 500 MPa durante 10 min a 20 ° C o 50 ° C y luego se sumergieron inmediatamente en agua helada.

Inmediatamente después del tratamiento, las muestras se dividieron en tres volúmenes iguales. El primer volumen se diluyó en serie y se sembró en un medio LB (15 g / L, Sigma-Aldrich, agar bacteriológico de Francia tipo E, 15 g / L, Biokar, Beauvais, Francia) para determinar el número de células bacterianas en unidades formadoras de colonias por mililitro. El segundo volumen se trató a 80 ° C durante 10 min en un baño de agua para inactivar las esporas germinadas y luego se diluyó en serie y se sembró en placas LB Petri para su recuento. La fracción de esporas germinadas inducidas por HP se calculó como la diferencia entre los recuentos logarítmicos de las tratadas a presión y térmicas (norteHPT) y tratado a presión (norteHP) porciones de las muestras [log10 (norteHPT) - log10 (norteHP)].

El tercer volumen se sembró en un medio LB suplementado con 50 UI / ml de nisina (Sigma-Aldrich, Francia) para evaluar la sensibilización de las esporas a la nisina. Para evaluar el efecto de la nisina sola, se sembraron en placa muestras de control de esporas no tratadas con HP en un medio LB suplementado con nisina. Además, para evaluar la reversibilidad de la sensibilización a la nisina después del tratamiento con HP, las suspensiones de esporas se almacenaron durante 2, 4, 6 o 24 h después del tratamiento con HP antes de sembrarse en un medio LB suplementado con nisina para el recuento (en UFC / ml). Como controles, las esporas tratadas con HP se almacenaron a 4 ° C durante 2, 4 o 6 horas y se sembraron en un medio LB sin nisina.

Microspectroscopia de sincrotrón FTIR de esporas bacterianas

Preparación de la muestra

El stock de esporas liofilizado se suspendió en tampón MES para obtener una concentración final de aproximadamente 107 UFC / ml y se trató a 500 MPa durante 10 min a 20 ° C o 50 ° C, como se explicó anteriormente. Después del tratamiento, las muestras se centrifugaron a 11.200 gramo durante 5 min a 4 ° C, se lavó dos veces en agua desionizada para eliminar el tampón MES y se suspendió en agua destilada.

Como control, se obtuvieron esporas germinadas suspendiendo las esporas liofilizadas en un medio LB (15 g / l, Sigma-Aldrich, Francia) a una concentración final de 107 UFC / ml. Las muestras de esporas en LB se incubaron durante 45 min a 37 & # x00B0C y luego se lavaron dos veces por centrifugación sucesiva (11,200 gramo, 5 min, 4 & # x00B0C) y suspensión en tampón fosfato salino (PBS).

Para obtener esporas inactivadas, las esporas liofilizadas se suspendieron en agua destilada estéril a una concentración final de 107 UFC / ml y se trataron en un baño seco (BSH1001-E, Benchmark Scientific, Edison, NJ, Estados Unidos) a 121 & # x00B0C durante 30 min. Luego se centrifugaron las muestras de esporas inactivadas (11.200 gramo, 5 min, 4 & # x00B0C) y suspendido en agua destilada estéril.

Todas las muestras se almacenaron a 4 ° C durante un máximo de 30 minutos hasta el análisis.

Análisis de muestras mediante microspectroscopia FTIR de sincrotrón

Se realizó microscopía IR de sincrotrón en la línea de luz SMIS en la instalación de sincrotrón SOLEIL (sesión 20160780, Saint Aubin, Francia), como describieron previamente Passot et al. (2015). Brevemente, los espectros se registraron en un microscopio continuo (Thermo Fisher Scientific, Villebon-sur-Yvette, Francia) acoplado a un espectrómetro Nicolet 5700 FTIR (Thermo Fisher Scientific). El microscopio incluye una platina de muestra motorizada y un detector de telururo de cadmio mercurio (MCT-A) refrigerado con nitrógeno líquido. Funciona en modo confocal con una apertura única de doble ruta y utiliza un objetivo de tipo Schwarzschild corregido al infinito x32 y un condensador x32 correspondiente. Los espectros individuales se obtuvieron a una resolución espectral de 4 cm & # x20131, co-sumando 256 barridos en el rango espectral de IR medio de 4.000 a 400 cm & # x20131.

Se depositaron dos microlitros de la suspensión de esporas tratada con HP sobre la base de un cristal ZnSe ATR transparente a IR con un diámetro hemisférico de 4 mm (índice de refracción: norte = 2.4 ISP Optics Corp., Letonia) (Passot et al., 2015). La gota de muestra se secó a temperatura ambiente durante 5 min bajo un suave flujo de aire. Luego se colocó el hemisferio bajo el microscopio, su base en un portaobjetos de vidrio. Las esporas bacterianas individuales se localizaron utilizando el objetivo visible. Para cada muestra tratada por HP, se seleccionaron 50 esporas y se registraron sus espectros de IR. Para las muestras de control, se registraron 25 espectros. Además, se localizaron y seleccionaron tres zonas libres de esporas para la señal de infrarrojos de fondo.

Se eligió el modo ATR para mejorar la resolución espacial y enfocarse en esporas individuales. Se iluminó luz de sincrotrón a través de una apertura de 10 & # x00D7 10 - & # x03BCm 2 en el cristal ZnSe ATR, lo que dio como resultado un punto de haz de aproximadamente 4,2 & # x00D7 4,2 & # x03BCm 2 en la superficie del hemisferio debido al alto índice de refracción del cristal, lo que permite medir esporas individuales. Esta alta resolución se obtuvo sin comprometer la relación señal / ruido de los espectros IR gracias al brillo de la radiación IR del sincrotrón (Passot et al., 2015).

Herramientas quimiométricas

Preprocesamiento

Los pretratamientos matemáticos son necesarios para eliminar el sesgo experimental en los datos espectrales. Las técnicas clásicas de preprocesamiento incluyen la corrección de la línea de base, la normalización, las derivadas y el suavizado (Beebe et al., 1998 Wehrens, 2011).

Se calculó una combinación de estas técnicas de la siguiente manera: corrección de la línea de base (para reducir la variación sistemática de la señal de fondo), filtros Savitzky & # x2013Golay (SG) (para reducir la cantidad de variación aleatoria como el ruido) y normalización (para eliminar la variación sistemática asociada con el tamaño de las esporas individuales). Con el pretratamiento de SG, cada punto se reemplaza por una estimación suavizada obtenida de una regresión polinomial local. Este pretratamiento se puede aplicar a los datos brutos, así como a los espectros derivados (primero o segundo). Se requiere la elección de dos parámetros: w correspondiente al tamaño de la ventana en suavizadores polinomiales y pag el orden polinomial. En este estudio, el tamaño de ventana óptimo y el orden polinomial fueron w = 13 y pag = 3, respectivamente.

Todos los análisis se calcularon utilizando R 3.3.2 (R Core Team y R Development Core Team, 2016). El paquete & # x201Cprospectr & # x201D (Stevens, 2015) se utilizó para los filtros SG, y el paquete & # x201ChyperSpec & # x201D (Beleites y Sergo, 2015) se utilizó para los otros pretratamientos.

Reducción de datos

Un único espectro FTIR está representado por 1.867 variables (región de IR de 650 a 4.000 cm & # x20131). Las dos regiones más informativas fueron de 2.800 a 3.050 cm & # x20131 y de 1.500 a 1.800 cm & # x20131, que corresponden a los dominios de lípidos y proteínas, respectivamente. Para retener solo información útil, estas regiones se trataron previamente por separado.

Análisis de componentes principales

El análisis de componentes principales (PCA) es una herramienta quimiométrica exploratoria ampliamente utilizada. Reduce el número de variables mientras proyecta los datos en un nuevo espacio que explica la varianza en el conjunto de datos. Los nuevos ejes, denominados componentes principales (PC), se obtienen a partir de combinaciones lineales de las variables originales, y la variación a lo largo de los primeros PC es máxima. Aquí, las variables son las diferentes longitudes de onda. En consecuencia, son numerosos y pueden solicitarse. En contraste con el PCA tradicional & # x2013 donde las cargas pueden ser representadas por un círculo de correlación & # x2013, las cargas aquí están representadas por una curva que presenta el valor de la carga del PC (ordenadas) de acuerdo con la longitud de onda (abscisas). Así, cada PC se relaciona con una curva que se puede interpretar como un espectro (Cordella, 2012). Los picos positivos y negativos observados en estos espectros corresponden a los dominios espectrales implicados en la discriminación de los espectros. La PCA se realizó utilizando R 3.3.2 (función prcomp en el paquete de estadísticas). La mejor separación de datos se obtuvo utilizando la corrección de la línea de base seguida de SG (w = 13, pag = 3), segunda derivada y normalización.

El análisis de componentes principales se realizó en los espectros de las esporas tratadas por HP a 50 ° C o 20 ° C y en esporas inactivadas, latentes y germinadas (muestras de control). Se procesaron el lípido (3.050 & # x20132.800 cm & # x20131) y las regiones de amida (1.800 & # x201315,00 cm & # x20131). Algunas de las bandas corresponden a picos de absorción de IR bien conocidos asociados con las características espectrales de los grupos de esporas considerados. Estos picos de absorción de IR identificados como indicadores de estructuras específicas de proteínas y lípidos se resumen en la Tabla 1.

Tabla 1. Regiones espectrales principales que indican estructuras de esporas de lípidos y proteínas específicas.


Análisis estructural y mecánico a nanoescala de esporas de Bacillus anthracis inactivadas con calentamiento rápido en seco

FIG. 1 Condiciones de calentamiento y capacidad de formación de colonias de esporas correspondiente, definida como el número de colonias formadas dividido por el número de esporas sembradas. (A) Temperatura constante, diferentes tiempos de exposición (B) Tiempo de exposición constante, diferentes temperaturas. Los datos que se muestran son promedios de 6 réplicas y las barras de error son errores estándar.

Análisis nanomecánico cuantitativo de esporas inactivadas.

Figura 2 Morfología de las esporas mostrada como altura de AFM (A, D y G), error de fuerza máxima de AFM (B, E y H) e imágenes SEM (C, F e I). (A a C) Esporas viables no tratadas (B a F) Esporas inactivadas a 300 ° C durante 10 s (G a I) esporas inactivadas a 800 ° C durante 0,1 s. Tenga en cuenta que debido a las diferencias en la preparación de la muestra para las dos técnicas de imagen, los grupos de esporas específicos en las imágenes AFM no son los mismos grupos de esporas que se muestran en las imágenes SEM. Las puntas de flecha blancas indican pliegues y las flechas blancas indican estructuras en forma de "huecos". Barras en las imágenes SEM, 1 μm. FIG 3 Característica “similar a un hueco” en el borde de algunas esporas inactivadas por un tratamiento de exposición corta a alta temperatura (800 ° C durante 0,1 s). Las estructuras "en forma de hueco" son más pronunciadas en las imágenes SEM y visibles, aunque no tan obvias, en las imágenes de error de fuerza máxima y altura de AFM. Tenga en cuenta nuevamente que las esporas específicas en las imágenes AFM no son las mismas esporas individuales que se muestran en la imagen SEM. Barras, 500 nm.

Análisis nanomecánico de esporas inactivadas. (i) Fuerza de adherencia.

FIG 4 Imágenes representativas de la fuerza de adhesión de AFM de las esporas inactivadas por calor seco rápido. (A) Alta temperatura, exposición corta (800 ° C, 0,1 s) (B) baja temperatura, exposición prolongada (300 ° C, 10 s) (C) esporas viables no tratadas como control (D) gráfico que muestra la fuerza de adhesión media (indicado por ×) y los rangos de datos de percentil 10 a 90 (la parte inferior del área encuadrada muestra el valor para el percentil 10 y la parte superior del área encuadrada muestra el valor para el percentil 90 basado en mediciones de ∼100 esporas seleccionadas al azar ). FIG 5 Superposición de imágenes de error de fuerza máxima de AFM (gris) y fuerza de adhesión (verde). (A) Alta temperatura, exposición corta (800 ° C, 0,1 s) (B, C y D) tres grupos de esporas diferentes inactivados bajo baja temperatura, exposición prolongada (300 ° C durante 10 s). Las flechas blancas en el panel B indican dos esporas con topografías similares pero diferentes patrones de fuerza de adhesión. Barras, 1 μm.

(ii) Módulo de Young.

FIG 6 Módulos de Young de las esporas inactivadas por calor. (A) Esporas calentadas a 800 ° C durante 0.1 s (B) Esporas calentadas a 300 ° C durante 10 s (C) Gráfico de esporas viables sin tratar (D) que muestra el módulo mediano (indicado por ×) y los datos del percentil 10 al 90 rangos (la parte inferior del área del recuadro muestra el valor del percentil 10 y la parte superior del área del recuadro muestra el valor del percentil 90 según las mediciones de ∼100 esporas seleccionadas al azar). Módulo DMTM, módulo Derjaguin-Muller-Toporov. FIG. 7 (A a C) Imágenes típicas de AFM de esporas calentadas a una temperatura intermedia (500 ° C). (D a F) Se incluyeron imágenes de esporas tratadas a 300 ° C durante 0,1 s para la comparación. Tenga en cuenta la notable diferencia en el mapa de fuerza de adhesión: mientras que el patrón de distribución de las esporas en el grupo de 300 ° C fue similar al de las esporas viables no tratadas (Fig. 4C), la imagen de 500 ° C tiene una línea brillante a lo largo de la línea central longitudinal , y algunas esporas (indicadas por una flecha blanca) mostraron estructuras de cables similares a las observadas en las esporas tratadas a 800 ° C (Fig. 4A). Las imágenes se han escalado individualmente para producir el mejor efecto visual.

Efectos del calentamiento continuo más allá de la inactivación.

FIG 8 Esporas calentadas durante 100 sa 300 ° C. (A) Imagen de altura de AFM (B) Imagen de error de fuerza máxima de AFM (C, D y E) imágenes de altura, fuerza de adhesión y módulo de alta resolución de dos esporas representativas dentro del cuadro delimitado por una línea punteada blanca en el panel A.

Evaluación de la integridad de la estructura interna de las esporas. (i) Tinción de ácido nucleico Syto 16 de esporas de B. anthracis.

FIG. 9 Integridad de la estructura interna de la espora evaluada mediante tres métodos diferentes. (A) Tinción de ácido nucleico en esporas (que se muestra como la mediana [×] y la intensidad de fluorescencia del percentil 10 al 90 [cuadro] de las esporas teñidas con Syto 16 según las mediciones de 100 esporas seleccionadas al azar). (B y C) Fuga de ácido nucleico (B) y fuga de componentes de esporas solubles según lo medido por la absorbancia UV 280 (C). Los datos de los paneles B y C son promedios de 6 réplicas y las barras de error son errores estándar. Todos los gráficos se muestran en unidades arbitrarias (a.u.). Valores que son significativamente diferentes (PAG & lt 0.01) se indican con una barra y un asterisco.

RESULTADOS

Papel del SASP y el contenido de agua de las esporas en la resistencia a los rayos UV de las esporas en suspensión acuosa.

Con el fin de confirmar los resultados anteriores sobre la resistencia del tipo salvaje, dacB, y sspA sspB esporas mutantes a UV de 254 nm y para extender estos resultados a longitudes de onda de UV ambientalmente relevantes, se irradiaron muestras por triplicado de esporas en suspensión acuosa con UV de varias longitudes de onda y se determinó la cinética de supervivencia. La resistencia de las esporas se cuantificó calculando la F10 valor, la fluencia UV aplicada que conduce a una supervivencia de esporas de 10 & # x00025 para cada cepa, y el F10 valores comparados por Student t prueba (Tabla & # x200B (Tabla1). 1). En respuesta a los rayos UV de 254 nm, las cepas se comportaron como se informó anteriormente (20, 40) dacB las esporas no fueron significativamente más sensibles que las esporas de tipo salvaje, y sspA sspB las esporas fueron significativamente más sensibles que las esporas de tipo salvaje (Tabla & # x200B (Tabla1). 1). Sin embargo, mientras sspA sspB Las esporas también fueron significativamente más sensibles a las longitudes de onda de UV ambientalmente relevantes [280- a 400-nm y 290- a 400-nm UV-A & # x0002b UV-B & # x0007bUV- (A & # x0002bB) & # x0007d y 320- a UV-A de 400 nm], dacB Las esporas también fueron significativamente más sensibles a los rayos UV que las esporas de tipo salvaje (Tabla & # x200B (Tabla1), 1), lo que indica un papel tanto para SASP de tipo & # x003b1 / & # x003b2 como para la disminución del contenido de agua de las esporas en la resistencia de las esporas a UV ambiental cuando las esporas están en suspensión acuosa.

TABLA 1.

Características de supervivencia de las personas irradiadas con UV B. subtilis esporas en suspensión acuosa a

Descripción de la cepaF10 valor con tratamiento
UV-C, 254 nm (J & # x000b7m & # x022122)UV- (A & # x0002bB), 280-400 nm (kJ & # x000b7m & # x022122)UV- (A & # x0002bB), 290-400 nm (kJ & # x000b7m & # x022122)UV-A, 320-400 nm (kJ y # x000b7m y # x022122)
Tipo salvaje303 & # x000b1 2510.1 & # x000b1 1.514,2 y # x000b1 1,6498 & # x000b1 57
dacB280 & # x000b1 237.7 & # x000b1 1.2 & # x0002a8.1 y # x000b1 1.4 y # x0002a252 & # x000b1 37 & # x0002a
sspA sspB78 & # x000b1 11 & # x0002a5.3 y # x000b1 0.7 y # x0002a6.3 & # x000b1 0.8 & # x0002a159 & # x000b1 26 & # x0002a

Papel del SASP y el contenido de agua de las esporas en la resistencia a los rayos UV de las esporas secadas al aire a la radiación UV-C de 254 nm.

Debido a que los rayos UV germicidas (254 nm) se utilizan a menudo para desinfectar superficies secas y aire de construcción (18, 31), fue interesante comprender la resistencia a los rayos UV de las esporas en el estado de secado al aire. Para ampliar los resultados de estudios previos de resistencia de esporas a UV de 254 nm en suspensión acuosa, se expusieron por cuadruplicado muestras de esporas secadas al aire isogénicas a UV-C de 254 nm y se trazó la cinética de inactivación de esporas y se ajustó al mejor ajuste exponencial líneas (Fig. & # x200B (Fig.1A). 1A). De nuevo, F10 Los valores se calcularon y compararon con el método de Student. t prueba (Tabla & # x200B (Tabla2). 2). Cuando se analizaron los datos para UV-C de 254 nm, se observó que dacB y sspE Las esporas no fueron significativamente más sensibles a UV-C de 254 nm que las esporas de tipo salvaje (Tabla & # x200B (Tabla2) 2) pero las esporas deficientes en SASP - & # x003b1, SASP - & # x003b2, o ambas fueron significativamente más sensible a la radiación UV-C de 254 nm que el tipo salvaje (Tabla & # x200B (Tabla2). 2). Por lo tanto, cuando las esporas secadas al aire de cepas mutantes se compararon con las esporas de tipo salvaje, sus sensibilidades relativas a los rayos UV de 254 nm en el estado de secado al aire fueron cualitativamente comparables a los resultados observados anteriormente con esporas en suspensión acuosa (12, 20, 40 ) (Tabla & # x200B (Tabla1 1).

Curvas de supervivencia de esporas secadas al aire B. subtilis cepas en respuesta a UV-C (A) de 254 nm, UV- (A & # x0002bB) (B) de 280 a 400 nm, UV- (A & # x0002bB) (C) de 290 a 400 nm, o 320 - a radiación UV-A (D) de 400 nm. Las cepas se indican de la siguiente manera: 168 de tipo salvaje, círculos rellenos dacB mutante, círculos abiertos sspA mutantes, triángulos abiertos hacia abajo sspB mutantes, triángulos descendentes rellenos sspE mutantes, triángulos abiertos hacia arriba y sspA sspB cuadrados llenos de mutantes. Los datos se expresan como promedios y desviaciones estándar (norte & # x0003d 4). Las barras de error para los datos de supervivencia no visibles eran más pequeñas que el símbolo.

TABLA 2.

Características de supervivencia de los irradiados con UV secados al aire B. subtilis esporas a

Descripción de la cepaF10 valor con tratamiento
UV-C, 254 nm (J & # x000b7m & # x022122)UV- (A & # x0002bB), 280-400 nm (kJ & # x000b7m & # x022122)UV- (A & # x0002bB), 290-400 nm (kJ & # x000b7m & # x022122)UV-A, 320-400 nm (kJ y # x000b7m y # x022122)
Tipo salvaje326 & # x000b1 3310,7 y # x000b1 0,914,9 y # x000b1 0,9544 & # x000b1 50
dacB295 & # x000b1 349.0 & # x000b1 0.710.2 y # x000b1 0.8 y # x0002a377 & # x000b1 31 & # x0002a
sspA169 & # x000b1 17 & # x0002a7.1 & # x000b1 0.6 & # x0002a7.7 & # x000b1 0.6 & # x0002a260 & # x000b1 22 & # x0002a
sspB216 & # x000b1 20 & # x0002a7,9 y # x000b1 0,5 y # x0002a8.4 & # x000b1 0.7 & # x0002a320 & # x000b1 23 & # x0002a
sspE309 & # x000b1 2810,4 y # x000b1 0,814,7 y # x000b1 0,9513 & # x000b1 44
sspA sspB85 & # x000b1 13 & # x0002a5.8 & # x000b1 0.4 & # x0002a6,9 y # x000b1 0,5 y # x0002a203 & # x000b1 16 & # x0002a

Papel de SASP y mayor contenido de agua del núcleo de esporas en la resistencia de las esporas secadas al aire a la radiación UV ambiental.

Las esporas a menudo se exponen a los rayos UV en el medio ambiente en una forma secada al aire en las superficies o adheridas al suelo o partículas de polvo (32, 59). Por lo tanto, examinamos la contribución de varios SASP o DacB a la resistencia de las esporas a longitudes de onda de radiación UV natural simuladas: 280 a 400 nm (UV-B más UV-A), 290 a 400 nm (simulando UV-B más UV-A radiación que llega a la superficie de la Tierra) y de 320 a 400 nm (UV-A).

Las esporas secadas al aire expuestas a los rayos UV en el rango de 280 a 400 nm exhibieron una cinética de inactivación exponencial (Fig. & # X200B (Fig.1B), 1B), de la cual F10 Los valores se derivaron y compararon estadísticamente (norte & # x0003d 4). los F10 valores de tipo salvaje y sspE y dacB las esporas mutantes no fueron estadísticamente diferentes (Tabla & # x200B (Tabla2). 2). En contraste, las esporas secadas al aire de cepas que carecen de SASP - & # x003b1, SASP - & # x003b2, o ambas, fueron significativamente más sensibles a los rayos UV de 280 a 400 nm que las esporas de tipo salvaje (Tabla & # x200B (Tabla2 2) .

Las esporas secadas al aire expuestas a UV de 290 a 400 nm, que representa el rango de longitudes de onda de UV solar que inciden en la superficie de la Tierra (33, 34), también exhibieron una cinética de inactivación exponencial (Fig. & # X200B (Fig. 1C). 1C ). los F10 valores de tipo salvaje secados al aire y sspE las esporas mutantes no fueron significativamente diferentes en el PAG & # x0003d nivel 0.05 (Tabla & # x200B (Tabla2), 2), y nuevamente, las esporas de cepas que carecen de SASP - & # x003b1, SASP - & # x003b2, o ambas, fueron significativamente más sensibles a los rayos UV de 290 a 400 nm que las esporas de tipo salvaje (Tabla & # x200B (Tabla2). 2). Curiosamente, las esporas secadas al aire del dacB mutantes también fueron significativamente más sensibles a los rayos UV en el rango de 290 a 400 nm que las esporas de tipo salvaje (Fig. & # x200B (Fig. (ver más abajo) juega un papel en la resistencia de las esporas a las longitudes de onda de UV ambientalmente relevantes.

La mayor parte del UV solar natural consiste en UV-A, que comprende longitudes de onda de 320 a 400 nm (34, 55), por lo que las esporas secadas al aire se expusieron a longitudes de onda de UV-A de 320 a 400 nm producidas por un simulador solar y un combinación de filtros ópticos. Las esporas expuestas a UV-A de 320 a 400 nm también exhibieron una cinética de inactivación exponencial (Fig. & # X200B (Fig. 1D). 1D). Comparación de F10 Los valores derivados de las parcelas de mejor ajuste mostraron el secado al aire sspE las esporas que carecen de SASP - & # x003b3 no fueron significativamente más sensibles que las esporas de tipo salvaje (Tabla & # x200B (Tabla2). 2). Sin embargo, las esporas secadas al aire de cepas deficientes en SASP de tipo & # x003b1 / & # x003b2 que portan mutaciones en sspA, sspB, o sspA y sspB eran significativamente más sensibles que las esporas de tipo salvaje a la radiación solar UV-A, al igual que dacB esporas (Tabla & # x200B (Tabla2). 2). Por tanto, el SASP de tipo & # x003b1 / & # x003b2 y el contenido de agua del núcleo de esporas reducido son también determinantes de la resistencia de las esporas secadas al aire a las longitudes de onda de UV-A ambientales.

Comparación de la resistencia a los rayos UV de las esporas en suspensión acuosa frente al estado secado al aire.

Un estudio anterior mostró que las esporas que carecen de ácido dipicolínico exhiben respuestas dramáticamente diferentes a los rayos UV de 254 nm dependiendo de si las esporas se irradiaron en suspensión acuosa o en estado de secado al aire (52). Los datos disponibles del presente estudio sobre la resistencia a los rayos ultravioleta de las especies silvestres, dacB, y sspA sspB las esporas también permitieron realizar comparaciones directas en esporas expuestas en condiciones idénticas de irradiación UV pero en estado acuoso (Tabla & # x200B (Tabla1) 1) o secada al aire (Tabla & # x200B (Tabla2) 2). En respuesta a todas las longitudes de onda UV probadas, las esporas irradiadas en suspensión acuosa fueron ligeramente más sensibles a los rayos UV que las mismas esporas irradiadas en el estado de secado al aire (Fig. & # X200B (Fig. 2) 2) sin embargo, en la mayoría de los casos el las diferencias no fueron significativas en el PAG & # x0003c 0.05 nivel. Curiosamente, la única excepción fue que dacB Las esporas tratadas con radiación UV-A de 320 a 400 nm fueron significativamente más sensibles en el estado acuoso que en el estado secadas al aire (PAG & # x0003d 0.011) (Figura & # x200B (Figura 2D 2D).

Comparación de la resistencia a los rayos UV (F10 valores) de esporas irradiadas ya sea en estado secado al aire (barras blancas) o en suspensión acuosa (barras grises) a 254 nm UV (A), 280 a 400 nm UV- (A & # x0002bB) (B), UV- (A & # x0002bB) (C) de 290 a 400 nm, o UV-A (D) de 320 a 400 nm. Los datos son promedios y desviaciones estándar (norte & # x0003d 4 para esporas secadas al aire norte & # x0003d 3 para esporas en suspensión acuosa). El asterisco denota una diferencia significativa en un PAG valor de & # x0003c0.05.

Mayor contenido de agua en secado al aire. dacB esporas de B. subtilis.

Estudios anteriores habían concluido que dacB las esporas mostraron una menor resistencia al calor húmedo y al peróxido de hidrógeno y contenían un mayor contenido de agua en el núcleo que las esporas de tipo salvaje (40). La observación de que dacB Las esporas eran más sensibles que las de tipo salvaje preferentemente a los rayos UV de longitud de onda larga (Fig. 1B a D), que se sabe que producen especies reactivas de oxígeno (ROS) especialmente en presencia de agua, lo que nos llevó a la hipótesis de que incluso secados al aire dacB las esporas pueden contener más agua que las esporas de tipo salvaje secadas al aire. Esta noción fue probada determinando los porcentajes de agua en especies silvestres y dacB esporas que se habían secado al aire por primera vez a 20 ° C con una humedad relativa de 33 ° C (Tabla 3). 3). Los datos mostraron que las esporas de tipo salvaje contenían 40,4 & # x00025 & # x000b1 2,3 & # x00025 de agua, un valor que concuerda bien con un rango de mediciones anteriores (32 a 55 & # x00025 de agua) realizadas en esporas de B. subtilis (10, 48). En contraste, secado al aire dacB las esporas mutantes contenían 64.5 & # x00025 & # x000b1 5.5 & # x00025 agua, una diferencia con las esporas de tipo salvaje que fue altamente significativa por Student's t prueba (PAG & # x0003d 0,0086). Por lo tanto, secado al aire dacB las esporas mutantes contienen significativamente más agua que las esporas de tipo salvaje, y parece muy probable que la mayor parte de esta diferencia en el contenido de agua resida en el núcleo de las esporas (ver Discusión).

TABLA 3.

Porcentajes de agua en esporas secadas al aire de PS832 (tipo salvaje) y PS1899 (dacB)

Descripción de la cepaMuestraNo. de esporas pesadas aMasa seca a 20 & # x000b0C, 33 & # x00025 RH (g)Masa secada a 110 & # x000b0C (g)& # x00025 AguaPromedio & # x000b1 SD
Tipo salvaje17.62 & # x000d7 10 9 1.7 & # x000d7 10 & # x022123 1.0 & # x000d7 10 & # x022123 41.240.4 & # x000b1 2.3
26.73 & # x000d7 10 9 1.9 & # x000d7 10 & # x022123 1.1 & # x000d7 10 & # x022123 42.1
39,83 & # x000d7 10 9 3.7 & # x000d7 10 & # x022123 2.3 & # x000d7 10 & # x022123 37.8
dacB13.29 & # x000d7 10 9 2.3 & # x000d7 10 & # x022123 8.0 & # x000d7 10 & # x022124 65.264,5 y # x000b1 5,5
23,84 y # x000d7 10 9 2.3 & # x000d7 10 & # x022123 7.0 & # x000d7 10 & # x022124 69.6
35.67 & # x000d7 10 9 4.6 & # x000d7 10 & # x022123 1.9 & # x000d7 10 & # x022123 58.7

Comparación de la resistencia de las esporas a los rayos UV por constantes de inactivación.

En la Tabla & # x200B se presenta un resumen de la resistencia de las esporas a la radiación UV germicida de 254 nm y ambientalmente relevante para las esporas de las diversas cepas. 4. Los datos de IC mostraron que la muerte de esporas por luz solar natural simulada era mucho menos eficiente y requería fluencias de exposición mayores que la muerte por UV-C monocromático de 254 nm. Los datos también mostraron que la resistencia de las esporas a la radiación UV ambientalmente relevante disminuyó en el orden de tipo salvaje (mayor resistencia), seguida por la sspE mutante, el sspB mutante, y luego el sspA mutante, con el sspA sspB mutante que muestra (menor resistencia), similar a la tendencia observada después de la irradiación UV-C de 254 nm (Tabla & # x200B (Tabla4). 4). A partir de estos datos, se puede concluir que SASP - & # x003b1 y - & # x003b2 son determinantes importantes de la resistencia de las esporas a longitudes de onda de UV ambientalmente relevantes, ya que las esporas de mutantes que carecen de SASP - & # x003b1, SASP - & # x003b2, o ambos fueron significativamente más sensible que las esporas de tipo salvaje en todas las longitudes de onda UV probadas (Tabla & # x200B (Tabla4). 4). Estos resultados confirman y amplían las observaciones anteriores de que las principales SASP de tipo & # x003b1 / & # x003b2 son determinantes importantes de la resistencia de las esporas a UV-C monocromático de 254 nm (20, 21). Por el contrario, las esporas deficientes en SASP - & # x003b3 no mostraron ninguna diferencia en su resistencia general a los rayos UV de la de las esporas de tipo salvaje en cualquier longitud de onda de UV probada (Tabla & # x200B (Tabla4), 4), lo que también confirma y extiende la resultados que indican que SASP - & # x003b3 no juega ningún papel en la resistencia de las esporas a UV-C de 254 nm (12).

TABLA 4.

UV IC a de tipo salvaje y deficientes en SASP y DacB B. subtilis esporas B

Descripción de la cepaIC (m 2 / J) para tratamiento
UV-C, 254 nmUV- (A & # x0002bB), 280-400 nmUV- (A & # x0002bB), 290-400 nmUV-A, 320-400 nm
Tipo salvaje(6,9 & # x000b1 0,7) & # x000d7 10 & # x022123 (1.9 & # x000b1 0.3) & # x000d7 10 & # x022124 (1.6 & # x000b1 0.2) & # x000d7 10 & # x022124 (4.5 & # x000b1 0.4) & # x000d7 10 & # x022126
dacB(7.0 y # x000b1 0.9) y # x000d7 10 y # x022123 (2.5 & # x000b1 0.4) & # x000d7 10 & # x022124 (2.4 & # x000b1 0.3) & # x000d7 10 & # x022124 & # x0002a(6.4 & # x000b1 0.5) & # x000d7 10 & # x022126 & # x0002a
sspA(9,8 & # x000b1 0,8) & # x000d7 10 & # x022123 & # x0002a(3.1 & # x000b1 0.3) & # x000d7 10 & # x022124 & # x0002a(3.5 & # x000b1 0.2) & # x000d7 10 & # x022124 & # x0002a(7.6 & # x000b1 0.8) & # x000d7 10 & # x022126 & # x0002a
sspB(8,9 & # x000b1 0,6) & # x000d7 10 & # x022123 & # x0002a(2.8 & # x000b1 0.5) & # x000d7 10 & # x022124 & # x0002a(3.0 & # x000b1 0.3) & # x000d7 10 & # x022124 & # x0002a(6,9 & # x000b1 0,7) & # x000d7 10 & # x022126 & # x0002a
sspE(7.2 y # x000b1 0.7) y # x000d7 10 y # x022123 (2.0 & # x000b1 0.4) & # x000d7 10 & # x022124 (1.6 y # x000b1 0.1) y # x000d7 10 y # x022124 (4.8 & # x000b1 0.5) & # x000d7 10 & # x022126
sspA sspB(1.1 & # x000b1 0.2) & # x000d7 10 & # x022122 & # x0002a(4.1 & # x000b1 0.7) & # x000d7 10 & # x022124 & # x0002a(4.3 & # x000b1 0.8) & # x000d7 10 & # x022124 & # x0002a(9.6 & # x000b1 1.3) & # x000d7 10 & # x022126 & # x0002a

De la misma manera que se describió anteriormente, se realizó una comparación entre los valores de CI de tipo salvaje y dacB esporas (Tabla & # x200B (Tabla4). 4). Como se observó anteriormente (40), dacB Las esporas no difirieron significativamente de las esporas de tipo salvaje en su sensibilidad a UV-C de 254 nm en una comparación de su IC (Tabla & # x200B (Tabla4) 4) o F10 valores (Tabla & # x200B (Tabla1). 1). Sin embargo, dacB Las esporas eran significativamente más sensibles que las esporas de tipo salvaje a UV- (A & # x0002bB) de 280 a 400 nm, UV- (A & # x0002bB) de 290 a 400 nm y UV-A de 320 a 400 nm ( Tabla & # x200B (Tabla4 4).


MATERIALES Y MÉTODOS

Cepas bacterianas y preparación de esporas.

Todas las cepas bacterianas utilizadas en este estudio son derivados de las cepas BG214 o 168 y se enumeran en la Tabla complementaria S1. Bacillus subtilis las cepas se cultivaron durante la noche hasta la fase estacionaria en el medio NB suplementado con el antibiótico apropiado. Para la preparación de las esporas, se sembraron uniformemente 200 mu l de cultivos durante la noche en placas de medio de esporulación de Schaeffer (SSM) (51) y las placas se almacenaron a 37ºC durante 7 días. Las esporas completamente formadas se recolectaron y purificaron mediante un protocolo ajustado (52). Las esporas purificadas se resuspendieron en 5 ml de agua desterilizada y se almacenaron hasta su uso final a 4 ° C.

Irradiación de rayos X de esporas

Los 200 µl de esporas purificadas se transfirieron a tubos de PCR y se irradiaron a temperatura ambiente (RT) con rayos X (200 kV / 15 mA) generados por un tubo de rayos X (Gulmay Xstrahl RS225 A, Gulmay Medical Inc., GA, ESTADOS UNIDOS). Las diluciones apropiadas de las muestras de esporas tratadas y no tratadas se sembraron en placas de agar NB para medir la supervivencia de las esporas contando las unidades formadoras de colonias (UFC). Las curvas de supervivencia se obtuvieron trazando el logaritmo del porcentaje de supervivencia frente a la dosis de radiación de rayos X aplicada. Cada experimento de irradiación de rayos X se repitió al menos tres veces y los datos presentados se expresan como valores promedio con desviaciones estándar. Además, la resistencia de las esporas después de la radiación de rayos X se expresó como D10-valor, que representa la dosis de rayos X que reduce la supervivencia de las esporas al 10%. El d10-Los valores de las esporas tratadas se compararon estadísticamente utilizando los valores de Student t-prueba y diferencias con PAG-valores de ≤0,05 se consideraron estadísticamente significativos (32, 53).

Desecación de esporas UHV

Las muestras de esporas consistieron en monocapas de esporas secadas al aire inmovilizadas en discos de cuarzo de 7 mm que se expusieron durante 7 días a UHV producido por un sistema de bombeo ion-getter (400 l / s Varian SpA, Torino, Italia) alcanzando una presión final de 3 × 10 - 6 Pa (32, 54, 55). Las esporas inmovilizadas en discos de cuarzo se recuperaron mediante una solución acuosa de alcohol polivinílico al 10% como se describió anteriormente (32, 53). Las diluciones apropiadas de las muestras de esporas tratadas y no tratadas se sembraron en placas de agar NB para contar las UFC como medida de supervivencia de las esporas. Las UFC de las muestras de esporas no tratadas se representaron como una supervivencia del 100%. El experimento de UHV se realizó por triplicado. Las UFC de las esporas tratadas con UHV se dividieron con el valor medio de UHF de las muestras de esporas no tratadas con el fin de obtener la supervivencia después de UHV. Los datos presentados se expresan como valores promedio con desviaciones estándar. El porcentaje de supervivencias de las esporas tratadas se comparó estadísticamente utilizando Student's t-prueba y diferencias con PAG-valores de ≤0,05 se consideraron estadísticamente significativos (32).

Formación de filamentos y nucleación de RecA

Se utilizó un ensayo continuo de hidrólisis de ATP para analizar el grado de nucleación de RecA y formación de filamentos en ssDNA (56). Las proteínas SsbA, RecO y RecA y el sustrato de ssDNA pGEM3-Zf (+) se purificaron como se describe (57, 58). La concentración de proteína RecA se expresa como moles de proteína como monómeros, RecO como dímeros y SsbA como tetrámeros (56). La tasa de hidrólisis de ATP mediada por RecA dependiente de ssDNA y el tiempo de retardo de nucleación se midieron en tampón A (Tris-HCl 50 mM [pH 7,5], DTT 1 mM, NaCl 90 mM, MgOAc 10 mM [acetato de magnesio], 50 µg / ml de BSA, glicerol al 5%) que contiene ATP 5 mM durante 25 min a 37 ° C como se describe (56). El tiempo de nucleación se dedujo de la intersección en el tiempo de una regresión lineal de la porción de datos en estado estacionario en los ensayos de hidrólisis de ATP como se informó (56, 59).

Las proteínas SsbA y RecO (1 SsbA / 33 nt y 1 RecO / 50 nt) no mostraron actividad de hidrólisis de ATP en comparación con la reacción simulada en ausencia de ambas proteínas o cuando se añadió BSA en lugar de ambas proteínas (datos no mostrados). Los órdenes de adición de pGEM3-Zf (+) ssDNA de 3199 nt (10 µM en nt), las proteínas purificadas (RecA, SsbA y RecO) y sus concentraciones se indican en el texto.

Ensayo de síntesis de ADN

A B. subtilis replisome fue reconstituido in vitro con subunidades SsbA, DnaG, DnaC, PriA, DnaD, DnaB, DnaI, PolC, DnaE, ​​τ, δ, δ ′ y β purificadas de la replicasa y la plantilla de ADN mini-circular como se describe (60). PolC, DnaE, ​​DnaG, PriA, δ y δ ′ se expresan como moles de monómeros proteicos, β como dímeros, τ, DnaB y DnaD como tetrámeros, y DnaC y DnaI como hexámeros (60). Las condiciones de reacción para los ensayos de síntesis de ADN fueron: DnaE 15 nM, PolC 20 nM, DnaG 8 nM, τ 25 nM, δ 25 nM, δ ′ 25 nM, β 24 nM, DnaC 30 nM, PriA 15 nM, DnaD 50 nM, 100 DnaB nM, DnaI 40 nM, plantilla de ADN minicircular 5 nM en moléculas, ATP 350 µM, CTP 100 µM, GTP y UTP, dNTP 48 µM (excepto dCTP o dGTP 18 µM para la síntesis de ADN de cadena principal y retrasada, respectivamente) y 15 µCi / reacción [α- 32 P] dCTP o [α- 32 P] dGTP, todos en tampón BsRC (60). La plantilla de ADN era un círculo de 409 pb que contenía una cola de 396 nt descrita anteriormente (60) que tiene un fuerte sesgo de hebra de GC (50: 1), por lo que el dCTP etiquetado se incorporó, en su mayoría, en la hebra principal naciente y se etiquetó dGTP en la hebra rezagada (60).

Se preparó una mezcla de enzimas que contenía todos los componentes proteicos excepto SsbA, RecA, RecO en tampón BsRC a 4ºC. La mezcla de sustrato contenía el sustrato de ADN y SsbA 90 nM, RecA 1 µM, RecO 0,1 µM como se indica, y se preparó en hielo. La mezcla de enzimas se añadió a la mezcla de sustrato y después se preincubaron las reacciones durante 5 min a 37ºC en presencia de ATP gamma S 5 mu M y rNTP excepto ATP. Las reacciones se iniciaron mediante la adición de dNTP y ATP y se retiraron alícuotas en los tiempos indicados y se incubaron durante 20 min con un volumen igual de una mezcla de parada que constaba de Tris-HCl 40 mM (pH 8,0), 0,2% p / v. SDS, EDTA 100 mM y 50 µg / ml de proteinasa K. Se aplicaron muestras en columnas Sephadex G-50 para eliminar los dNTP no incorporados. A continuación, se cuantificó el grado de síntesis de ADN en las cadenas principales y retrasadas mediante recuento de centelleo como se describe (61). Para el análisis del tamaño de los productos de replicación, las muestras se llevaron a NaOH 50 mM, glicerol al 5% v / v y azul de bromofenol al 0,05% y se fraccionaron en geles de agarosa alcalinos al 0,45% durante ~ 5 ha 60 V como se describe (60). El tampón de gel de agarosa alcalino constaba de NaOH 30 mM y EDTA 0,5 mM. Los geles se fijaron en ácido tricloroacético al 7% (p / v), se secaron, se autorradiografiaron en pantallas de fósforo de almacenamiento y se analizaron con el software Cantidad Uno (Bio-Rad).


Expresiones de gratitud

Nos gustaría agradecer a la Oficina del Programa de Globos de la NASA (Instalación de Vuelo de Wallops) y al personal de la Instalación de Globos Científicos de Columbia por nuestra oportunidad de vuelo. El financiamiento del proyecto fue proporcionado por los Estudios Especiales de Capacidades Técnicas Básicas en el Centro Espacial Kennedy de la NASA en Florida. P. Maloney, A. Dixit, A. Dokos y A. Bharrat (Kennedy Space Center) R. McPeters (Goddard Space Flight Center) P. Vaishampayan y K. Venkateswaran (Jet Propulsion Laboratory) y A Schuerger (Universidad de Florida). Agradecemos a tres revisores anónimos por su tiempo y comentarios constructivos.


Introducción

Figura 1. Representación esquemática de la estructura de esporas en capas. Las proteínas diana se indican en sus respectivas ubicaciones basándose en la evidencia experimental o en la homología encontrada en la literatura.

identificación del genID de proteínadescripción de la proteínasecuencias de péptidos
BC_0059SpoVTProteína de esporulación en estadio V T. Regulador transcripcional específico de las esporas. (24,25) Identificado en aislamientos de la cubierta de esporas (resultados preliminares no publicados).(EHK) AVNTAASFLAK (QME)
(RIR) EGDPLEIFVDR (DGE)
BC_0212YusWProteína putativa no caracterizada. Identificado previamente en aislamientos de capa de esporas (resultados preliminares no publicados).(ITK) LSPLLQELK (FDK)
(DLK) LNFNEFDLK (ADY)
BC_0389CotB1Proteína de cubierta de esporas B1. Proteína de la capa basal de Exosporium. En B. anthracis, CotB es independiente de CotE y se encuentra tanto en el pelaje como en los aislados de exosporium. (5,26,27)(FLK) DLIGSFVR (VNR)
(IVK) EEIILIAIK (HIK)
BC_0390CotB2Proteína de la cubierta de esporas B2. Proteína de la capa basal de Exosporium. En B. anthracis, CotB es independiente de CotE, y se encuentra tanto en el pelaje como en los aislados de exosporium. (5,26,27)(ESR) VGELVSLGK (DYL)
(HIK) SVSQVVK (CKK)
BC_0987BC_0987Proteína putativa no caracterizada. Identificado previamente en aislamientos de capa de esporas (resultados preliminares no publicados).(ISR) TFVSLEPNR (TTK)
(RSR) NTFFPTQNELVEISR (TFV)
BC_1281CalYMetaloproteasa unida a la envoltura celular. Proteasa asociada a esporas detectada en aislados de exosporium. Potencialmente involucrado en biopelículas. (14,28)(KVK) FLWNWDK (QSE)
(WDK) QSEPVYETTLADLQK (VDP)
BC_1284InhAInhibidor inmune A. Factor de virulencia secretado que regula el secretoma en Bacillus Anthracis y thuringiensis.(29,30)(PGK) AADYGADAASGGHDNK (GPK)
(GLK) FEVVGQADDNSAGAVR (LYR)
BC_2064Alr1Alanina racemasa 1. Sensor de quórum para la germinación prematura por l-alanina en el exosporio. (31-33)(VIK) GDGISYNVTYR (TKT)
(VVK) ANAYGHDYVPVAK (TAL)
BC_2569BC_2569Proteína de repetición de triple hélice de colágeno. Identificado previamente en aislamientos de capa de esporas (resultados preliminares no publicados).(RVR) ATVDSLPIR (SRI)
(HLK) ANVQLVGTSTLLTR (LQI)
BC_2752YpeBProteína hipotética que atraviesa la membrana. La lisis de la corteza se asocia con SleB. (34)(NSR) SSLSPALADVWR (LTS)
(QMK) IALDDGSIVGFSAK (EYL)
BC_2753SleBEnzima lítica de la corteza de esporas. Proteína clave, junto con CwlJ, ​​para la degradación de la corteza durante la germinación. (20,34)(QEK) FGLPVDGLAGAK (TKQ)
(IQR) GASGEDVIELQSR (LKY)
BC_2872CotX1Proteína X de la cubierta de las esporas. Proteína insoluble fuertemente reticulada, importante para la integridad estructural (densidad) de la capa externa. (35)(ADR) VAQELFQK (SSI)
(SFK) NASVSEAAAQESK (TYQ)
BC_2889IunHInosina-uridina prefiriendo nucleósido hidrolasa. Involucrado en la germinación inducida por inosina o adenosina. (33,36)(IQR) IAVGFNYAAFK (EEF)
(VSR) DIVTENVYFLER (YYA)
BC_3607YaaHPeptidoglicano hidrolasa de esporas. Ayuda a la descomposición de la corteza al escindir los productos de la actividad SleB / CwlJ. (20,34)(QNK) FITNILQTAQK (YGM)
(LYR) ISQTYNVPLASLAK (VNN)
BC_3712BclCProteína hipotética que atraviesa la membrana. Se encuentra con frecuencia en los aislados de proteínas de la cubierta de las esporas. BLAST coincide con proteínas hipotéticas. Contiene una región de colágeno con repeticiones GXX comunes en las proteínas del exosporium. (14,37)(AGR) IPNTPSIPITK (AQL)
(GAR) ISVQSTLNEITIPATGNTNIR (LTV)
BC_3770RedilProteína de la cubierta de las esporas E. Proteína morfogenética principal, ancla el exosporium y muchas proteínas de la cubierta externa. (5)(VER) EFVTEVVGETK (ICV)
(TER) VNYTDEVSIGYR (DKN)
BC_4419YhcN / CoxAProteína de la corteza de esporulación. Función desconocida, Sig F / G específico de preesporas. B. subtilis los mutantes han obstaculizado el crecimiento. (38)(AÑO) TSYNDTHQYR (DNV)
(VDR) VSTVVYGNDVAIAVKPR (PRN)
BC_4420SafAFactor de ensamblaje de la capa de esporas dependiente de SpoVID. Proteína morfogenética principal que dirige las proteínas de la cubierta interna. (8,39)(_MR) IHIVQK (GDT)
(HMK) QQAGAGSAPPK (QYV)
BC_4640YtfJ / AlemaniaProteína putativa no caracterizada. Receptor de germinación, estímulo desconocido. (40)(PIK) AADGSVILTVSK (VSF)
(IDK) IIELAPQAVDK (VKE)
BC_5056BC_5056Proteína de adhesión de colágeno. Función desconocida, que se encuentra con frecuencia en los aislados de proteínas de la cubierta de las esporas. La proteína similar a la adhesina indica que puede ser importante como factor de virulencia.(MGK) VDINVYR (VLL)
(AHK) GTPTIQNAVVLLER (VER)
BC_5391GerQProteína de cubierta de esporas GerQ. Proteína estructural, potencialmente altamente reticulada. Importante para la localización de CwlJ. Importante para la germinación con Ca 2+ -DPA. (41−43)(KGK) QATVVMTYER (GSS)
(YER) GSSLGTQSYTGIIEAAGR (DHI)

La secuencia entre corchetes representa el contexto de la secuencia primaria nativa, que no se incluyó en QconCAT.


Ver el vídeo: Bacillus sp (Julio 2022).


Comentarios:

  1. Mejinn

    Como es curioso. :)

  2. Chochuschuvio

    Pido disculpas por interferir ... Puedo encontrar mi camino en esta pregunta. Está listo para ayudar.

  3. Bourn

    No puedo participar ahora en discusión, no hay tiempo libre. Pero volveré, necesariamente escribiré que creo.

  4. Cleavon

    Me uno. Estoy de acuerdo con todo lo anterior. Podemos comunicarnos sobre este tema.



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