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¿Se pueden obtener imágenes de células vivas con microscopía electrónica?

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Según este artículo de octubre de 2009, http://news.mit.edu/2009/electron-microscope

"Los microscopios electrónicos son el tipo de microscopio más poderoso, capaz de distinguir incluso átomos individuales. Sin embargo, estos microscopios no se pueden usar para obtener imágenes de células vivas porque los electrones destruyen las muestras".

"Ahora, el profesor asistente del MIT, Mehmet Fatih Yanik, y su alumno, William Putnam, proponen un nuevo esquema que puede superar esta limitación mediante el uso de una técnica de medición mecánica cuántica que permite a los electrones detectar objetos de forma remota. El daño se evitaría porque los electrones nunca lo harían en realidad golpear los objetos de la imagen ".

¿Es posible todavía obtener imágenes de células vivas con un microscopio electrónico? De no ser así, ¿ha habido algún avance en esta dirección?


Por lo que puedo ver, esto sigue siendo solo una propuesta, aunque no es del todo mi campo, por lo que es posible que alguien haya presentado los resultados en una conferencia en algún lugar.

Echando un vistazo a las citas del artículo original [Microscopía electrónica no invasiva con mediciones cuánticas libres de interacción, Putnam y Yanik Phys. Rev. A 80, 040902 (R)], no parece haber implementaciones experimentales: https://scholar.google.com/scholar?cites=17617747827527972037

De la noticia que vinculó: "[Yanik] espera que el trabajo lance esfuerzos experimentales que podrían conducir a un prototipo en los próximos cinco años". ¡Un buen recordatorio sobre cómo hacer estimaciones de tiempo!


Si bien es posible que todavía no sea posible obtener imágenes de células vivas con EM, es posible obtener imágenes en vivo animales. Por ejemplo, Ishigaki et al. (2012) imágenes de garrapatas en vivo (Haemaphysalis flava) con microscopía electrónica de barrido. Incluso pudieron ver las garrapatas moviendo sus patas dentro del microscopio durante aproximadamente 1 minuto después de entrar en la cámara. Las garrapatas todavía estaban vivas después de que fueron retiradas del vacío dentro del microscopio. La mitad de los expuestos al vacío y al haz de electrones murieron en los dos días siguientes, pero el resto permaneció vivo durante al menos dos semanas más. Aparentemente, las garrapatas que solo se colocaron dentro de la aspiradora sobrevivieron bien. Fue solo cuando fueron atacados con el haz de electrones de alta energía que aumentaron sus posibilidades de morir.

Garrapatas vivas en SEM
Observe que las barras de escala en los paneles B-F deben estar en $ mu m $, no en $ mm $

Este no es el primer estudio que logra obtener imágenes de organismos vivos con microscopía electrónica; eso fue Pease et al. en 1966. Parece que en algunos insectos el haz ionizante induce la polimerización de "sustancias extracelulares" en una membrana delgada (~ 5 $ mu $ m) que actúa como un "nano-traje" protector (Takaku et al. 2013) . Takaku y col. (2013) podría inducir la formación de una membrana delgada protectora similar mediante el uso de polisorbato 20, un tensioactivo ampliamente utilizado. Inducir artificialmente la formación de "nano-trajes" similares puede ser una forma más prometedora de obtener imágenes de células vivas con microscopía electrónica en lugar de depender de mediciones mecánicas cuánticas. Takaku y col. (2013) incluso llegan a especular que la formación natural de "nano-trajes" similares puede haber actuado como un escudo protector para extremófilos procariotas que podrían haber invadido la tierra durante la evolución temprana (hipótesis de la panspermia).


Referencias

- Ishigaki Y, Nakamura Y, Oikawa Y, Yano Y, Kuwabata S, Nakagawa H, et al. (2012). Observación de garrapatas vivas (Haemaphysalis flava) mediante microscopía electrónica de barrido a alta presión de vacío. Más uno 7(3): e32676. http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0032676
- Pease, R.F.W., Hayes, T.L., Camp, A.S. y Amer, N.M., (1966). Microscopía electrónica de insectos vivos. Ciencias, 154(3753): 1185-1186. http://science.sciencemag.org/content/154/3753/1185
- Takaku Y., Suzuki H., Ohta I., IshiiD., Muranaka Y., Shimomura M. y HariyamaT. (2013). Una fina membrana de polímero, nano-traje, que mejora la supervivencia en el continuo entre el aire y el alto vacío. PNAS 110 (19): 7631-7635. 10.1073 / pnas.1221341110


¿Se pueden obtener imágenes de células vivas con microscopía electrónica? - biología


De todas las técnicas utilizadas en biología, la microscopía es probablemente la más importante. La gran mayoría de los organismos vivos son demasiado pequeños para ser vistos en detalle con el ojo humano, y las células y sus orgánulos solo pueden verse con la ayuda de un microscopio. Las células fueron vistas por primera vez en 1665 por Robert Hooke (quien las nombró en honor a las células de los monjes en un monasterio), y Leeuwehoek las estudió con más detalle utilizando un microscopio primitivo.

Unidades de medida

Ampliación y resolución [volver arriba]

Al usar más lentes, los microscopios pueden aumentar en una cantidad mayor, pero esto no siempre significa que se puedan ver más detalles. La cantidad de detalles depende de la poder de resolución de un microscopio, que es la separación más pequeña en la que se pueden distinguir (o resolver) dos objetos separados.

El poder de resolución de un microscopio está limitado en última instancia por la longitud de onda de la luz (400-600 nm para la luz visible). Para mejorar el poder de resolución, se necesita una longitud de onda de luz más corta y, a veces, los microscopios tienen filtros azules para este propósito (porque el azul tiene la longitud de onda más corta de la luz visible).

Aumento es cuánto más grande parece ser una muestra bajo el microscopio de lo que es en la vida real.

Ampliación general = Lente del objetivo x Lente del ocular

Resolución es la capacidad de distinguir entre dos puntos en una imagen, es decir, la cantidad de detalle

  • La resolución de una imagen está limitada por la longitud de onda de la radiación utilizada para ver la muestra.
  • Esto se debe a que cuando los objetos en la muestra son mucho más pequeños que la longitud de onda de la radiación que se está utilizando, no interrumpen las ondas y, por lo tanto, no se detectan.
  • La longitud de onda de la luz es mucho mayor que la longitud de onda de los electrones, por lo que la resolución del microscopio óptico es mucho menor.
  • El uso de un microscopio con un aumento más potente no aumente más esta resolución. Aumentará el tamaño de la imagen, pero los objetos a menos de 200 nm seguirán siendo vistos como un solo punto.

Un nuevo resplandor para la microscopía electrónica

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Imagen anterior Imagen siguiente

La molécula verde brillante conocida como proteína verde fluorescente (GFP) ha revolucionado la biología molecular. Cuando la GFP se une a una proteína particular dentro de una célula, los científicos pueden identificarla y localizarla fácilmente mediante microscopía de fluorescencia. Sin embargo, GFP no se puede utilizar con microscopía electrónica, que ofrece una resolución mucho más alta que la microscopía de fluorescencia.

Los químicos del MIT ahora han diseñado un equivalente de GFP para microscopía electrónica, una etiqueta que permite a los científicos etiquetar y visualizar proteínas con una claridad sin precedentes.

“Con cosas que pueden aparecer con solo unos pocos píxeles de ancho por microscopía de fluorescencia, por ejemplo, una mitocondria, no se puede distinguir ninguna de las características internas. Pero con la microscopía electrónica es muy fácil discernir las intrincadas estructuras internas ", dice Jeff Martell, estudiante graduado de química en el MIT y autor principal de un artículo que describe la nueva etiqueta en la edición en línea del 21 de octubre de Biotecnología de la naturaleza.

La nueva etiqueta podría ayudar a los científicos a identificar la ubicación de muchas proteínas celulares, proporcionando una nueva perspectiva sobre las funciones de esas proteínas, según los investigadores.

Mejorando la naturaleza

Apodada APEX, la nueva etiqueta es similar a las proteínas naturales que se han probado como etiquetas de imágenes para microscopía electrónica. La peroxidasa de rábano picante (HRP) es una etiqueta de uso común, pero funciona solo en unos pocos compartimentos de una célula. Otras etiquetas desarrolladas recientemente funcionan en toda la celda, pero son técnicamente difíciles de usar porque requieren que se ilumine la muestra con luz y que se burbujee oxígeno a través de ella.

Para mejorar estos métodos, los investigadores comenzaron con una proteína similar a la HRP, llamada ascorbato peroxidasa (APX). APX es más versátil que HRP porque puede funcionar dentro del citosol de una célula, en la cavidad principal de una célula.

Tanto la HRP como la APX pertenecen a una clase de enzimas llamadas peroxidasas, que eliminan un electrón y un protón de otras moléculas en un proceso conocido como oxidación. Cada peroxidasa tiene diferentes objetivos, y uno de los principales objetivos de HRP es una molécula llamada DAB, que cuando se oxida se puede visualizar con microscopía electrónica. Los investigadores diseñaron APX genéticamente para que también apunte a DAB.

Para usar esta nueva etiqueta APEX (para "APX diseñado"), los investigadores entregan, en una célula viva, un pequeño anillo de ADN que contiene el gen APEX unido al gen de la proteína que planean obtener. Luego, la célula produce la proteína diana, unida a la proteína APEX.

A continuación, los investigadores deben administrar DAB, que normalmente no se encuentra en las células. Esta entrega tiene lugar durante el proceso de "fijación" o estabilización de las células, que debe realizarse antes de que puedan obtenerse imágenes con microscopía electrónica.

Cuando la proteína APEX oxida el DAB, genera radicales que rápidamente se agrupan en un polímero similar al alquitrán. Ese polímero se puede detectar mediante microscopía electrónica, lo que permite a los investigadores determinar la ubicación de la proteína objetivo.

Una cuestión biológica resuelta

Para demostrar la utilidad de su nueva etiqueta, los investigadores se propusieron resolver una pregunta abierta sobre la ubicación de una proteína del canal de calcio descubierta el año pasado. Dos grupos de investigación identificaron la proteína e informaron que se encuentra dentro de las mitocondrias, pero tenían teorías contradictorias sobre su ubicación y orientación precisas. Usando la nueva técnica de imágenes, el equipo dirigido por el MIT etiquetó la proteína y determinó que está incrustada en la membrana mitocondrial interna y se enfrenta a la parte más interna de las mitocondrias, la matriz mitocondrial.

El equipo también demostró que la nueva etiqueta puede etiquetar proteínas en toda la célula, no solo dentro de las mitocondrias sino también en el núcleo, el retículo endoplásmico y el citosol.

Martell y Alice Ting, profesora asociada de química de Ellen Swallow Richards en el MIT y autora principal de la Biotecnología de la naturaleza papel, inventó la nueva tecnología. Otros autores que ayudaron a probar la etiqueta y explorar aplicaciones biológicas son Mark Ellisman, Thomas Deerinck y Gina Sosinsky de la Universidad de California en San Diego, Yasemin Sancak y Vamsi Mootha de la Facultad de Medicina de Harvard, y Thomas Poulos de la Universidad de California en Irvine. .

En los estudios actuales, los investigadores están trabajando para llenar células enteras, como las neuronas, con su agente de imágenes. Esto permite que ciertas neuronas en una imagen de microscopio electrónico se destaquen, lo que facilita el rastreo de las conexiones que hacen con otras neuronas. Para ese proyecto, los investigadores del MIT están colaborando con Joshua Sanes, profesor de biología molecular y celular en la Universidad de Harvard, quien dice que cree que la nueva tecnología de etiquetado será muy útil.

“Queremos encontrar las conexiones exactas que están haciendo estas células, y APEX es una buena forma de etiquetar células para microscopía electrónica. Podemos etiquetar tipos específicos de células y averiguar cómo encajan en los circuitos neuronales ”, dice Sanes.

Ting y Martell han solicitado una patente sobre su tecnología de imágenes y ahora están trabajando para hacer que la molécula APEX sea más estable y más capaz de unirse al hemo (un átomo de hierro incrustado en un compuesto orgánico), que es necesario para que funcione correctamente.


Un microscopio electrónico que ganó & # x27t destruirá las células vivas

Todos hemos visto esas imágenes aterradoras de insectos de aspecto monstruoso capturadas por microscopios electrónicos de alta resolución, como el ácaro del polvo doméstico en la imagen de arriba. Sin embargo, una cosa de la que puede que no seas consciente es que todos los bichos espeluznantes en esas imágenes están muertos. Esto se debe a que el haz de partículas de electrones que se usa para iluminar una muestra también destruye las muestras, lo que significa que los microscopios electrónicos no se pueden usar para obtener imágenes de células vivas. Los ingenieros eléctricos del Instituto de Tecnología de Massachusetts (MIT) han propuesto un nuevo esquema que puede superar esta limitación crítica mediante el uso de una técnica de medición mecánica cuántica que permite a los electrones detectar objetos de forma remota sin llegar a golpear los objetos de la imagen, evitando así daños.

Los microscopios electrónicos tradicionales utilizan un haz de partículas de electrones, en lugar de luz, para obtener imágenes de las muestras, lo que ofrece una resolución extremadamente alta, de hasta 0,2 a 10 nanómetros, que es de 10 a 10,000 veces mayor que un microscopio tradicional. Con el nuevo microscopio cuántico propuesto por los investigadores del MIT, los electrones no golpearían directamente el objeto que se está fotografiando, sino que fluirían alrededor de uno o dos anillos, dispuestos uno encima del otro.

Estos anillos estarían lo suficientemente cerca como para que el electrón pudiera saltar fácilmente entre ellos, sin embargo, si se colocara un objeto (como una célula) entre los anillos, evitaría que el electrón salte y el electrón quedaría atrapado en un anillo. . Esta configuración escanearía un "píxel" de la muestra a la vez, poniéndolos todos juntos para crear la imagen completa. Siempre que el electrón quede atrapado, el sistema sabrá que hay un píxel oscuro en ese lugar.

El profesor asistente Mehmet Fatih Yanik, autor principal del artículo, dice que espera que el trabajo "probablemente encienda los esfuerzos experimentales en todo el mundo para su realización, con quizás el primer prototipo apareciendo en cinco años más o menos".

Antes de eso, será necesario superar los desafíos técnicos, como evitar que el electrón cargado interactúe con otros metales en el microscopio. Pero Yanik cree que eventualmente tal microscopio podría lograr una resolución de un solo nanómetro, lo que permitiría a los científicos ver moléculas como enzimas y ácidos nucleicos dentro de las células vivas.

Un microscopio electrónico no invasivo podría arrojar luz sobre cuestiones fundamentales sobre la vida y la materia, permitiendo a los investigadores observar moléculas dentro de una célula viva sin molestarlas. Si tienen éxito, estos microscopios superarían lo que el premio Nobel Dennis Gabor concluyó en 1956 era la limitación fundamental de la microscopía electrónica: "La destrucción del objeto por el agente explorador".

La investigación del equipo del MIT se detalla en el documento, "Microscopía electrónica no destructiva y mediciones cuánticas sin interacción", que aparece en la edición de octubre de la revista Revisión física A - Comunicaciones rápidas.


Enfoque multidisciplinario

Estos avances han sido el resultado de contribuciones de científicos en muchos campos diferentes. Los físicos han proporcionado gran parte de la tecnología, como los detectores de electrones avanzados que aumentaron la velocidad y la sensibilidad de los dispositivos crio-EM modernos. Los químicos han desarrollado sondas fluorescentes más brillantes que iluminan los objetivos durante más tiempo. Los estadísticos y los informáticos han mejorado las técnicas de procesamiento y análisis de imágenes. "La aceleración en la obtención de imágenes se ha producido a través de esta increíble sinergia", dice Jennifer Lippincott-Schwartz, bióloga celular del campus de investigación Janelia del Instituto Médico Howard Hughes en Ashburn, Virginia, que ayudó a sentar las bases para el desarrollo de la superresolución microscopía con trabajo durante la década de 1990 sobre el uso de proteínas fluorescentes verdes para visualizar las vías de tráfico celular en células vivas 2.

Se han realizado muchos avances utilizando estas herramientas de microscopía. Lippincott-Schwartz y sus colegas, por ejemplo, utilizaron una forma de microscopía de fluorescencia de hoja de luz con microscopía confocal para capturar imágenes en color 3D de las interacciones entre diferentes tipos de orgánulos. "Pudimos trazar un mapa de las relaciones entre seis tipos de orgánulos, qué tan rápido se movían y los contactos que hacían entre sí", dice Lippincott-Schwartz, cuyo artículo 3 se publicó en Naturaleza en 2017. "Eso es importante si desea comprender la comunicación cruzada entre orgánulos, que es uno de los grandes intereses entre los biólogos celulares en este momento".

Jennifer Lippincott-Schwartz demuestra un microscopio capaz de obtener imágenes de superresolución. Crédito: Matt Staley

La creciente disponibilidad de estas técnicas avanzadas presenta oportunidades para los biólogos celulares que inician su carrera. Lo más obvio es que aumenta la cantidad de procesos que los biólogos celulares pueden investigar. “Estas técnicas abren enormes perspectivas para los tipos de preguntas que podemos responder”, dice Lippincott-Schwartz. El biólogo estructural David Barford en el Laboratorio de Biología Molecular MRC en Cambridge, Reino Unido, ha utilizado crio-EM para avanzar en la comprensión de algunos de los mecanismos celulares involucrados en la mitosis 4, un tipo de división celular que da como resultado la formación de dos células hijas con los mismos cromosomas que la célula madre. "Para los científicos académicos, la capacidad de determinar estructuras a resolución atómica con crioscopía electrónica puede ser muy importante en el diseño de nuevos experimentos y la prueba de hipótesis biológicas", dice.

Barford agrega que los beneficios potenciales para los investigadores de carrera temprana de adquirir una comprensión profunda de las últimas técnicas de imagen podrían extenderse más allá de las preguntas de investigación inmediata que buscan responder. “Las compañías farmacéuticas se están volviendo muy interesadas en la crio-microscopía electrónica como un medio para determinar las estructuras de las proteínas y los objetivos de los medicamentos, por lo que pasar a ella podría ser una muy buena elección de carrera”, dice. Barford también cree que estas técnicas se volverán más importantes y superarán a las técnicas más antiguas utilizadas por los biólogos. "Probablemente sustituirá a la cristalografía en el mercado laboral".

Es imposible dominar el uso de todas o incluso muchas de las últimas herramientas de imágenes. Los biólogos celulares que inician su carrera y que buscan utilizarlos deben decidir si especializarse en una técnica en particular o identificar colaboradores que puedan hacerlo por ellos (ver "Reuniones de mentes" para algunas de las conferencias populares en biología celular). Ridley, que estudia el papel de la migración celular en la progresión del cáncer, aconseja a los doctores que aprovechen las oportunidades disponibles para conocer las diferentes técnicas. “Recomendaría a cualquier persona que esté haciendo un programa de doctorado con la opción de realizar rotaciones en diferentes laboratorios y adquirir experiencia en diferentes áreas de imágenes para hacerlo”, dice ella. "Incluso si no se convierte en un experto en microscopía electrónica, por ejemplo, trabajar en esa área durante un par de meses le permitirá comprender lo que puede y no puede hacer". Barford agrega que los investigadores que dejan que los colaboradores hagan sus imágenes por ellos corren el riesgo de quedarse atrás de otras maneras. "Si te conviertes en un usuario en lugar de un desarrollador, limita tu potencial futuro para contribuir al campo mediante el desarrollo y el avance de la tecnología".

Reuniones de mentes

Delegados en la reunión conjunta de la Sociedad Estadounidense de Biología Celular y la Organización Europea de Biología Molecular en 2018. Crédito: Paul Sakuma Photography

Los simposios y conferencias son buenos para obtener actualizaciones y descripciones generales de un campo.

Los investigadores a menudo tienen que elegir entre asistir a reuniones amplias o especializadas. Para aquellos que buscan una descripción general del estado del campo, la reunión conjunta de la Sociedad Estadounidense de Biología Celular y la Organización Europea de Biología Molecular es, con mucho, la reunión anual más grande de biólogos celulares del mundo. Se espera que unas 6.000 personas asistan a la de este año, en Washington DC, del 7 al 11 de diciembre. Los temas que se cubrirán serán de amplio alcance, incluidos temas emergentes como organismos modelo no convencionales, modelado computacional y biología sintética.

Bruce Stillman, presidente y director ejecutivo de Cold Spring Harbor Laboratory en Nueva York, dará la conferencia principal sobre su trabajo sobre la duplicación de cromosomas en las células. Habrá una variedad de simposios, talleres, sesiones de carteles y sesiones de interés especial. El día antes de la reunión principal, habrá un día completo de sesiones sobre carreras y desarrollo profesional para académicos, y un mini curso de biotecnología de un día, en el que los asistentes podrán aprender cómo los descubrimientos científicos se convierten en empresas de biociencia. Otras sesiones cubrirán carreras en defensa de la ciencia sin fines de lucro, políticas científicas, divulgación, gestión de infraestructura científica e investigación basada en bancos en la industria.

Hay muchas otras opciones para los investigadores que desean profundizar en una rama particular de la disciplina. Un simposio llamado Ver para creer, por ejemplo, reúne a los desarrolladores de técnicas de imagen de vanguardia con quienes las aplican en el laboratorio. Esta reunión atrajo a unos 400 participantes cuando se celebró por última vez, en el Laboratorio Europeo de Biología Molecular en Heidelberg, Alemania, en octubre de este año. Presentó sesiones sobre las últimas herramientas y métodos que transforman las habilidades de los investigadores para visualizar proteínas, complejos de proteínas, orgánulos, células, tejidos, órganos y organismos completos.

Uno de los atractivos de las imágenes para Lippincott-Schwartz es su pureza como método empírico para adquirir conocimiento. “Cuando se toman imágenes, primero se observa, luego se generan hipótesis y luego se diseñan enfoques para probarlas. Es la vía perfecta para cumplir con el método científico ". Agrega que la proliferación de herramientas avanzadas ha hecho que la microscopía sea aún más atractiva como foco de atención para los biólogos celulares. “Puede hacer que la imagen sea una dirección muy creativa”, dice.

Naturaleza 575, S91-S94 (2019)

Este artículo es parte de Nature Career Guide: Cell biology, un suplemento editorialmente independiente. Los anunciantes no tienen influencia sobre el contenido.


La agrupación y la oligomerización son procesos medibles

Un objetivo importante en biología celular es monitorear el flujo y reflujo de los complejos moleculares que sintonizan las respuestas generales de la célula. Por ejemplo, ¿cuál es la vida útil de los complejos de proteínas formados durante la señalización y dónde ocurren estas interacciones proteicas productivas? Las técnicas discutidas hasta ahora son poderosas en su capacidad para obtener información dinámica de moléculas individuales y relacionarlas proteína individual comportamiento a su entorno. Técnicas que miden el comportamiento de un población de moléculas a la vez también se puede utilizar para determinar la ubicación y la escala de tiempo de las interacciones de las proteínas. Tales técnicas incluyen métodos de correlación de fluorescencia, FRET y FRAP (Cuadro 1).

Oligomerización de proteínas

Como se introdujo anteriormente, FRET es un enfoque utilizado para detectar la proximidad entre proteínas. Esta técnica ha sido aplicada con éxito por muchos investigadores para determinar cambios dinámicos en las interacciones proteína-proteína. En un ejemplo reciente, Liou y sus colegas combinaron información de FRET y FRAP tradicionales para examinar la oligomerización y translocación de STIM1, un residente del retículo endoplásmico (RE) cuya función es detectar las reservas de calcio agotadas y estimular la entrada de calcio operada por las tiendas [18]. Después de desencadenar la liberación de Ca 2+ de las reservas de ER, los autores observaron un marcado aumento en la transferencia de energía entre CFP- y YFP-STIM1, consistente con la agregación de proteínas. Las imágenes de células vivas también revelaron que STIM1 se trasloca dentro del RE para formar grupos cerca de la membrana plasmática (PM). Esta translocación de ER a PM se limitó aparentemente a STIM1 disponible localmente, basándose en la recuperación muy lenta de YFP-STIM1 después del fotoblanqueo. Juntos, los datos sugieren que la señalización se localiza espacialmente en una subpoblación de STIM1 ubicada dentro de una región de

2 & # x000b5m cerca de las supuestas uniones ER-PM.

Robia y sus colegas han modificado recientemente el enfoque FRET para determinar el intercambio de proteínas dentro de un oligómero [19]. La recuperación de transferencia de F & # x000f6rster (FTR) es una combinación inteligente de FRET y FRAP en la que el aceptor se fotoblanquea y la recuperación de la transferencia de energía (en lugar de solo la intensidad) en la región blanqueada se controla a lo largo del tiempo. A partir de la cinética de la recuperación de la transferencia de energía, se puede determinar la tasa de intercambio entre moléculas blanqueadas y no blanqueadas en un complejo. Los autores utilizaron esta técnica con proteínas de fusión YFP y CFP para determinar que el fosfolambán se intercambia rápidamente en complejos reguladores con el retículo sarcoplásmico Ca 2+ -ATPasa (SERCA) pero forma homooligómeros relativamente estables.

En el caso de las homointeracciones, la necesidad de etiquetado con dos fluoróforos diferentes no es ideal. Dado que los mismos principios que gobiernan FRET entre fluoróforos donantes y aceptores químicamente diferentes también se aplican a la transferencia de energía entre fluoróforos similares (es decir, GFP a GFP), la aplicación de homo-FRET a la obtención de imágenes de células vivas hace posible cuantificar homo-clústeres utilizando un solo clase de etiqueta fluorescente [20, 21]. Las imágenes de anisotropía de fluorescencia en estado estacionario y resuelta en el tiempo permiten una medición sensible de homo-FRET, basada en la rápida despolarización de la fluorescencia. Es importante destacar que homo-FRET puede informar número de fluoróforos en un complejo o grupo. Este enfoque fue pionero en Sharma et al, que se centró en la agrupación de proteínas de anclaje de GPI (GPI-AP) [22]. Este estudio mostró que los GPI-AP se encuentran tanto como monómeros como a nanoescala (& # x0003c5nm), grupos sensibles al colesterol en la membrana plasmática. Más recientemente, Bader et al[23] empleó medidas de anisotropía resueltas en el tiempo en un microscopio confocal especialmente equipado para resolver espacialmente las diferencias en el estado de agregación de proteínas en el paisaje celular (Figura 2). Con este instrumento, pudieron distinguir que los GPI-AP forman pequeños grupos en la membrana plasmática, pero siguen siendo monoméricos cuando residen en orgánulos internos.

(a) Imágenes de intensidad, (b) anisotropía (r) y (c) tamaño de grupo (N) de células NIH3T3 que expresan GPI-GFP. Las imágenes de Homo-FRET revelan que GPI-GFP se encuentra como pequeños grupos en volantes en la membrana plasmática, pero permanece monomérico en el Golgi. Imágenes cortesía de Arjen Bader y Hans Gerritsen y reproducidas con permiso de Bader et al[23].

Comportamiento inducido por ligando

Cuando se utiliza para imágenes multicolores, SPT también puede informar interacciones proteína-proteína [5, 24, 25]. Mientras estaba en el grupo Jovin, Lidke conjugó directamente EGF con QD para facilitar el seguimiento de EGFR / erbB1 unido al ligando [26]. Las sondas QD brillantes y fotoestables hicieron posible observar directamente el proceso de internalización del receptor y, mediante el uso de células transfectadas de manera estable con erbB2-YFP o erbB3-mCitrine, cuantificar la diferencia en la co-internalización de heterodímeros. En un estudio posterior, el uso de EGF-QD permitió la detección del transporte retrógrado rápido de erbB1 por los filopodios celulares antes de la endocitosis [24]. Al combinar el seguimiento de QD único y FRAP de GFP-actina, se demostró que el transporte retrógrado está acoplado a la tasa de flujo de actina y no depende de una proteína motora. Este estudio fue uno de los primeros en explotar las capacidades del seguimiento QD único de dos colores, estableciendo la estabilidad de los homodímeros erbB1 unidos a EGF-QD525 y EGF-QD605 y demostrando que la dimerización era un requisito previo para el transporte retrógrado.

Mapeo de la difusión y agregación de proteínas

Otra familia de técnicas de rápido desarrollo implica el uso de métodos de correlación de fluorescencia. FCS se utilizó por primera vez para medir las interacciones de unión en solución [27]. Los biólogos celulares adaptaron rápidamente esta técnica para medir la difusión de proteínas y el estado de agregación en células vivas. Como ejemplos, se han utilizado métodos de FCS para determinar el estado de agregación de las proteínas de membrana [28], las interacciones entre las proteínas de membrana y los socios de señalización descendentes [29] y la estequiometría de los complejos de proteínas [30]. Una limitación inherente de FCS es que las mediciones se registran en una sola posición en la celda, que se define al comienzo del experimento. Las técnicas de correlación de imágenes superan esta limitación proporcionando movilidad y datos de estado de agregación junto con información espacial, generando mapas de la dinámica de las proteínas y las interacciones a través de una célula [31]. Es importante destacar que estos nuevos métodos se pueden realizar utilizando microscopios de escaneo láser confocal estándar o TIRF que están ampliamente disponibles en las instalaciones académicas. Los métodos de correlación de imágenes se han aplicado a una amplia variedad de problemas biológicos, como la medición de las interacciones actina-integrina mediante el mapeo de la velocidad [32] y la determinación del estado de agregación de la integrina en la organización de la adhesión [33]. Se han realizado mejoras en la cuantificación, como nuevos métodos analíticos para calcular la fracción de proteínas que interactúan a partir de datos ICCS de dos colores [34]. El grupo Wiseman pone a disposición programas para analizar datos de muchas técnicas de ICS (http://wiseman-group.mcgill.ca/).

Recientemente, los análisis ccRICS y ccN & # x00026B (Cuadro 1) han surgido como nuevos métodos prometedores. Ambos se basan en la fluorescencia de correlación cruzada en pares de imágenes de dos colores adquiridos mediante microscopía confocal de barrido láser. Digman et al han utilizado ccN & # x00026B para evaluar el intercambio de quinasa de adhesión focal (FAK), paxilina y vinculina dentro de los complejos de adhesión de fibroblastos [35]. Sobre la base de la amplitud de las fluctuaciones correlacionadas, fue posible determinar la estequiometría de proteínas en grandes agregados que se disociaron de las adherencias a medida que se desmontaban. Este grupo también ha utilizado ccRICS para crear mapas de "brillo" localizados, que reflejan la dinámica de estas proteínas a medida que entran o salen de las estructuras de adhesión [36]. Como observación final de esta sección, observamos que los intentos de capturar la dinámica de FAK y vinculina vinculante a Pax por métodos FRET no tuvieron éxito [36]. Claramente, la elección de la técnica analítica para medir interacciones proteína-proteína específicas debe ser a veces un proceso de prueba y error.


Discusión

Las imágenes de error topográfico y de fuerza máxima (Figuras 5B, 6A y 6B) muestran una resolución de imagen similar a la obtenida en el modo de golpeteo; los otros canales muestran un contraste interesante en la subestructura de la celda. El canal de módulo DMT [Derjaguin de referencia 48] muestra que las células son varios órdenes de magnitud más suaves que su sustrato, y la diferencia de rigidez entre los bordes y las partes centrales de las células también es muy contrastada (Figuras 5C y 6C). El módulo de Young promedio está de acuerdo con estudios previos sobre otros tipos de células [Referencia Cai 33]. Las células también parecen ser fácilmente deformables en su centro pero no tanto en sus bordes (Figuras 5D y 6D). El sustrato no debería jugar un papel significativo en tales diferencias porque incluso en sus partes más delgadas, las células tienen al menos 50 nm de altura y, al controlar la fuerza máxima, la profundidad de indentación no debería exceder una décima parte de nanómetros. La disipación, que refleja la energía disipada entre la punta y la muestra durante cada ciclo de roscado, está fuertemente relacionada con la topografía. Algunos cambios locales de contraste son visibles en las células, pero los contrastes más llamativos se observan en los bordes, lo que tiene sentido porque en este lugar, el área de contacto entre la sonda y la muestra aumenta fuertemente (Figuras 5E y 6E). La Figura 7 muestra que las células fijas y vivas exhiben diferencias dramáticas en topografía, elasticidad y deformabilidad. A modo de comparación, experimentos similares llevados a cabo en modo tapping probablemente hubieran revelado un alto contraste de fase entre las células y el soporte. However, such images would have been a contribution of several properties, whereas Peak Force Tapping mode offers the possibility of distinguishing between these different factors and quantifying them. This type of easy, quantitative approach offers new perspectives in many fields of biology, especially cancer research and physiology.


5 Important Types of Microscopes used in Biology (With Diagram)

Some of the most important types of microscopes that used in biology are as follows:

1. Simple microscope 2. Compound microscope 3. Electron microscopes 4. Phase-Contrast microscope 5. Interference microscope.

The simple dissection microscope to advanced electron microscopes finds application in studies of living organisms.

Microscope as the name suggests are instruments that help to enlarge minute (micro = very small) organisms or their parts. A microscope not only presents a magnified view of the object but also ‘resolves’ it better.

Resolution is the feature which makes it possible to differentiate between two points present close together in the objects being viewed. The first microscope was constructed by Anton Van Leeuwenhoek (1632-1723). This, microscope consisted of a single biconvex lens fitted in a small window of a “board” and the object was viewed through it. This was a simple microscope.

After this compound microscope, were developed using combinations of two lenses. Improvements continued, newer and newer’ microscopes were designed and are still being improved.

Different types of microscopes being used in biological studies are the following:

It is the ability of a microscope to show two closely lying points as two distinct points.

It is the ratio of the size of the image to that of the object:

4. Phase-Contrast microscope

5. Interference microscope

1. Simple Microscopes:

Simple/ Dissecting Microscope:

As shown in the figure 6.1, dissecting microscope consists of a biconvex lens which is moved up and down by an adjustment screw to bring the object in sharp focus. The object is placed on the platform and light is focused with the help of a concave mirror fitted below.

In simple microscope, convex lens of short focal length is used to see magnified image of a small object. The object is placed between the optical centre and the focus of a convex lens, its image is virtual, erect and magnified and on the same side as the object. The position of the object is so adjusted that the image is formed at the least distance of distinct vision (D).

Magnifying power (M) of a simple microscope is the ratio of the angle subtended by the image at the eye to the angle subtended by the object seen directly, when both lie at the least distance of distinct vision or the near point.

Where D is the least distance of distinct vision and f is the focal length of the lens.

2. A Compound Microscope:

A compound microscope consists of two set of convex lenses. A lens of short aperture and short focal length facing the object is called objective. Another set of lens of relatively moderate focal length and large aperture facing the eye is called the eye piece. The objective and the eye piece are placed coaxially at the two end of a tube (Fig. 6.2).

The object is placed between the centre of curvature and focus of the objective – it forms real, inverted and magnified image on the other side of the objective. This image acts as an object for the eye piece which then acts as a simple microscope to produce virtual, erect and magnified image.

Magnifying power (M) of a compound microscope will be

Where f0and fmi are focal length of objective and eye piece respectively, L is the length a the microscope tube and D is the least distance of distinct vision.

3. The Electron Microscope:

The organelles of the cell became known after the electron microscope was invented. The electron microscope was developed in 1932 by M. Knoll and Ruska in Germany. It consist of a source of supplying, a beam of electron of uniform velocity, a condenser lens for concentrating the electron on the specimen, a specimen stage for displacing the specimen which transmits the electron beam, an objective lens, a projector lens and a fluorescent screen on which final image is observed (fig. 6.3).

For permanent record of the image, the fluorescent screen is replaced by photographic film. This microscope utilizes a stream of high speed electrons which are deflected by an electromagnetic field in the same way as a beam of light is reflected when it crosses a glass lens. There are two types of electron microscope.

(a) Transmission electron microscope (TEM):

This is used to observe fine structure of cells. Ultra thin sections of the object are prepared and they are stained with a heavy metal (gold or palladium) to make certain part dense, and inserted in the vacuum chamber of the microscope. A 100, 00 volt electron beam is focused on the section and manipulated prepared from the image may be enlarged with enough resolution to achieve a total magnification of over 20 million times.

(b) Scanning electron microscope (SEM):

It is used to study the surfaces of the cell and organisms. In this microscope, the image is formed by electrons reflected back from the object. The image formed by this microscope has a remarkable three dimensional appearance. Typically magnification of scanning electron microscope is around 20,000 times.

4. Phase-Contrast microscope:

This is used to study the behavior of living cells, observe the nuclear and cytoplasmic changes taking place during mitosis and the effect of different chemicals inside the living cells. By using the phase-contrast microscope, an image of strong contrast of the object is obtained (fig. 6.4).

It is a contrast-enhancing optical technique that can be utilized to produce high-contrast images of transparent specimens, such as living cells (usually in culture), microorganisms, thin tissue slices, fibers, glass fragments, and sub-cellular particles (including nuclei and other organelles). In effect, the phase contrast technique employs an optical mechanism to translate minute variations in phase into corresponding changes in amplitude, which can be visualized as differences in image contrast.

One of the major advantages of phase contrast microscopy is that living cells can be examined in their natural state without previously being killed, fixed, and stained. As a result, the dynamics of ongoing biological processes can be observed and recorded in high contrast with sharp clarity of minute specimen detail.

5. Interference microscope:

Interference microscope is used for quantitative studies of macromolecules of the cell components, for example it is used for determination of lipid, nucleic acids and protein contents of the cell. Interferometry is a traditional technique in which a pattern of bright and dark lines (fringes) result from an optical path difference between a reference and a sample beam.

The incoming light is split inside an interferometer, one beam going to an internal reference surface and the other to the sample. After reflection, the beams recombine inside the interferometer, undergoing constructive and destructive interference and producing the light and dark fringe pattern.

A precision translation stage and a CCD camera together generate a 3D interferogram of the object that is stored in the computer memory. This 3D interferogram of the object is then transformed by frequency domain analysis into a quantitative 3D image providing surface structure analysis (fig. 6.5).


Entire Fruit Fly Brain Imaged with Electron Microscopy

Ashley Yeager
May 31, 2017

A database of electron microscopy images reveals the connections of the entire female fruit fly brain. In this image, types of Kenyon cells (KC) in the mushroom body main calyx are labeled by color: &alpha&betac-KCs are green, &alpha&betas-KCs are yellowish brown, and gamma-KCs are blue. The white arrows point to visible presynaptic release sites. ZHENG ET AL. 2017 A 21-million-image dataset of the female fruit fly brain is offering an unprecedented view of the cells and their connections that underlie the animal&rsquos behavior. The full-brain survey, taken by electron microscopy, allowed researchers to describe all of the neural inputs into a region of the fly&rsquos brain linked to learning, examine how tightly neurons are clustered in the area, and identify a new cell type.

&ldquoThis is the biggest whole brain imaged at high resolution,&rdquo Davi Bock of the Janelia Research Campus in Ashburn, VA, tells El Científico. He and.

Past studies have produced electron microscopy images with resolution high enough to reveal the wiring of the entire brain of smaller organisms, such as a nematode or a fruit fly larva, or sections from larger animals, including parts of the fly brain or a cat’s thalamus. Imaging the complete fruit fly brain “is nearly two orders of magnitude larger than the next-largest complete brain imaged at sufficient resolution to trace synaptic connectivity,” Bock and colleagues wrote in their report.

The fruit fly brain has a three-dimensional volume of 8 x 10 7 cubic micrometers. Imaging it at nanometer resolution is “like studying the sky with a straw,” Bock says. “You have to move the straw around to get the whole picture.”

He and colleagues used a specialized microscope called a TEMCA2, which was raised up higher off of the floor so it projected a larger image. The researchers then set up an array of cameras to capture the images projected from the microscope. With more cameras and robotics, which automated sample handling and the image acquisition process, the system moved through slices of fly brain much more quickly than previous set-ups.

Ian Meinertzhagen of Dalhousie University in Halifax, Nova Scotia, wrote in an email to El Científico that this work “fulfills the long-held ambition to catalogue the comprehensive networks of identified neurons in the fruit fly’s brain.” It is still “a very major task [but] it is comprehensive, because no cell can hide out in the brain undetected, as has always been the case in previous approaches,” he said. “It is enabling, providing the basis to analyze the function of identified neurons within that network, and in particular enabling us to identify the contribution each neuron makes to the fly’s behavior.”

In the paper, the team used a subset of the images to describe the synaptic connections of the fly’s mushroom body, an area known for its role in learning. By studying the complete set of olfactory inputs to the mushroom body they identified a new type of neuronal cell. Unlike other olfactory neurons, this new cell type, called MB-CP2, receives inputs from other regions of the fly brain, including compartments in the protocerebrum, which harbors projections from the eyes and other organs.

Ryuta Mizutani of Tokai University in Tokyo explains that the MB-CP2 neurons may have been missed in previous studies because, in light microscopy, where the mushroom body has been studied extensively, only a certain group of neurons are labeled and visualized using fluorescent probes. In the new study, the fly brain was stained completely with uranium and lead, and the authors’ analysis seems to hit the missed neurons, he says, although more studies are needed to determine their function.

Bock’s group also found that neurons linked to the fly’s sense of smell were clustered more tightly in the calyx of the mushroom body than observed in previous imaging projects. This raises questions about whether these neurons cluster differently in individual flies, the team suggests.

The next step, Mizutani says, is the complete analysis of the whole fly brain. “If we can accelerate this painstaking task with a computer algorithm, such as automated intelligence, the complete analysis becomes realistic,” he said. The promise, he noted, is applying this study to mammalian brains, especially to humans. “Our brain is huge compared to the fly brain,” Mizutani said. “The application to a larger brain must be a big challenge.”

Z. Zheng et al., “A complete electron microscopy volume of the brain of adult Drosophila melanogaster,” bioRxiv, doi:10.1101/140905, 2017.


A new ‘DNA microscope’ peers deep inside living cells

Y ou could probably find a few biologists who are diehard protein partisans, and others who love lipids, but if a genie granted them one wish for what they could see inside living cells, most would pick DNA.

Joshua Weinstein of the Broad Institute of MIT and Harvard spent the last six years almost singlehandedly working to fulfill that wish, and on Thursday he unveiled the result: a “DNA microscope” that shows not only the locations of DNA (and its cousin, RNA) in a cell but also the precise nucleotide-by-nucleotide identity of each molecule.

Each dot represents a cell, with colors indicating what DNA sequences they contain. Broad Institute of MIT and Harvard

The innovation, described in Cell, uses customized sequences of DNA about 30 nucleotides long, deposited into cells, to tag every DNA and RNA molecule in them. The tags latch onto the genetic material and then make hundreds of copies of the molecules. The copies collide and undergo chemical reactions, producing new paired nucleotide sequences. A DNA sequencer decodes these sequences. Finally, a computer algorithm reconstructs the molecules’ original locations in the cells along with its nucleotide sequence.

Electron microscopes, too, can see DNA in cells, and DNA sequencers can determine the A’s, T’s, C’s, and G’s (nucleotides) it’s made of. But the DNA microscope is the first instrument that simultaneously reveals both — where an RNA or DNA molecule is, down to individual cells, and what its sequence is — all without specialized equipment. (DNA sequencers have become so common in biology labs they don’t count as “specialized” anymore.)

Optical imaging of cells, with fluorescent labels. Broad Institute of MIT and Harvard

The DNA microscope can see other molecules inside cells thanks to the fortuitous fact that DNA can label, or attach to, those other molecules. DNA microscopy can therefore determine the location and identity of antibodies, receptors, molecules on a tumor cell that immune cells attack, and more. Weinstein has so far used it to image human cancer cell lines and plans to apply the technology to tumors and the immune cells that infiltrate them, he said, which might one day guide immunotherapy.

DNA microscope image of the same cells, showing genetic material. Broad Institute of MIT and Harvard

Almost unheard of in this era of collaborations that are often larger than a soccer team, Weinstein, a postdoctoral fellow, worked virtually alone at the lab bench, advised by the Broad’s Aviv Regev and Feng Zhang. The Broad has applied for a patent on the invention.



Comentarios:

  1. Abdul-Nasser

    Qué pregunta tan elegante

  2. Maldue

    ¿Piensas en una frase tan singular?

  3. Zelotes

    No parezcas un experto :)



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