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¿La mutación del ADN está estabilizando energéticamente localmente la molécula de ADN?

¿La mutación del ADN está estabilizando energéticamente localmente la molécula de ADN?



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No soy biólogo, pero como físico, una mutación espontánea (vista como una transformación química) debería reducir la energía del sistema, al menos a nivel local. Así que me pregunto si se ha realizado alguna investigación en este sentido para el ADN.


una mutación espontánea (vista como una transformación química) debería disminuir la energía del sistema

¿Por qué piensas eso? ¿Porque es una reacción endotérmica?

Tenga en cuenta que las mutaciones no ocurren "simplemente así" (al menos que yo sepa), sino que se desencadenan por el influjo de energía externa de cosas como especies reactivas de oxígeno o radiación ionizante. Entonces sí, cuestan energía, pero esa energía no proviene de enlaces químicos energéticamente inestables; se complementa con fuentes externas.

Por tanto, no es necesariamente cierto que las mutaciones produzcan enlaces químicos de menor energía.


Voy a intentar una respuesta a esto a nivel de bioquímica de pregrado: disculpas de antemano si esto no es lo suficientemente sofisticado.

La mutación espontánea más frecuente es la desaminación de la citosina a uracilo (hidrólisis con pérdida de amoniaco). Estrictamente en términos de la estructura de doble hélice de la molécula de ADN, esto, me parece, sería desestabilizador debido al cambio de un par de bases GC (3 enlaces de hidrógeno) a un par de bases GU (2 enlaces de hidrógeno).


La cinética de reacción de las mutaciones del ADN se complica por el hecho de que el ADN no existe de forma aislada y, de hecho, es procesado y mantenido activamente por la maquinaria celular.

Por ejemplo, como señala Alan Boyd, la mutación espontánea más común es la desaminación de la citosina a uracilo: Cyt + H2O → NH3 + Ura. Por sí solo, lo contrario de esta reacción, es decir, la aminación espontánea de uracilo a citosina, sería muy poco probable, aunque solo sea por la baja concentración de amoníaco en comparación con el agua en el fluido celular.

Sin embargo, en una célula viva, hay enzimas reparadoras del ADN que buscan activamente uracilo en el ADN y lo eliminan, lo que permite que aparezcan otras enzimas y lo reemplacen con la citosina original. Esto mantiene el eficaz Tasa de mutación Cyt → Ura muy por debajo de lo que sería en ausencia de reparación activa.


Los 'genes saltarines' ayudan a estabilizar los patrones de plegamiento del ADN

Los "genes saltarines", bits de ADN que pueden moverse de un lugar del genoma a otro, son bien conocidos por aumentar la diversidad genética a lo largo del largo curso de la evolución. Ahora, una nueva investigación de la Facultad de Medicina de la Universidad de Washington en St. Louis indica que dichos genes, también llamados elementos transponibles, desempeñan otro papel más sorprendente: estabilizar los patrones de plegamiento tridimensionales de la molécula de ADN dentro del núcleo de la célula.

El estudio aparece el 24 de enero en la revista Biología del genoma.

La molécula de ADN dentro del núcleo de cualquier célula humana mide más de seis pies de largo. Para caber en un espacio tan pequeño, debe plegarse en bucles precisos que también gobiernan cómo se activan o desactivan los genes. Puede parecer contradictorio que los fragmentos de ADN que se mueven aleatoriamente por el genoma puedan proporcionar estabilidad a estos patrones de plegado. De hecho, el descubrimiento contradice una suposición de larga data de que el orden preciso de las letras en la secuencia de ADN siempre dicta la estructura más amplia de la molécula de ADN.

"En lugares donde el plegamiento tridimensional más grande del genoma es el mismo entre ratones y humanos, se espera que la secuencia de las letras del ADN que ancla esa forma también se conserve allí", dijo el autor principal Ting Wang, Ph. D., el Profesor Distinguido de Medicina Sanford C. y Karen P. Loewentheil. "Pero eso no es lo que encontramos, al menos no en las porciones del genoma que en el pasado se han llamado 'ADN basura'".

Al estudiar el plegamiento del ADN en células sanguíneas humanas y de ratón, los investigadores encontraron que en muchas regiones donde los patrones de plegamiento del ADN se conservan a través de la evolución, la secuencia genética de las letras del ADN que establecen estos pliegues no lo es. Está ligeramente desplazado. Pero esta secuencia cambiante, una renovación genética, no causa problemas. Debido a que la estructura permanece en gran parte igual, la función presumiblemente también lo hace, por lo que nada de importancia cambia.

"Nos sorprendió descubrir que algunos elementos transponibles jóvenes sirven para mantener estructuras antiguas", dijo el primer autor Mayank N.K. Choudhary, estudiante de doctorado en el laboratorio de Wang. "La secuencia específica puede ser diferente, pero la función sigue siendo la misma. Y vemos que esto ha sucedido varias veces durante los últimos 80 millones de años, cuando los antepasados ​​comunes de ratones y humanos se separaron por primera vez".

El hecho de que un nuevo elemento transponible pueda insertarse y desempeñar el mismo papel que un ancla existente crea una redundancia en las porciones reguladoras del genoma, regiones de la molécula de ADN que determinan cómo y cuándo se activan o desactivan los genes.

Según los investigadores, esta redundancia hace que el genoma sea más resistente. Al proporcionar novedad y estabilidad, los genes saltarines pueden ayudar al genoma de los mamíferos a lograr un equilibrio vital, lo que permite a los animales la flexibilidad para adaptarse a un clima cambiante, por ejemplo, al tiempo que preservan las funciones biológicas necesarias para la vida, protegiendo contra el daño del ADN provocado por viviendo y reproduciéndose en la Tierra durante un período de tiempo profundo, medido en decenas a cientos de millones de años.

Aun así, los investigadores tuvieron cuidado de distinguir entre las partes del genoma que tienen genes responsables de producir proteínas y el resto del genoma. En los genes que codifican proteínas, la secuencia genética y la estructura se conservan, y este estudio no contradice eso. Sin embargo, la nueva investigación sugiere que los genes saltarines en las áreas del genoma que no codifican proteínas siguen reglas de conservación diferentes a las de los genes que codifican proteínas.

"Nuestro estudio cambia la forma en que interpretamos la variación genética en las regiones no codificantes del ADN", dijo Wang. "Por ejemplo, grandes estudios de genomas de muchas personas han identificado muchas variaciones en regiones no codificantes que no parecen tener ningún efecto sobre la regulación genética, lo cual ha sido desconcertante. Pero tiene más sentido a la luz de nuestra nueva comprensión de elementos transponibles, mientras que la secuencia local puede cambiar, pero la función permanece igual.

"Es posible que debamos revisar este tipo de estudios a la luz de la nueva comprensión que tenemos ahora de los elementos transponibles", agregó. "Hemos descubierto otra capa de complejidad en la secuencia del genoma que no se conocía antes".


MATERIALES Y MÉTODOS

Expresión y purificación de la proteína HMO1

El plásmido pJ1870 que codifica la levadura HMO1 clonado en marco con una His N-terminal6 etiqueta en el vector de expresión pTEV derivado de pET15b (Novagen) se transformó en Escherichia coli BL21 (DE3) (Agilent Technologies), y se cultivó en cultivo LB de 250 ml a 37 ° C con agitación hasta que el cultivo alcanzó una densidad celular correspondiente a una DO600 de 0,6. Se añadió isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 1 mM y las células se cultivaron a 37 ° C durante la noche con agitación, se sedimentaron mediante centrifugación a 6000 gy luego se resuspendió el sedimento celular en 10 ml de unión. tampón (NaPO 50 mM4, NaCl 300 mM, pH 7,5) que contiene 10 mM de fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) y se pasó cinco veces a través de un homogeneizador de alta presión Emulsiflex C-5 (Avestin). El lisado se clarificó mediante centrifugación a 22 000 g durante 45 min a 4 ° C y se recuperó el sobrenadante. Su6La proteína etiquetada se purificó usando resina de agarosa Ni-NTA (Qiagen) según las recomendaciones del fabricante. Brevemente, se añadió resina de agarosa Ni-NTA lavada en una proporción de 1: 4 (v: v) al lisado, se hizo girar suavemente a 4ºC durante 1 h, luego se cargó en una columna de 1,5 x 15 cm. La proteína unida a resina se lavó con 200 ml de tampón de lavado (NaPO 50 mM4, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, pH 7,5). Estas condiciones fueron suficientes para liberar el ADN contaminante unido. La proteína se eluyó de la resina con tampón de elución (NaPO 50 mM4, NaCl 300 mM, imidazol 250 mM, pH 7,5) recogiendo fracciones de 2 ml hasta que no se pudo detectar ninguna proteína con el reactivo de Bradford. Las fracciones que contenían la proteína de interés se combinaron y redujeron a 2 ml usando cartuchos centrífugos (Vivaspin), y las proteínas se dializaron a 4 ° C frente a 1 litro de tampón que contenía HEPES 20 mM pH 7,5, KCl 100 mM, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 1 mM. y ditiotreitol (DTT) 1 mM, seguido de una segunda diálisis contra el mismo tampón que contiene glicerol al 5%.

La proteína purificada se separó utilizando His6proteasa TEV marcada seguida de diálisis en tampón de unión para eliminar el imidazol residual. La proteína desprendida se purificó de His6-etiqueta y su6-proteasa TEV marcada por cromatografía en columna como se describe anteriormente, pero con elución usando nueve pasos de concentración creciente de imidazol entre 5 y 250 mM. Las fracciones con la proteína deseada se combinaron y redujeron a 2 ml por concentración centrífuga y las proteínas se dializaron a 4 ° C contra 1 litro de tampón que contenía HEPES 20 mM pH 7,5, KCl 100 mM, EDTA 1 mM y DTT 1 mM, seguido de un segundo diálisis frente al mismo tampón que contiene glicerol al 5%. La calidad de la proteína se confirmó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio, la afinidad del ADN se cuantificó mediante ensayos de cambios de movilidad en gel electroforético y la flexión del ADN se confirmó mediante la mejora de la ciclación del ADN mediada por ligasa de ADN T4.

Preparación de muestras de proteína-ADN para microscopía de fuerza atómica

Usamos ADN plasmídico linealizado pBR322 de 4361 pb. La linealización fue realizada por PvuII digestión seguida de extracción con fenol (20). La superficie de mica recién escindida se expuso a Mg 2+ 5 mM durante 20 min a temperatura y presión ambientales. A continuación, la superficie se enjuagó con agua destilada y se secó al aire. Se depositó una solución de ADN de 0,11 nM y se dejó incubar durante 30 min, luego se enjuagó y se secó con gas argón. Para obtener imágenes de los complejos de ADN unidos a proteínas, se incubó proteína 3 nM con ADN del plásmido pBR322 linealizado 0,11 nM con Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) y Mg 2+ 5 mM, luego se depositó en la superficie de la mica, se dejó equilibrar durante 20 min, y finalmente se enjuagó y se secó con gas argón.

Pinzas ópticas

Para investigar y caracterizar las interacciones HMO1-ADN, utilizamos pinzas ópticas de doble haz con láseres de 830 nm, que pueden sostener una fuerza de hasta 300 pN. La configuración experimental consiste en enfocar dos rayos láser en un punto de 1 μm de diámetro. Una gota de alto índice de refracción en comparación con el medio circundante será atraída hacia el punto focal. Una segunda perla se inmoviliza mediante una micropipeta de vidrio. Se utiliza una etapa piezoeléctrica de alta resolución (resolución de 0,15 nm, punto N) para extender el ADN. La fuerza se mide a partir de la refracción del láser de la perla de poliestireno. Una vez que la única molécula se captura entre las dos perlas, la solución alrededor del ADN se intercambia fluyendo 10 veces el volumen de la celda de flujo de la solución de proteína a una concentración fija seguida de equilibrio térmico y estiramiento del ADN. La solución tampón constaba de Na + 100 mM y HEPES 10 mM pH 7,5. Se observaron efectos de formación de puentes y bucles manteniendo las moléculas de ADN con fuerzas de estiramiento & lt1 pN.

Aquí Θ es la ocupación del sitio fraccional de ADN, KD es la constante de disociación, norte es el tamaño del sitio de enlace (norte = 26 pb), C es la concentración y ω es un parámetro de cooperatividad vinculante.

Imágenes de microscopía de fuerza atómica

Se utiliza un microscopio de fuerza atómica Bruker Nanoscope V MultiMode 8 con el modo Peak-Force Tapping ™. En este modo, se obtiene una curva de fuerza en cada píxel de la imagen. La fuerza máxima se utiliza como parámetro de retroalimentación para obtener imágenes de la topografía. La muestra se puede escanear a fuerzas más bajas y con un tiempo de contacto más corto, protegiendo así las muestras delicadas. Para obtener imágenes en el aire, se utiliza un voladizo de silicio (frecuencia de resonancia = 70 kHz, constante de resorte = 0,4 N / my radio de la punta = 2 nm). Los experimentos se realizaron a temperatura ambiente. Las imágenes se procesan mediante el software Nanoscope Analysis, que consiste en restar el promedio de cada línea para eliminar los artefactos planos. El rango de exploración utilizado fue de 1 μm × 1 μm y 2 μm × 2 μm a 512 × 512 píxeles y 1024 × 1024 píxeles, respectivamente. Para cuantificar las imágenes de microscopía de fuerza atómica (AFM), se trazaron y analizaron moléculas de ADN con NCTracer, software desarrollado por el Laboratorio de Neurogeometría de la Universidad Northeastern (22, 23).


Capítulo 4 - Biología molecular mejorada de la célula

Un ácido desoxirribonucleico consta de dos cadenas polinucleotídicas largas compuestas por cuatro tipos de subunidades nucleotídicas. Las cadenas también se pueden llamar hebras de ADN. Las cadenas corren en antiparalelo entre sí, y los enlaces de hidrógeno entre las porciones de base de los nucleótidos mantienen unidas las dos cadenas.

Los nucleótidos están compuestos por un azúcar de cinco carbonos al que se unen uno o más grupos fosfato y una base que contiene nitrógeno. Los nucleótidos están unidos covalentemente en una cadena a través de los azúcares y los fosfatos, que forman así una columna vertebral alternando azúcar-fosfato.

La unión de los nucleótidos le da a la cadena de ADN una polaridad química. Los dos extremos de la cadena se distinguen fácilmente, ya que uno tiene un orificio (3 'de hidroxilo) y el otro una perilla (5' de fosfato).

Debido a que las cadenas se mantienen unidas por enlaces de hidrógeno entre las bases, las bases están en el interior de la doble hélice. El emparejamiento de bases complementario permite empaquetar los pares de bases en la disposición energéticamente más favorable.

La estructura del ADN proporciona un mecanismo para la herencia.

Cada hebra puede actuar como plantilla para producir una hebra complementaria, lo que permite a la célula copiar o replicar su genoma.

Genoma: almacén completo de información en el ADN de un organismo.

En eucariotas, el ADN está encerrado en un núcleo celular.

Todo el ADN de una célula eucariota está secuestrado en un núcleo. Este compartimento está delimitado por una envoltura nuclear formada por dos membranas bicapa lipídicas concéntricas. Estas membranas están perforadas a intervalos por grandes poros nucleares, a través de los cuales las moléculas se mueven entre el núcleo y el citosol.

La envoltura nuclear está directamente conectada al extenso sistema de membranas intracelulares llamado retículo endoplasmático. Y está sostenido mecánicamente por una red de filamentos intermedios llamada lámina nuclear.

ADN cromosómico y su empaquetado en la fibra de cromatina

El ADN eucariota está empaquetado en un conjunto de cromosomas.

Cada cromosoma consta de una única molécula de ADN lineal larga junto con las proteínas que pliegan y empaquetan el hilo de ADN en una estructura compacta. El complejo de ADN y proteína fuertemente unida se llama cromatina.

Las bacterias carecen de un compartimento nuclear especial y llevan sus genes en una sola molécula de ADN, que a menudo es circular.

Los cromosomas homólogos (homólogos) son los cromosomas maternos y paternos de un par. Los únicos pares no homólogos son los cromosomas sexuales en los machos.

Los cromosomas contienen largas cadenas de genes

Debido a las diferencias en la cantidad de ADN no codificante, los genomas de organismos estrechamente relacionados pueden variar varios cientos de veces en su contenido de ADN, aunque contengan aproximadamente la misma cantidad de genes.

No existe una relación simple entre el número de cromosomas, la complejidad del organismo y el genoma total.

La secuencia de nucleótidos del genoma humano muestra cómo están organizados nuestros genes.

Casi la mitad del ADN cromosómico está formado por piezas móviles de ADN que se han insertado gradualmente en los cromosomas a lo largo del tiempo evolutivo, elementos transponibles.

Las secuencias codificantes se denominan exones, las secuencias intermedias (no codificantes) son intrones.

Cada gen está asociado con secuencias de ADN reguladoras, que son responsables de garantizar que el gen se active o desactive en el momento adecuado.

Cada molécula de ADN que forma un cromosoma lineal debe contener un centrómero, dos telómeros y orígenes de replicación.

Ciclo celular: proporciona una separación temporal entre la duplicación de cromosomas y su segregación en dos células hijas. Durante la interfase, los genes se expresan y los cromosomas se replican, y las dos réplicas permanecen juntas como un par de cromátidas hermanas. Los cromosomas altamente condensados ​​en una célula en división se conocen como cromosomas mitóticos.

Origen de la replicación del ADN: el lugar en el que comienza la duplicación del ADN.

Centrómero: permite que una copia de cada cromosoma duplicado y condensado se introduzca en cada célula hija cuando una célula se divide.

Kinechore: complejo proteico que se forma en el centrómero y une los cromosomas duplicados al huso mitótico.

Telómeros: extremos de los cromosomas que contienen secuencias de nucleótidos repetidas que permiten que los extremos de los cromosomas se repliquen de manera eficiente. Y junto con las regiones colindantes

Una gran cantidad de lisina y arginina en las histonas centrales, sus cargas positivas pueden neutralizar eficazmente la columna vertebral del ADN con carga negativa.

Cada una de las histonas centrales tiene una "cola" de aminoácidos N-terminal, que se extiende desde el núcleo de las histonas de ADN. Estas colas están sujetas a varios tipos de modificación covalente que a su vez controlan aspectos críticos de la estructura y función de la cromatina.

Los nucleosomas tienen una estructura dinámica y, con frecuencia, están sujetos a cambios catalizados por complejos de remodelación de cromatina dependientes de ATP.

Para la cromatina en una célula, se requiere el aflojamiento de los contactos ADN-histona, porque las células euacrióticas contienen una gran variedad de complejos remodeladores de cromatina dependientes de ATP. Estos complejos incluyen una subunidad que hidroliza ATP. Esta subunidad se une tanto al núcleo proteico del nucleosoma como al ADN de doble hebra que lo rodea. Al utilizar la energía de la hidrólisis de ATP para mover este ADN en relación con el núcleo, el complejo de proteínas cambia la estructura, haciendo que el ADN esté menos unido al núcleo de la histona.

A través de ciclos repetidos de hidrólisis de ATP que tiran del núcleo del nucleosoma a lo largo de la hélice del ADN, los complejos de remodelación pueden catalizar el deslizamiento del nucleosoma. Pueden reposicionar nucleosomas para exponer regiones específicas de ADN.

Al cooperar con las histonas chaperonas, algunos complejos de remodelación pueden eliminar todo o parte del núcleo del nucleosoma de un nucleosoma, catalizando un intercambio de sus histonas H2A-H2B o la eliminación completa del núcleo octamérico.

Los nucleosomas generalmente se empaquetan juntos en una fibra de cromatina compacta

Los nucleosomas están empaquetados uno encima del otro, generando matrices en las que el ADN está aún más condensado.

Los enlaces nucleosoma a nucleosoma que involucran colas de histonas, las colas H4 más notables, constituyen un factor importante en lo que hace que los nucleosomas se apilen tan estrechamente entre sí. Otro factor importante es una histona adicional que a menudo está presente en una ración de 1 a 1 con núcleos de nucleosoma, conocida como histona H1. Esta histona enlazadora es más grande que las histonas centrales individuales y se ha conservado considerablemente menos durante la evolución.

Una sola molécula H1 se une a cada nucleosoma, conectando el ADN y la proteína, y cambiando la ruta del ADN a medida que sale del nucleosoma. Se cree que este cambio ayuda a compactar el ADN nucleosómico.

Estructura y función de la cromatina

La heterocromatina está muy organizada y restringe la expresión génica.

Heterocromatina: altamente condensada, eucromatina, menos condensada.

El ADN de la heterocromatina contiene pocos genes, y cuando las regiones de eucromatina se convierten a un estado hetercromático, sus genes generalmente se desactivan como resultado.

La heterocromatina no debe considerarse como un simple ADN "muerto" encapsulado, sino más bien como un descriptor de dominios compactos de cromatina que comparten la característica común de ser inusualmente resistentes a la expresión génica.

El estado heterocromático se autopropaga

Un fragmento de cromosoma que normalmente es eucromático puede translocarse en la vecindad de la heterocromatina, lo que a menudo provoca el silenciamiento (inactivación) de los genes activos. Este fenómeno se conoce como efecto de posición.

En los eventos de ruptura y reincorporación de cromosomas de la zona de silinceing, donde la eucromatina se convierte en un estado heterocromático, se propaga a diferentes distancias en diferentes células tempranas del embrión. Sorprendentemente, estas diferencias se perpetúan durante el resto de la

Se utiliza un proceso similar para eliminar las modificaciones de histonas de regiones específicas, en este caso, se recluta una "enzima borradora" para el complejo.

Las secuencias de ADN de barrera bloquean la propagación de complejos lector-escritor y, por lo tanto, separan los dominios de cromatina vecinos.

Ciertas secuencias de ADN marcan los límites de los dominios de cromatina y separan uno de esos dominios de otro.

La cromatina en los centrómeros revela cómo las variantes de histonas pueden crear estructuras especiales

En muchos organismos complejos, cada centrómero está incrustado en un tramo de cromatina centromérica especial que persiste a lo largo de la interfase, aunque la unión mediada por el centrómero al huso y el movimiento del ADN ocurren solo durante la mitosis.

Los experimentos con embriones de rana sugieren que las estructuras de cromatina tanto activantes como represivas pueden heredarse epigenéticamente.

La herencia epigenética juega un papel central en la creación de organismos multicelulares. Sus tipos de células diferenciadas se establecen durante el desarrollo y persisten a partir de entonces aunque la división celular repetida

Las estructuras de cromatina son importantes para la función cromosómica eucariota

Para formar un organismo multicelular complejo, las células de diferentes linajes deben especializarse cambiando la accesibilidad y la actividad de muchos cientos de genes.

La estructura global de los cromosomas.

Los cromosomas se pliegan en grandes bucles de cromatina.

Los cromosomas politénicos son especialmente útiles para visualizar las estructuras de la cromatina.

Las comparaciones del genoma revelan secuencias funcionales de ADN por su conservación a lo largo de la evolución.

Regiones conservadas: fragmentos de secuencias de ADN muy similares. Además de revelar aquellas secuencias de ADN que codifican exones y moléculas de ARN funcionalmente importantes, estas regiones conservadas incluirán secuencias de ADN reguladoras, así como secuencias de ADN con funciones que aún no se conocen. La mayoría de las regiones no conservadas reflejarán ADN cuya secuencia es mucho menos probable que sea crítica para la función.

Las alteraciones del genoma son causadas por fallas de la mecánica normal para copiar y mantener el ADN, así como por elementos de ADN transponibles.

La mayoría de los cambios genéticos que ocurren simplemente son el resultado de fallas en la mecánica normal por la cual los genomas se copian o reparan cuando se dañan, aunque el movimiento del elemento de ADN transponible también juega un papel importante.

El error es que la replicación, recombinación o reparación del ADN conduce a cambios locales simples (mutaciones puntuales) o reordenamientos del genoma a gran escala (como deleciones, duplicaciones, inversiones y translocaciones de ADN de un cromosoma a otro.

Los genomas contienen elementos de ADN móviles que son una fuente importante de cambio genómico. Estos transposones son secuencias de ADN parasitarias que pueden diseminarse dentro de los genomas que colonizan. En el proceso, a menudo interrumpen la función o alteran la regulación de genes existentes.

Las secuencias del genoma de dos especies difieren en proporción al período de tiempo, ya que han evolucionado por separado.

El marco organizativo básico de la genómica comparada es el árbol filogenético.

Selección purificadora: selección que elimina a los individuos portadores de mutaciones que interfieren con importantes funciones genéticas.

Los árboles filogenéticos construidos a partir de una comparación de secuencias de ADN trazan las relaciones de todos los organismos.

Podemos hacer un reloj molecular para la evolución. Los relojes funcionan más rápidamente en secuencias que no están sujetas a selección purificadora. El reloj corre más lento para secuencias que están sujetas a fuertes restricciones funcionales.

El ritmo al que funcionan los relojes moleculares está determinado no solo por el grado de selección purificadora, sino también por la tasa de mutación.

Una comparación de los cromosomas humanos y de ratón muestra cómo divergen las estructuras de los genomas

Como era de esperar, los genomas humanos y de chimpancé son mucho más parecidos que los genomas humanos y de ratón, aunque los tres genomas son aproximadamente del mismo tamaño y contienen conjuntos de genes casi idénticos. Si bien la forma en que el genoma está organizado en cromosomas es casi idéntica entre humanos y chimpancés, esta organización ha divergido enormemente entre humanos y ratones. Una conclusión inesperada de una comparación detallada de las secuencias completas del genoma humano y del ratón, confirmada por comparaciones posteriores entre los genomas de otros vertebrados, es que pequeños bloques de secuencia de ADN se eliminan y se agregan a los genomas a una velocidad sorprendentemente rápida. Por lo tanto, si asumimos que nuestro antepasado común tenía un genoma de tamaño humano (alrededor de 3,2 mil millones de pares de nucleótidos), los ratones habrían perdido un total de aproximadamente el 45% de ese genoma por deleciones acumuladas durante los últimos 80 millones de años, mientras que los humanos habrían perdido perdió alrededor del 25%.

El tamaño del genoma de un vertebrado refleja las tasas relativas de adición y pérdida de ADN en un linaje.

Si bien inicialmente era un misterio, ahora tenemos una explicación simple para diferencias tan grandes en el tamaño del genoma entre organismos similares: debido a que todos los vertebrados experimentan un proceso continuo de pérdida de ADN y adición de ADN, el tamaño de un genoma simplemente depende del equilibrio entre estos procesos opuestos. actuando durante millones de años.

Podemos inferir la secuencia de algunos genomas antiguos.

Las comparaciones de secuencias de múltiples especies identifican secuencias de ADN conservadas si su función es desconocida

Se sabe que muchas de las secuencias conservadas que no codifican proteínas producen moléculas de ARN no traducidas.

Los cambios en secuencias previamente conservadas pueden ayudar a descifrar los pasos críticos de la evolución.


Cómo una enzima repara el ADN a través de un mecanismo & # 8220Pinch-Push-Pull & # 8221

En el panel superior izquierdo se muestra la timina ADN glicosilasa (TDG) en complejo con ADN. El perfil de energía libre para el cambio de base inducido por TDG se muestra en el panel superior derecho. Las estructuras de la base de ADN volteada que interactúa con la enzima en varios estados intermedios se muestran y mapean en la ruta de cambio de la base (como se indica mediante flechas). & # 160Crédito: Dr. Chunli Yan y Tom Dodd, Universidad Estatal de Georgia

Al principio, la frase aliterada suena notablemente simplista: & # 8220pinch-push-pull. & # 8221

Pero cuando se trata de preservar uno de los procesos básicos de la biología & # 8211 la replicación del código genético & # 8211, este triplete de una sola sílaba marca la diferencia entre la división celular normal y una mutación potencialmente peligrosa.

En un estudio publicado en la edición del 21 de mayo de 2018 de la procedimientos de la Academia Nacional de Ciencias, un equipo de investigadores & # 8211 ayudado con recursos de supercomputación del Centro de Supercomputación de San Diego (SDSC) con sede en UC San Diego & # 8211 creó una simulación informática dinámica para delinear un proceso biológico clave que permite al cuerpo reparar el ADN dañado.

La simulación describe en detalle cómo una enzima clave de reparación del ADN llamada timina ADN glicosilasa (TDG) busca por primera vez ADN dañado entre un vasto fondo de ADN normal. Una vez descubierta, la enzima comprime o pellizca el ADN para que la lesión, una base de ADN químicamente modificada o no coincidente, salga de la pila de bases de ADN y luego se empuje hacia el sitio activo de la enzima. & # 160 Una vez que se captura la base aberrante , la enzima la tira y corta del resto de la molécula de ADN. Esto inicia los pasos bioquímicos posteriores para restaurar el ADN a su condición original, completando así la reparación.

O, como resume el documento: & # 8220pinch-push-pull. & # 8221

& # 8220Nuestro artículo describe un mecanismo novedoso sobre cómo se produce la búsqueda de lesiones, el interrogatorio de bases y el cambio de rumbo, y explica el origen de la extraordinaria especificidad de la ADN glicolilasa de timina, & # 8221 & # 160 Ivaylo Ivanov, profesor asociado de química en la Universidad Estatal de Georgia y el investigador principal del estudio. & # 8220 Una comprensión más profunda de estos procesos y las respectivas vías bioquímicas podría ser importante tanto desde el punto de vista médico como biológico. & # 8221

En esencia, TDG tiene un papel doble en el proceso de reparación del ADN: mantener la integridad del ADN y eliminar los marcadores epigenéticos & # 8211 derivados principalmente oxidados de 5-metil citosina & # 8211 que pueden silenciar la actividad de un gen & # 8217s sin cambiar su secuencia. Dicho de otra manera, TDG funciona como una tijera molecular que corta una base de ADN dañada o una base que lleva una modificación epigenética.

& # 8220 Es importante comprender la selectividad de TDG, & # 8221 añadió Ivanov. & # 8220 Estas proteínas reparadoras son objetivos para el desarrollo de inhibidores y se pueden utilizar como adyuvantes en la terapia del cáncer. & # 8221

Gran parte de este estudio se basa en descubrimientos pioneros en la reparación del ADN que le valieron el Premio Nobel de Química 2015 para Tomas Lindahl, Paul Modrich y Aziz Sancar por haber mapeado y explicado cómo la célula repara su ADN para salvaguardar la información genética. N.º 8221

Desde una perspectiva química, el ADN es una molécula notablemente estable. & # 160Pero el daño al ADN en las células vivas ocurre miles de veces al día, principalmente debido a dos fuentes: errores en la replicación del genoma o agentes ambientales como la luz ultravioleta, químicos tóxicos, radiación ionizante y la presencia interna de moléculas reactivas.

& # 8220Considerando la frecuencia con la que el ADN es atacado cada día, es & # 8217 sorprendente cómo cualquier forma de vida logra preservar y mantener su código genético & # 8221, dijo Ivanov.

El genoma permanece relativamente intacto durante años gracias a una serie de mecanismos de reparación que circulan en nuestras células. Uno de los primeros y más importantes procesos empleados por estos equipos de reparación se llama reparación por escisión de base o BER, identificado en 1996 por Lindahl, entonces director del Laboratorio Clare Hall de la Universidad de Cambridge. En esencia, Lindahl descubrió que las glicosilasas representaban el primer paso en el proceso de reparación del ADN.

La investigación posterior explicó con más detalle cómo funcionaba el proceso, incluidos modelos informáticos basados ​​en el análisis de rayos X de cristales de proteínas que capturaron instantáneas del mecanismo. Sin embargo, estas imágenes estáticas aún no lograron describir los pasos intermedios críticos.

En su PNAS artículo, los investigadores del estado de Georgia recurrieron a técnicas de dinámica molecular computacional y SDSC & # 8217s Cometa superordenador para simular los giros y movimientos aparentemente espasmódicos de TDG mientras esculpe o comprime su ADN objetivo, voltea y extirpa las lesiones detectadas. Asignaciones para Cometa fueron proporcionados por eXtreme Science and Engineering Discovery Environment (XSEDE), financiado por la National Science Foundation (NSF).

Entre otras cosas, los investigadores pudieron calcular & # 8220 perfiles de energía libres & # 8221 favorables que guiaron al TDG en su búsqueda de lesiones.

& # 8220 Piense en un perfil de energía libre como una especie de mapa, & # 8221, dijo Ivanov. & # 8220 Los valles en el mapa son lugares favorables para que la base extruida resida mientras se desplaza hacia el sitio activo de la enzima. La medida de & # 8216favorable & # 8217 en este caso es una cantidad termodinámica que llamamos energía libre. El camino seguirá las regiones de energía libre más bajas. & # 8221

As summarized by the study: “Our results show that DNA sculpting, dynamic glycosylase interactions, and stabilizing contacts collectively provide a powerful mechanism for the detection and discrimination of modified bases and epigenetic marks in DNA.”

Ivanov said their study would have been difficult to complete if the research team had to rely on local computer resources.

Cometa was the best XSEDE resource for us because it provided access to GPUs (graphics processing units) and the code that we used (Amber 16) provides one of the fastest GPU implementations of molecular dynamics” he said.

Also participating in this study, titled “Uncovering universal rules governing selectivity of the archetypal DNA glycosylase TDG”, were Thomas Dodd, Chunli Yan, Bradley Kossman, and Kurt Martin, all from Georgia State University.

Support for the research was provided by a grant from the National Institutes of Health (GM110387) and the NSF (MCB-119521). In addition to allocations from XSEDE, computation resources were provided by the National Energy Research Scientific Computing Center (NERSC), supported by the Department of Energy Office of Science.

As an Organized Research Unit of UC San Diego, SDSC is considered a leader in data-intensive computing and cyberinfrastructure, providing resources, services, and expertise to the national research community, including industry and academia. Cyberinfrastructure refers to an accessible, integrated network of computer-based resources and expertise, focused on accelerating scientific inquiry and discovery. SDSC supports hundreds of multidisciplinary programs spanning a wide variety of domains, from earth sciences and biology to astrophysics, bioinformatics, and health IT. SDSC’s petascale Cometa supercomputer is a key resource within the National Science Foundation’s XSEDE (Extreme Science and Engineering Discovery Environment) program.


MATERIALES Y MÉTODOS

Expression and purification of HMO1 protein

Plasmid pJ1870 encoding yeast HMO1 cloned in-frame with an N-terminal His6 tag in expression vector pTEV derived from pET15b (Novagen) was transformed into Escherichia coli BL21(DE3) (Agilent Technologies), and grown in 250-ml LB culture at 37°C with shaking until the culture reached a cell density corresponding to an OD600 of 0.6. Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) was added to a final concentration of 1 mM and cells were grown at 37°C overnight with shaking, pelleted by centrifugation at 6000 g, and the cell pellet was then resuspended in 10 ml binding buffer (50 mM NaPO4, 300 mM NaCl, pH 7.5) containing 10 mM phenylmethlysulfonylfluoride (PMSF) and passed five times through an Emulsiflex C-5 high-pressure homogenizer (Avestin). The lysate was clarified by centrifugation at 22 000 g for 45 min at 4°C and the supernatant recovered. Su6-tagged protein was purified using Ni-NTA agarose resin (Qiagen) per the manufacturer's recommendations. Briefly, washed Ni-NTA agarose resin was added in a 1:4 (v:v) ratio to the lysate, gently rotated at 4°C for 1 h, then loaded onto a 1.5 × 15 cm column. Resin-bound protein was washed with 200 ml wash buffer (50 mM NaPO4, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole, pH 7.5). These conditions were sufficient to release bound contaminating DNA. Protein was eluted from the resin with elution buffer (50 mM NaPO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 7.5) collecting 2 ml fractions until no protein was detectable with Bradford reagent. Fractions containing the protein of interest were combined and reduced to 2 ml using centrifugal cartridges (Vivaspin), and proteins were dialyzed at 4°C against 1 liter buffer containing 20 mM HEPES pH 7.5, 100 mM KCl, 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and 1 mM dithiothreitol (DTT), followed by a second dialysis against the same buffer containing 5% glycerol.

Purified protein was detagged using His6-tagged-TEV protease followed by dialysis into binding buffer to remove residual imidazole. Detagged protein was purified from the His6-tag and His6-tagged-TEV protease by column chromatography as described above, but with elution using nine steps of increasing imidazole concentration between 5 and 250 mM. Fractions with the desired protein were combined and reduced to 2 ml by centrifugal concentration and proteins were dialyzed at 4°C against 1 liter buffer containing 20 mM HEPES pH 7.5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA and 1 mM DTT, followed by a second dialysis against the same buffer containing 5% glycerol. Protein quality was confirmed by sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis, DNA affinity quantitated by electrophoretic gel mobility shifts assays and DNA bending confirmed by enhancement of T4 DNA ligase-mediated DNA cyclization.

Protein–DNA sample preparation for atomic force microscopy

We use 4361 bp linearized plasmid DNA pBR322. Linearization was performed by PvuII digestion followed by phenol extraction ( 20). The freshly cleaved mica surface was exposed to 5 mM Mg 2+ for 20 min at ambient temperature and pressure. The surface was then rinsed with distilled water and air dried. A DNA solution of 0.11 nM was deposited and allowed to incubate for 30 min, then rinsed and dried with argon gas. In order to image the protein-bound DNA complexes, 3 nM protein was incubated with 0.11 nM linearized plasmid pBR322 DNA with 10 mM Tris–HCl (pH 8.0) and 5 mM Mg 2+ , then deposited on the mica surface, left to equilibrate for 20 min, and finally rinsed and dried with argon gas.

Optical tweezers

To investigate and characterize HMO1–DNA interactions, we use dual beam optical tweezers with 830 nm lasers, which can sustain a force up to 300 pN. The experimental setup consists of focusing two laser beams into a 1 μm diameter spot. A bead of high refractive index compared to the surrounding medium will be attracted to the focal point. A second bead is immobilized by a glass micropipette. A high resolution piezoelectric stage (0.15 nm resolution, Npoint) is used to extend the DNA. The force is measured from the refraction of the laser from the polystyrene bead. Once the single molecule is captured between the two beads, the solution around the DNA is exchanged by flowing in 10 times the flow cell volume of protein solution at fixed concentration followed by thermal equilibration and DNA stretching. The buffer solution consisted of 100 mM Na + and 10 mM HEPES pH 7.5. Bridging and looping effects were observed by holding DNA molecules at stretching forces <1 pN.

Aquí Θ is the DNA fractional site occupancy, KD is the dissociation constant, norte is the binding site size (norte = 26 bp), C is the concentration and ω is binding cooperativity parameter.

Atomic force microscopy imaging

A Bruker Nanoscope V MultiMode 8 atomic force microscope is used with Peak-Force Tapping™ mode. In this mode, a force curve is obtained at every pixel of the image. The peak force is used as a feedback parameter in order to image topography. The sample can be scanned at lower forces and with shorter contact time, thus protecting delicate samples. For imaging in air, a silicon cantilever is used (resonance frequency = 70 kHz, spring constant = 0.4 N/m and tip radius = 2 nm). The experiments were performed at room temperature. Images are processed using Nanoscope Analysis software, which consists of subtracting the average of each line in order to remove planar artifacts. The scan range used was 1 μm × 1 μm and 2 μm × 2 μm at 512 × 512 pixels and at 1024 × 1024 pixels, respectively. To quantify the atomic force microscopy (AFM) images, DNA molecules were traced and analyzed with NCTracer, software developed by the Neurogeometry Lab at Northeastern University ( 22, 23).


1. Introducción

Double-stranded (ds) DNA can adopt multiple conformations, exhibiting ‘polymorphism’, directly related to the physical properties of the molecule and to its biological function. The most well-known forms of dsDNA are the B-, A- y Z-forms. los B-form is the ‘normal’ DNA found in most biological aqueous contexts. Under reduced water conditions the A-form is favoured, and under certain ionic and base sequence conditions the inverted Z-form prevails. Biological roles of both A- y Z-DNA are possible (Arnott et al. Reference Arnott, Chandrasekaran, Millane and Park 1986 Brown et al. Reference Brown, Lowenhaupt, Wilbert, Hanlon and Rich 2000 Lu et al. Reference Lu, Shakked and Olson 2000 Rich et al. Reference Rich, Nordheim and Wang 1984). Compared with many other polymers, DNA has a spectacular compactness and high stiffness (‘persistence length’) and with a high negative charge density owing to the presence of close phosphate groups in the backbone. The high persistence length is in part due to the electrostatic repulsion of these moieties, partly to the local steric interactions of the coin pile-stacked nucleobases. The great stability of B-form DNA, needed to securely store the genomic information, is due to mainly the stacking of the bases, which in turn is due to hydrophobic effects (requiring surrounding bulk water) and to anisotropic dispersive forces (Friedman & Honig, Reference Friedman and Honig 1995). The base-pair hydrogen bonds, which are important for many biological processes, play only a partial role in the stability of DNA (Guckian et al. Reference Guckian, Krugh and Kool 2000) but are strengthened by the hydrophobic environment in the core of the close-packed bases (see below). DNA can be extended, twisted or unwound during diverse biological processes, such as DNA repair, chromatin compaction and gene regulation. Proteins that interact with DNA are able to exploit the unique structural properties of DNA, although it is not clear to what extent the polymorphic phase map is fully exploited. Taking the particular case of homologous recombination, the recombinase proteins RecA and Rad51 organize themselves in a helical manner around DNA, which is unwound and stretched to about 50% in length compared with the ds B-form (dsDNA). RecA and Rad51 play crucial roles in chaperoning homologous recombination and DNA repair by catalyzing strand exchange in, respectively, prokaryotes and eukaryotes. They use similar molecular reaction mechanisms for the strand exchange reaction and bind first to a single-stranded (ss) part of DNA with high cooperativity, in the presence of ATP, to form a filamentous complex in which DNA adopts an extended conformation (Flory et al. Reference Flory, Tsang and Muniyappa 1984). The ssDNA–RecA filament then interacts with an incoming dsDNA to form an ssDNA–RecA–dsDNA complex (Kiianitsa & Stasiak, Reference Kiianitsa and Stasiak 1997) and, if the two DNAs have the same or similar sequence, strand exchange occurs.

Twenty-five years ago, we studied shear-aligned fibres of Escherischia coli RecA complexes with both ss as well as dsDNA in aqueous solution by small-angle neutron scattering (SANS) and UV linear dichroism (LD) spectroscopy under identical flow conditions (Nordén et al. Reference Nordén, Elvingson, Kubista, Sjöberg, Ryberg, Ryberg, Mortensen and Takahashi 1992). The orientation created a well-resolved SANS pattern, where the helical diffraction cross provided exact information about the helix pitch and, most importantly, yielded the flow orientation distribution, making it possible to translate the LD signals into average base-plane orientations (Hagmar et al. Reference Hagmar, Norden, Baty, Chartier, Takahashi, Nordén, Baty, Chartier and Takahashi 1992 Nordén et al. Reference Nordén, Elvingson, Kubista, Sjöberg, Ryberg, Ryberg, Mortensen and Takahashi 1992). Electron microscopy had revealed that the DNA was extended by approximately a factor of 1·5 (Stasiak & Di Capua, Reference Stasiak and Di Capua 1982 Stasiak et al. Reference Stasiak, Di Capua and Koller 1981), but surprisingly the base orientation concluded from LD did not show any inclination of the base planes (neither for ss- nor for dsDNA) as would be expected for a continuously stretched and unwound DNA form (Hagmar et al. Reference Hagmar, Norden, Baty, Chartier, Takahashi, Nordén, Baty, Chartier and Takahashi 1992 Nordén et al. Reference Nordén, Elvingson, Kubista, Sjöberg, Ryberg, Ryberg, Mortensen and Takahashi 1992, Reference Nordén, Wittung-Stafshede, Ellouze, Kim, Mortensen and Takahashi 1998). This observation remained puzzling until 2002, when the application of systematically mutated aromatic residues in RecA allowed a three-dimensional model to be constructed for the aqueous solution structures of RecA-dsDNA and RecA-ssDNA (Morimatsu et al. Reference Morimatsu, Takahashi and Nordén 2002). From LD results combined with crystal data for RecA (Story et al. Reference Story, Weber and Steitz 1992), a model emerged in which the DNA was accommodated in an ordered way inside a helical arrangement of RecA monomers allowing the bases to be perpendicular (Morimatsu et al. Reference Morimatsu, Takahashi and Nordén 2002). A later crystal structure of RecA–dsDNA and RecA–ssDNA confirmed our conclusion: a near perpendicular nucleobase orientation and clustering of triplets of bases stacked approximately as in B-form DNA (Chen et al. Reference Chen, Yang and Pavletich 2008) (Fig. 1). Using LD spectroscopy together with site-specific tyrosine mutations, we found a similar nucleobase organization, perpendicular to the fibre axis of the complex, for the dsDNA complex with Rad51 in solution (Reymer et al. Reference Reymer, Frykholm, Morimatsu, Takahashi and Nordén 2009). For the Rad51 complex with ssDNA, however, a perpendicular base orientation was observed only in the presence of activating factors, such as Ca 2+ ion or Swi5/Sfr1 protein (Fornander et al. Reference Fornander, Renodon-Corniére, Kuwabara, Ito, Tsutsui, Shimizu, Iwasaki, Nordén and Takahashi 2014). Recent cryo-EM high-resolution structural analyses of activated human Rad51 in complex with DNA have demonstrated conserved features with the RecA system (Xu et al. Reference Xu, Zhao, Xu, Zhao, Sung and Wang 2017).

Fig. 1. The DNA structure inside a RecA-dsDNA filament according to crystal structure (left) (Chen et al. Reference Chen, Yang and Pavletich 2008) compared with free-solution double-stranded B-form DNA (right).

In 2012, we identified using single-molecule force spectroscopy on short synthetic DNAs, in the absence of recombination proteins, the existence of an overstretched state of DNA, which we shall here return to and study in detail. All evidence indicates it is a thermodynamically well-defined conformation. We will call it Σ-DNA, and it consists of a ca 50% extended stable conformation of ds (base-paired) GC-rich DNA, at a transition force of ca 64 pN applied to the 3′−3′ strands (Bosaeus et al. Reference Bosaeus, El-Sagheer, Brown, Smith, Akerman, Bustamante and Norden 2012). The Σ-form may be considered a special case of the wider group of stretched DNA forms that have been called ‘S-DNA’ some of which, though, appear less well defined. In contrast to the Σ-form observed for base-paired GC-rich DNA stretched along the 3′–3′ ends, S-DNA is usually observed as a 70% elongated form when stretching a long plasmid or phage DNA (Cluzel et al. Reference Cluzel, Lebrun, Heller, Lavery, Viovy, Chatenay and Caron 1996 Williams et al. Reference Williams, Rouzina and Bloomfield 2002) and, at least in AT-rich DNA, S-DNA appears to involve denaturation (Bosaeus et al. Reference Bosaeus, El-Sagheer, Brown, Smith, Akerman, Bustamante and Norden 2012, Reference Bosaeus, El-Sagheer, Brown, Åkerman and Nordén 2014). The fact that the Σ-form has so long escaped discovery is thought to be due to that it is first recently stretch experiments on short synthetic DNA have been possible with high accuracy (Bosaeus et al. Reference Bosaeus, El-Sagheer, Brown, Smith, Akerman, Bustamante and Norden 2012, Reference Bosaeus, El-Sagheer, Brown, Åkerman and Nordén 2014).

The degree of extension that we observe for Σ-DNA, compared with B-DNA, is within experimental error the same as that found in complexes with the recombinase enzymes RecA and Rad51. One may thus ask if this is just a coincidence or if this structural distortion is somehow related to biological function. Here we further analyze previous data and perform some new strategic single-molecule and computational experiments in order to assess the possibility that Σ-DNA may have fundamental roles in biology.

Our hypothesis is that Σ-DNA is an inhomogeneous structure consisting of stacked triplets of nucleobases, with base planes arranged perpendicularly as in B-DNA, and that these triplets are separated by empty gaps. Such a triplet structure may have a biological role in enhancing the recognition of complementary base sequence and promote the strand exchange process in gene recombination. We further speculate that the base triplets separated by gaps may be a physical origin of the occurrence of three letters in the genetic code.


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Regulation of Gene Transcription

Virtually every adaptation and developmental process originates at the level of gene regulation by transduction of extra- or intracellular signals. Transcription is the major target of regulation of gene expression. Our research interest covers modulation of transcription by DNA control elements and regulatory proteins, for example, repressors, activators, terminators, and antiterminators and their cognate signal molecules. We have demonstrated transcriptional regulation both at the level of initiation by activators and repressors and at the level of elongation by terminators and antiterminators in the galón operon which encodes enzymes of D-galactose metabolism in Escherichia coli. Presumably because of the amphibiotic nature of the biochemical pathway in carbon metabolism, the operon shows a multitude of controls at all levels of transcription and has been a paradigm system for studying control of transcription. The operon is transcribed from two promoters which are subject to both negative and positive control by at least four proteins, Gal repressor, Gal isorepressor, cyclic AMP receptor protein, and bacterial histone like protein, HU.

Major Findings:

  • The two promoters of the galón operon are regulated by formation of a DNA loop. We have determined the structure, assembly and dynamics of the DNA loop, which constitute a higher order nucleoprotein complex (Gal repressosome). The characterization involves genetic and biochemical analysis, evaluation of DNA elastic energy, atomic force microscopy and in vitro single molecule analysis. In the Gal repressosome a DNA loop is formed by the interaction of two GalR dimers, bound to two spatially separated operators, OE and OI, flanking the galón promotores. Structure-based genetic analysis have indicated that GalR homodimers interact directly and form a V-shaped stacked tetramer in repressosome, which is further stabilized by HU binding to an architecturally critical position on the DNA. In this scheme of GalR tetramerization, the alignment of the operators in the DNA loop could be in either parallel (PL) or antiparallel (AL) mode. As each mode can have two alternative geometries differing in the mutual stacking of the OE - and OI -bound GalR dimers, it is feasible to have four different DNA trajectories in the repressosome. Our results show that OE and OI adopt a mutual AP orientation in an under-twisted DNA loop, consistent with the energetically optimal structural model. In this structure the center of the HU-binding site is located at the apex of the DNA loop. The approach reported here can be used to distinguish between otherwise indistinguishable DNA trajectories in complex nucleoprotein machines.
  • We have demonstrated that a regulator inhibits or stimulates transcription initiation by disabling or stimulating RNA polymerase activity at a post-binding step by directly or indirectly altering the specific domain of RNA polymerase by a direct GalR-RNA polymerase contact(s) to an unfavorable or to a more favorable state, respectively. Base unpairing during isomerization of the closed to open complex at a promoter is an asynchronous process with a rate-limiting step as observed by 2, AP fluorescence kinetics.
  • We have shown that a stretch of purines present in a specific transcribing region can override transcriptional pause signals by preventing RNA polymerase back-tracking created by the a pause signal.
  • We have determined the axiom that determines the start point of transcription by RNA polymerase.
  • Small molecules generally activate or inhibit gene transcription as externally added substrates or as internally accumulated end-products, respectively, Rarely has a connection been made that links an intracellular intermediary metabolite as a signal of gene expression. We have shown that a perturbation in the critical step of a metabolic pathway changes the dynamics of the pathways leading to accumulation of an intermediary metabolite. This accumulation causes cell stress and transduces signals that alter gene expression so as to cope with the stress by restoring balance in the metabolite pool. This underscores the importance of studying the global effects of alterations in the level of intermediary metabolites in causing stress and coping with it by transducing signals to genes to reach a stable state of equilibrium (homeostasis).
  • From modeling studies, we have concluded that the structure of the regulatory network is insufficient for the determination of signal integration. It is the actual structure of the promoter and regulatory region, the mechanism of transcription regulation and the interplay between the transcription factors that shape the input function to be suitable for adaptation.

Regulatory Biology of Bacteriophage λ
The lysis-lysogeny decision of bacteriophage λ is a paradigm for developmental genetic networks. Two key features characterize the λ network. First, after infection of the host bacterium, a decision between lytic or lysogenic development is made that is dependent upon environmental signals and the number of infecting phages per cell. Second, the lysogenic prophage state is very stable. The CI and Cro regulators define the lysogenic and lytic states, respectively, as a bistable genetic switch. Whereas CI maintains a stable lysogenic state, recent studies indicate that Cro sets the lytic course not by directly blocking CI expression but indirectly by lowering levels of CII, which activates CI transcription. We are investigating how a relatively simple phage like λ employs a complex genetic network in decision-making processes, providing a challenge for theoretical modeling. Recently, we have made the following observations:

  • The poles of bacteria exhibit several specialized functions related to the mobilization of DNA and certain proteins. To monitor the infection of Escherichia coli cells by light microscopy, we developed procedures for the tagging of mature bacteriophages with quantum dots. Surprisingly, most of the infecting phages were found attached to the bacterial poles. This was true for a number of temperate and virulent phages of E. coli that use widely different receptors and for phages infecting Yersinia pseudotuberculosis and Vibrio cholerae. Furthermore, labeling of λ DNA during infection revealed that it is injected and replicated at the polar region of infection. The evolutionary benefits that lead to this remarkable preference for polar infections may be related to λ developmental decision as well as to the function of poles in the ability of bacterial cells to communicate with their environment and in gene regulation.
  • The lysogenic state of bacteriophage λ is exceptionally stable yet the prophage is readily induced in response to DNA damage. This delicate epigenetic switch is believed to be regulated by two proteins the lysogenic maintenance promoting protein CI and the early lytic protein Cro. First, we have confirmed the previous observation that a DNA loop mediated by oligomerization of CI bound to two distinct operator regions OL and OR, increases repression of the early lytic promoters and is important for stable maintenance of lysogeny. Second, we have shown that the presence of the Cro gene might be unimportant for the lysogenic to lytic switch during induction of the lambda prophage.
  • The spontaneous derepression of a λ prophage is less than mutational frequency. We have found by in vitro transcription system, that the extreme stability is because of DNA loop formation by interaction of CI-dimers to the right and left λ operators in the prophage state in a cross-wise cooperativity. Multilevel co-operativity in DNA loop discourages CI dissociation from the operators in stabilizing the prophage. It also shields prophage repression against lowering CI concentration and operator mutations.
  • We have studied the stability of a DNA loop by tethered particle motion experiments in single DNA molecule experiments to study the dynamics of λ DNA looping. Modeling the thermodynamic data thus obtained established that the loop that involves 12-CI monomer is the stable one. The one that involves only 8 monomers has a positive free energy.

Bacterial Nucleoid
Bacterial necleoid organization is believed to have minimal influence on the global transcription program. Using an altered bacterial histone-like protein, HUα, we show that reorganization of the nucleoid configuration can dynamically modulate the cellular transcription pattern. The mutant protein transformed the loosely packed nucleoid into a densely condensed structure. The nucleoid compaction, coupled with increased global DNA supercoiling, generated radical changes in the morphology, physiology, and metabolism of wild-type Escherichia coli K-12. Many constitutive housekeeping genes involved in nutrient utilization were repressed, whereas many quiescent gene associated with virulence were activated in the mutant. We propose that, as in eukaryotes, the nucleoid architecture dictates the global transcription profile and, consequently, the behavior pattern in bacteria. We are investigating whether the E. coli nucleoid has a defined structure. In support of that we have made the following observations:

  • Molecular mechanisms of bacterial chromosome packaging are still unclear. Among the factor facilitating DNA condensation may be a propensity of the DNA molecule for folding due to its intrinsic curvature. As suggested previously, the sequence correlations in genome reflect such a propensity. We analyzed positioning of A-tracts (the sequence motifs introducing the most pronounced DNA curvature) in the Escherichia coli genoma. A-tracts are over-represented and distributed 'quasi-regularly' throughout the genome, including both the coding and intergenic sequences. There is a 10-12 bp periodicity in the A-tract positioning indicating that the A-tracts are phased with respect to the DNA helical repeat. The latter feature was revealed with the help of a novel approach based on the Fourier series expansion of the A-tract distance autocorrelation function. Since the A-tracts introduce local bends of the DNA duplex and may serve as binding sites for the nucleoid-associated proteins that have affinities for curved DNA. We have suggested that long clusters of the phased A-tracts constitute the 'structural code' for DNA compaction by providing the long-range intrinsic curvature and increasing stability of the DNA complexes with architectural proteins.
  • We have determined the crystal structure of the Escherichia coli nucleoid-associated HU protein by x-ray diffraction and observed that the heterodimers form multimers with octameric units. It is of special importance that one of the structures forms spiral filaments with left-handed rotations. A negatively superhelical DNA can be modeled to wrap around this left-handed HU multimer, thus providing the structural explanation for the classical property of HU to restrain negative supercoils in DNA.
  • The contribution of global nucleoid organization in determining cellular transcription programs is unclear. Using a mutant form of the abundant nucleoid-associated HU we showed that nucleoid remodeling by the mutant protein re-organizes the global transcription pattern. We have demonstrated that, unlike the dimeric wild-type HU, the mutant HU is an octamer and wraps DNA around its surface. The formation of wrapped nucleoprotein complexes by the mutant HU leads to a high degree of DNA condensation. The DNA wrapping in the mutant is right-handed, which restrains positive supercoils.

Bacteriophage Applications
Bacteriophage (phage) have been used in treatment of bacterial infections in humans since their discovery many decades ago, but the practice was discontinued because of lack of scrutiny required for Western medicine, and because of the discovery of potent antibiotics. Widespread occurrence today of drug resistant pathogens motivated us to attempt to revive phage-based diagnosis and treatment of bacterial infections using E. coli y Yersinia pestis as model systems.

In these studies, we used λ and T7-like phages that we mutated or engineered for use in therapy of experimental bacteremic animals, in the investigation of mutation rates in cancer cells and in the detection of E. coli y Yersinia pestis in clinical and environmental samples.

  • Analysis of protein-protein interactions is critical in proteomics and drug discovery. Usage of a bacterial or yeast 2-hybrid system to detect protein-protein interaction is limited to an en vivo medio ambiente. Using the λ- display system, we have developed a phage-based 2-hybrid system for in vitro investigations.

Collaborators on this research include Victor Zhurkin, CCR, NCI, NIH, and Laura Finzi, Emory University, Atlanta, GA.


DISCUSIÓN

The multi-step process of change of linking number catalyzed by topoisomerases is likely to require participation of different functional groups in different steps of the reaction. In the current mechanism of E. coli topoisomerase I, Tyr319 is responsible for nucleophilic attack on DNA and formation of the covalent bond between the enzyme and the 5′ phosphate of the cleaved DNA (7). Glu9 found also in the active site has been implicated in the process of DNA cleavage (9,10). In its proximity, Ser10 and Lys13 are conserved residues with side chains that could also participate in the catalytic process. Results presented here on the site-directed mutants support a role for these two residues in the DNA cleavage step of the enzyme mechanism. Altering these residues to alanines did not affect non-covalent binding to DNA, but significantly reduced the formation of the cleaved DNA complex. The changes of Ser10 to Thr and Lys13 to Arg had more severe effects on the enzyme, reducing also the non-covalent binding of enzyme to DNA. Although proteolytic digestion of the S10T and K13R mutants did not indicate severe defects in protein folding, the changes in the side chains in these substitutions could potentially affect the structure of the junction region between domains I and III at the active site, affecting also the non-covalent interaction of the enzyme with the single-strand of DNA that has to be positioned at the active site for cleavage.

In the crystal structure of E. coli topoisomerase III complexed with ssDNA (17), the lysine residue (Lys8) that corresponds to Lys13 in topoisomerase I is in a position to interact with the phosphate group of the scissile bond ( Figure 1 ). The importance of this residue in DNA cleavage as suggested by the structural data (17) is now demonstrated biochemically in this study.

In the structure of the 67 kDa N-terminal fragment of topoisomerase I, the side chains of both Ser10 and Lys13 are in the vicinity of Tyr319 with their relative positions switched when compared with Lys8 and Ser10 of topoisomerase III ( Figure 1 ). The positively charged side chain of Lys13 is expected to interact with either the scissile phosphate and/or the acidic pocket of Glu9/Asp111/Asp113 via electrostatic interactions. The results from our molecular modeling simulations support the interaction of Lys13 with the acidic pocket, particularly with Glu9 and Asp111. Although our models show that the distance from Lys13's amide group to the scissile phosphate is 𢏇 Å, conformational changes in the enzyme might easily halve the distance between these groups. Modeling studies currently underway simulating the transition of the ‘open’ complex to the 𠆌losed’ complex may reveal further details of these proposed interactions.

In the crystal structure of the topoisomerase III𠄽NA complex (17), the side chain of Ser10 does not appear to be in a position to participate directly in DNA cleavage. Nevertheless, this residue is in proximity to the phosphate immediately 3′ of the scissile phosphate and a water-mediated hydrogen bond is observed between Ser10 and this phosphate. The topoisomerase enzyme used in the crystallization of this complex has phenylalanine substituted for the active site tyrosine. It is also in the absence of the Mg 2+ ions required for catalytic activity and using a short oligonucleotide substrate. It cannot be ruled out that with the conformational changes expected from topoisomerase in the presence of either an active site tyrosine, Mg 2+ ions, or with longer ssDNA substrates that the position of the side chain of this serine residue could change to participate more directly in DNA cleavage. In our simulated topoisomerase I complex with a longer oligonucleotide, the side chain of Ser10 forms a hydrogen bond directly with the phosphate 3′-adjacent to the scissile phosphate. This interaction appears to be crucial to the positioning of the DNA substrate in the active site when this hydroxyl was removed in the S10A mutant, deoxyribose 6 located 5′ to the scissile phosphate shifted from a ‘northern’ pucker to the ‘southern’ pucker typical of B-form DNA. In the F328Y topo-III and H365R topo-I cocrystals (17,18), the analogous deoxyriboses are also observed in a ‘northern’ pucker conformation. The ‘northern’ ribose conformations uniquely position O3′ along the equitorial plane of the ribose which orients the adjacent phosphate oxygens towards the tyrosine nucleophile. Thus, Ser-10 aides the positioning of the scissile phosphate for DNA cleavage and may account for the conserved presence of this serine residue among type IA topoisomerase sequences. We propose that helix O and Ser10, respectively are the 5′ and 3′ ends of a clamp that holds the DNA substrate in the active site properly positioned for cleavage.

Topoisomerase mechanisms share a common feature with some enzymatic phosphoryl transfer reactions in the formation of a covalent intermediate. In these two-stage mechanisms, an enzyme nucleophile first attacks a phosphorus to form a stable covalent intermediate. In the second stage of the reaction, the covalent intermediate is in turn attacked by a nucleophile to generate the free enzyme again and reaction products (32). Enzymatic phosphoryl or nucleotidyl transfer reactions are often facilitated by surrounding the attacked phosphate with positively charged groups including the side chain of lysine residues (33,34). In the study of the mechanism of enzymatic phosphoryl transfer by phosphoserine phosphatase, a hydrogen bond between an active site serine residue and a non-bridging oxygen of the phosphoryl group, as well as salt bridge interactions by an active site lysine residue, have been proposed to be important for ground-state stabilization (32,35). Therefore examples of utilization of a combination of conserved active site serine and lysine residues to catalyze the formation of a phosphoryl-enzyme covalent intermediate are already known.

A role for the conserved Arg321 with its positively charged guanidinium group close to the active site tyrosine hydroxyl in promoting nucleophilic attack by Tyr319 by stabilization of the negatively charged phenolate ion has been proposed for the mechanism of E. coli DNA topoisomerase I (9,13,24). The corresponding arginine Arg330 in E. coli DNA topoisomerase III was observed to contact the scissile phosphate in the complex with ssDNA (17). A similarly positioned arginine residue may have similar functions in type II topoisomerases (36,37). Based on the structure of E. coli DNA topoisomerase III complexed to ssDNA, it was also proposed that Glu7 of topoisomerase III (corresponding to Glu9 of E. coli DNA topoisomerase I) acts as a general acid catalyst by donating a proton to the leaving 3′-oxygen atom of the scissile bond during DNA cleavage and may also act to abstract a proton from the free 3′-hydroxyl group during nucleophilic activation for DNA religation (17). Mutagenesis studies of His365 of E. coli DNA topoisomerase I led to the proposal that His365 donates a proton to Asp111 which then relays the charge to Glu9 for its protonation (14). The stable salt bridge that Lys13 forms with Glu9 and the observed activity defects in alanine mutagenesis suggests that Lys13 may participate in the proton transfer.

This study provides biochemical evidence that contact with the 3′-downstream phosphate involving Ser10 may also be important for the cleavage step of catalysis and that a second positively charged side chain may be used in the active site to donate a proton and/or contact the scissile phosphate. Similar roles have also been suggested for other active site residues (9,10,18). Active site residues in the topoisomerase may play multiple roles, further underscoring the finding that few alanine mutations completely eliminate relaxation activity (9).

Additional structural information on the different conformations of the enzyme and its complex with DNA, molecular modeling of the different topoisomerase states and the proposed catalytic mechanisms, and mutagenesis data on other conserved amino acids with potential catalytic roles will help elucidate the mechanism of this class of enzyme.


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